作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳，其特征在于含有：(1)角鲨烯或角鲨烷；(2)乳化剂；和(3)注射用辅料；所述的乳化剂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、油酸、油酸钠中的一种或其以任何比例组成的混合物。本发明也公开所述水包油型亚微乳的制备方法。本发明的水包油型亚微乳佐剂能减少疫苗用量，降低不良反应，且可经受热压灭菌，在2-8℃或室温下均能长期保存，安全性与稳定性优于现有的O/W型亚微乳佐剂。
【专利说明】作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳及其制备方法。
【背景技术】
[0002]佐剂是指与抗原同时或预先使用，本身并无抗原性，但能非特异性增强抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，从而增强免疫应答的物质。1925年，Ramon首次对此进行了系统研究，证实除抗原本身外，疫苗中加入的各种成分也是引起免疫应答的重要因素，发现金属盐类、淀粉、油脂、维生素等均能增强人体对白喉类毒素的免疫应答。
[0003]佐剂的作用机理尚未完全阐明，一般认为主要通过以下机制发挥作用:(1)靶向性。通过使抗原靶向至淋巴细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞(APC)，提高APC对抗原的捕获能力；(2)缓释性。通过“贮库”效应缓慢释放抗原，使APC对抗原充分加工处理形成抗原肽-MHC分子复合物，免疫效应持久。
[0004]长期以来，传统疫苗由于其免疫原性较强，佐剂的研究和应用局限于较小的范围，如吸附白喉疫苗、吸附百日咳疫苗、吸附破伤风疫苗。随着现代生物技术的发展，DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等新型疫苗的研究取得了长足发展。新型疫苗具有生产成本低、安全性高、特异性强等优点，但缺点是免疫原性普遍较弱，导致机体产生的免疫应答水平较低。因此，需要加入适当的佐剂才能提高对机体的免疫保护水平。目前在欧盟、加拿大、澳大利亚等国家与地区，疫苗佐剂已被广泛使用，通过佐剂提高疫苗的免疫原性已成为疫苗开发的一个关键领域。`
[0005]目前，应用最广泛的佐剂仍然是铝佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝等。自1926年Glenny首次使用铝盐粘附白喉类毒素至今，经过几十年的使用，虽然铝佐剂的有效性和安全性得到了人们的公认，但铝佐剂也有许多不足之处。如主要诱导产生体液免疫应答，诱导细胞免疫应答的能力较弱，抗体以IgGl型为主。不同批次之间产品差异较大，质量难以控制。会引起局部不良反应，形成肉芽肿，甚至发生局部无菌性脓肿。
[0006]其它已经批准上市的佐剂中，MF59和AS03均为水包油型(0/W型)亚微乳，AS04则由氢氧化招和 3-0-脱酸单憐酸类脂A (3-0-deacylated monophosphoryl lipid A, 3D-MPL)组成。此外，尚有AF03和W805EC两种0/W型亚微乳佐剂处于临床试验中。意大利于1997年率先批准含MF59佐剂的流感亚单位疫苗复立达(Fluad?)上市，该佐剂能同时刺激产生体液免疫应答与细胞免疫应答，从而提高对65岁以上老年人的免疫保护水平。2009年欧盟批准含AS03佐剂的的HlNl疫苗Paildemrix?上市，含AS04佐剂的人乳头瘤状病毒(HPV)疫苗Cervarix?也于当年在美国上市。
[0007]专利文献TO9014837、EP0399843A2、US6299884B1、US6451325B1、US20090191226A2公开了 MF59的处方、制备方法及其用途。该佐剂含4.0%~5.0 %角鲨烯、0.5%吐温80、0.5%司盘85，平均粒径约为160nm。处方中所含的脂溶性表面活性剂司盘85和水溶性表面活性吐温80，可使乳化剂的HLB值调节至适当水平。但MF59只能采用过滤除菌，如果采用终端热压灭菌，则会导致亚微乳分层，因而整个生产过程对无菌操作要求苛刻。此外，吐 温80具有溶血作用，会导致组胺释放，容易引起过敏反应。
[0008]专利文献US2007141078AU US2010189741A1、US2010183667A1 公开了 AS03 的处 方、制备方法及其用途。单个剂量的AS03含角鲨烯10. 68mg、DL-a -生育酚11. 86mg,吐温 804. 85mg，平均粒径为150?155nm。2009?2010年甲型HINr流行期间，欧洲多个国家报告 Pandemrix?疫苗接种者出现神经系统不良反应，主要表现为嗜睡和睡眠过度。根据芬兰 国家健康与福利研究所公布的一份调查报告显示，4?19岁青少年在接种了Pandemi-k? 疫苗后患嗜睡症的风险比同年龄组未接种疫苗的青少年高出9倍。嗜睡症是一种睡眠失调 现象，患者会感到极端疲倦，昏昏欲睡，往往会在毫无预警的情况下睡着，甚至是在活动中 途突然入睡。
[0009]专利文献US2007014805A1、US2007191314A1、EP2080522A1 公开了 AF03 的处方 及其制备方法。该佐剂含2. 5%角鲨烯、约0. 48%鲸蜡硬脂醇聚醚-12化6丨6&代访-12)、 约0. 37%司盘80，此外尚含一种Toll样蛋白受体4(TLR-4)激动剂，其中90%的乳滴粒径 (200nm。其制备方法是先制备成W/0型亚微乳，然后加热至50?65°C经历相转变，冷却后 而得0/W型亚微乳。制备工艺复杂，质量较难控制。此外，所含的表面活性剂Ceteareth-12 具有一定毒性，一般仅用于局部外用制剂中。
[0010]专利文献US2009304799A1、US2012003277A1公开了 W8(I5EC的处方、制备方法及其 用途。该佐剂含64%大豆油、8%乙醇、5%吐温80、1 %十六烷基氯化吡啶（CPC)，平均粒径 约为400nm。由于处方中乙醇和吐温80含量较高，不适于注射给药，目前仅局限于作为鼻粘 膜免疫疫苗的佐剂。
[0011]国内现有如下亚微乳佐剂专利：
[0012]专利文献CN201010247976. 0公开了一种含角鲨烯、聚醚、聚氧乙烯蓖麻油的亚微
乳佐剂，但聚氧乙烯蓖麻油在注射给药中具有较大毒性，易引起变态反应、中毒性肾损伤、 神经毒性、心脏血管毒性等。
[0013]专利文献CN200910193930. 2公开了一种水包油型复方疫苗佐剂，但其中的蜂胶 组成复杂，含多种不明成分，且制备过程需要用到70%乙醇，易造成溶剂残留，仅适用于兽 用疫苗。
[0014]专利文献CN02144678. 4与CN201010103495. 2公开的均为一种纳米乳佐剂，粒径 在10?lOOnm之间。前者在制备过程中流感疫苗需经历高速搅拌与纳米对撞过程，容易导 致抗原效价降低甚至失活。后者所采用的油相肉豆蘧酸异丙酯、油酸乙酯、聚氧乙烯蓖麻油 在注射给药中具有较大毒性。
【发明内容】
[0015]本发明旨在提供一种新型水包油型亚微乳佐剂，其安全性与稳定性优于已上市佐 剂，且制备工艺操作性强，易于工业化生产，适应不同临床应用需求。该佐剂可作为灭活疫 苗、DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等不同疫苗的佐剂，能提高免疫应答，降 低疫苗用量。
[0016]因此，一方面，本发明提供一种作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳，其特征在于含 有：[0017](I)角鲨烯或角鲨烷；
[0018](2)乳化剂；和
[0019](3)注射用辅料；
[0020]所述的乳化剂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯(Solutol HS15)、油酸、油酸钠中的一种或其以任何比例组成的混合物。
[0021]根据本发明的一个优选的实施方式，所述角鲨烯或角鲨烷的用量为1.0% -20%(w/V),优选为 2.0% -10 % (w/V),更优选为 3.0% -6.0% (w/v)。
[0022]根据本发明的一个优选的实施方式，所述乳化剂的用量为0.05% -10% (w/v)，优选为 0.1% -8% (w/v)，更优选为 0.2% -1.0% (w/v)。
[0023]根据本发明的一个优选的实施方式，所述注射用辅料选自pH调节剂、等渗调节剂或注射用水。
[0024]所述pH调节剂选自盐酸、醋酸、甘氨酸、柠檬酸、磷酸盐、氢氧化钠、氢氧化钾或其它可接受的酸碱。其用量通常为0-2% (w/v) 0
[0025]所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇、木糖醇中的一种或其以任何比例组成的混合物。其用量通常为0.5%-10% (w/v)，优选为0.8%-8% (w/v) 0
[0026]根据本发明的一个优选的实施方式，所述水包油型亚微乳的粒径为100_500nm，优选为 100-300nm，更优选为 150_200nm。
[0027]另一方面，本发明提供作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳的方法，包括以下步骤:
[0028](I)制备油相:
[0029]在惰性气体环境下，将脂溶性乳化剂加入角鲨烯或角鲨烷中，至搅拌均匀作为油相；
[0030](2)制备水相:
[0031]在惰性气体环境下，将水溶性乳化剂、pH调节剂、等渗调节剂或其它可接受的辅料加入注射用水中，搅拌均匀作为水相；
[0032](3)制备初乳:
[0033]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切得初乳，用PH调节剂调节初乳的PH值至5.0-10.0，定容；
[0034](4)制备水包油型亚微乳:
[0035]在惰性气体环境下，将初乳转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至500nm或以下，除菌，灌装，或灌装后热压灭菌，即得作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳。
[0036]根据本发明的一个优选的实施方式，上述制备过程中，(4)中所述除菌采用0.22 μ m滤膜过滤来进行。
[0037]根据本发明的一个特别优选的实施方式，本发明所述水包油型亚微乳根据图1所述流程进行制备。
[0038]本发明的水包油型亚微乳作为疫苗佐剂提供多种应用方法，包括但不限于:(I)独立包装，即本发明的水包油型亚微乳在临用前与疫苗混匀后直接使用；(2)组合包装，SP本发明的水包油型亚微乳与疫苗混匀后，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；(3)冻干疫苗产品，即本发明的水包油型亚微乳与疫苗混匀后，灌封，冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前复融。
[0039]本发明的水包油型亚微乳，粒径为100-500nm，优选为100_300nm，更优选为150-200nm，粒径分布窄。作为疫苗佐剂，可使抗原靶向至淋巴细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞(APC)，提高APC对抗原的捕获能力，使APC对抗原充分加工处理形成抗原肽-MHC分子复合物。
[0040]本发明的实验例4对比了本发明的佐剂与MF59佐剂的灭菌条件，实验例5对比了本发明的佐剂与MF59佐剂的溶血性，实验例7对比了本发明的佐剂与MF59佐剂提高流感疫苗免疫效果的作用。结果表明，本佐剂的作用优于MF59佐剂，且稳定性与安全性更优。
[0041]本发明的水包油型亚微乳，稳定性良好，在2_8°C与20_25°C下均能长期保存。与MF59、AS03只能采用过滤除菌不同，该佐剂既能采用过滤除菌，也能经受终端热压灭菌，有助于灵活调整制备工艺，以适应工业化生产的需要。
[0042]本发明的水包油型亚微乳，可作为灭活疫苗、DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等不同疫苗的免疫佐剂，包括但不限于季节性与大流行流感疫苗(包括H1、H2、H3、H5、H7、H9、B亚型以及HA、NA、Ml、M2亚单位抗原)、人乳头瘤状病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗等。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1是本发明特别优选的水包油型亚微乳佐剂的制备工艺流程；
[0044]图2A是实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂的粒径；
[0045]图2B是实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂的粒径分布；
`[0046]图3A是MF59佐剂与实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂热压灭菌后的外观；
[0047]图3B是实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂灭菌后的粒径；
[0048]图3C是实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂灭菌后的粒径分布；
【具体实施方式】
[0049]本发明可以通过以下实施例实现，但不限于以下实施例中的组成、方法、步骤。应该理解，所列举的实施例并不代表本发明的全部应用范畴，而是为了使科研工作者更好地理解这项发明。还应该理解，所使用的术语仅用于描述特定的实施例，而并不是对本发明的限定。
[0050]实施例1:水包油型亚微乳的制备
[0051]在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0052]称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0053]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/LNaOH约0.1ml，调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0054]实施例2:水包油型亚微乳的制备
[0055]在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。[0056]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0057]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/LNaOH约0.1ml，调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0058]实施例3:水包油型亚微乳的制备
[0059]在惰性气体环境下，称取角鲨烯10g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0060]称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0061]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/LKOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0062]实施例4:水包油型亚微乳的制备
[0063]在惰性气体环境下，称取角鲨烯200g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)100g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0064]称取甘油30g，磷酸氢二钠5g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0065]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/LNaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0066]实施例5:水包油型亚微乳的制备
[0067]在惰性气体环境下，称取角鲨烯20g，蛋黄卵磷脂(含80 %磷脂酰胆碱)1.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0068]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0069]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/LNaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0070]实施例6:水包油型亚微乳的制备
[0071] 在惰性气体环境下，称取角鲨烯100g，蛋黄卵磷脂(含80 %磷脂酰胆碱)80g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0072]称取甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0073]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/LNaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0074]实施例7:水包油型亚微乳的制备
[0075]在惰性气体环境下，称取角鲨烯30g，黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)2.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0076]称取甘油20g，柠檬酸0.8g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0077]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/LNaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。[0078]实施例8:水包油型亚微乳的制备
[0079]在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0080]称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0081]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0082]实施例9:水包油型亚微乳的制备
[0083]在惰性气体环境下，称取角鲨烯60g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)10.0g,油酸0.2g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0084]称取甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0085]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约0.3ml, lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0_10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0086]实施例10:水包油型亚微乳的制备
[0087]在惰性气体环境下，称取角鲨烯80g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)10.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0088]称取山梨醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0089]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0090]实施例11:水包油型亚微乳的制备
[0091]在惰性气体环境下，称取角鲨烯80g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)15g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0092]称取氯化钠10.0g,加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0093]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0094]实施例12:水包油型亚微乳的制备
[0095]在惰性气体环境下，称取角鲨烯120g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)35g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0096]称取木糖醇46g，甘氨酸5g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0097]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0098]实施例13:水包油型亚微乳的制备
[0099]在惰性气体环境下，称取角鲨烯150g，蛋黄卵磷脂(含80 %磷脂酰胆碱)60g,搅拌混合均匀，作为油相。[0100]称取甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0101]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0102]实施例14:水包油型亚微乳的制备
[0103]在惰性气体环境下，称取角鲨烷10g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0104]称取山梨醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0105]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约0.6ml, lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0106]实施例15:水包油型亚微乳的制备
[0107]在惰性气体环境下，称取角鲨烷200g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)100g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0108]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0109]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至9.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0110]实施例16:水包油型亚微乳的制备
[0111]在惰性气体环境下，称取角鲨烷20g，蛋黄卵磷脂(含80 %磷脂酰胆碱)1.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0112]称取甘露醇50g，甘氨酸3g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0113]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至8.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0114]实施例17:水包油型亚微乳的制备
[0115]在惰性气体环境下，称取角鲨烷100g，蛋黄卵磷脂(含80 %磷脂酰胆碱)80g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0116]称取氯化钠10.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0117]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至7.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0118]实施例18:水包油型亚微乳的制备
[0119]在惰性气体环境下，称取角鲨烷30g，蛋黄卵磷脂(含80 %磷脂酰胆碱)2.0g，油酸
0.2g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0120]称取葡萄糖50g，柠檬酸1.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0121]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。[0122]实施例19:水包油型亚微乳的制备
[0123]在惰性气体环境下，称取角鲨烷50g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0124]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0125]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0126]实施例20:水包油型亚微乳的制备
[0127]在惰性气体环境下，称取角鲨烷50g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0128]称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0129]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0130]实施例21:水包油型亚微乳的制备
[0131]在惰性气体环境下，称取角鲨烷60g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)10g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0132]称取木糖醇46g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0133]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0134]实施例22:水包油型亚微乳的制备
[0135]在惰性气体环境下，称取角鲨烷130g，蛋黄卵磷脂(含80 %磷脂酰胆碱)25g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0136]称取甘油40g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0137]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0138]实施例23:水包油型亚微乳的制备
[0139]在惰性气体环境下，称取角鲨烷170g，蛋黄卵磷脂(含80 %磷脂酰胆碱)50g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0140]称取甘油20g，磷酸二氢钾2.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0141]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L KOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0142]实施例24:水包油型亚微乳的制备
[0143]在惰性气体环境下，称取角鲨烯10g，大豆卵磷脂0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0144]称取木糖醇46g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0145]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0146]实施例25:水包油型亚微乳的制备
[0147]在惰性气体环境下，称取角鲨烯200g，大豆卵磷脂100g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0148]称取葡萄糖50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0149]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0150]实施例26:水包油型亚微乳的制备
[0151]在惰性气体环境下，称取角鲨烯20g，大豆卵磷脂1.0g，油酸0.3g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0152]称取甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0153]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约
1.0ml, lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0154]实施例27:水包油型亚微`乳的制备
[0155]在惰性气体环境下，称取角鲨烯100g，大豆卵磷脂80g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0156]称取油酸钠0.2g，磷酸氢二钾2.0g，甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0157]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L KOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0158]实施例28:水包油型亚微乳的制备
[0159]在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，大豆卵磷脂5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0160]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0161]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0162]实施例29:水包油型亚微乳的制备
[0163]在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，大豆卵磷脂6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0164]称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0165]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0166]实施例30:水包油型亚微乳的制备
[0167]在惰性气体环境下，称取角鲨烯150g，大豆卵磷脂60g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0168]称取氯化钠10.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。[0169]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0170]实施例31:水包油型亚微乳的制备
[0171]在惰性气体环境下，称取角鲨烯10g，氢化蛋黄卵磷脂0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0172]称取甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0173]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约0.3ml, lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0_10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0174]实施例32:水包油型亚微乳的制备
[0175]在惰性气体环境下，称取角鲨烯200g，氢化蛋黄卵磷脂100g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0176]称取葡萄糖50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0177]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L Na OH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0178]实施例33:水包油型亚微乳的制备
[0179]在惰性气体环境下，称取角鲨烯20g，氢化蛋黄卵磷脂1.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0180]称取氯化钠10.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0181]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0182]实施例34:水包油型亚微乳的制备
[0183]在惰性气体环境下，称取角鲨烯100g，氢化蛋黄卵磷脂80g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0184]称取山梨醇50g，甘氨酸4.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0185]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0186]实施例35:水包油型亚微乳的制备
[0187]在惰性气体环境下，称取角鲨烯30g，氢化蛋黄卵磷脂2.0g,油酸0.2g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0188]称取甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0189]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/LNaOH约0.1ml，调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。[0190]实施例36:水包油型亚微乳的制备
[0191]在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，氢化蛋黄卵磷脂4.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0192]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0193]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0194]实施例37:水包油型亚微乳的制备
[0195]在惰性气体环境下，称取角鲨烯60g，氢化蛋黄卵磷脂10.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0196]称取油酸钠0.3g，磷酸二氢钠2.0g，甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0197]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0198]实施例38:水包油型亚微乳的制备
[0199]在惰性气体环境下，称取角鲨烯140g，氢化蛋黄卵磷脂40g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0200]称取木糖醇46g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0201]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0202]实施例39:水包油型亚微乳的制备
[0203]在惰性气体环境下，称取角鲨烷10g，氢化大豆卵磷脂0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0204]称取葡萄糖50g，甘氨酸2.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0205]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0206]实施例40:水包油型亚微乳的制备
[0207]在惰性气体环境下，称取角鲨烷200g，氢化大豆卵磷脂100g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0208]称取氯化钠10.0g,加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0209]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0210]实施例41:水包油型亚微乳的制备
[0211]在惰性气体环境下，称取角鲨烷20g，氢化大豆卵磷脂1.0g，搅拌混合均匀，作为油相。[0212]称取甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0213]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0214]实施例42:水包油型亚微乳的制备
[0215]在惰性气体环境下，称取角鲨烷100g，氢化大豆卵磷脂80g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0216]称取甘露醇50g，柠檬酸0.8g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0217]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0218]实施例43:水包油型亚微乳的制备
[0219]在惰性气体环境下，称取角鲨烷40g，氢化大豆卵磷脂5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0220]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0221]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0222]实施例44:水包油型亚微乳的制备
`[0223]在惰性气体环境下，称取角鲨烷60g，氢化大豆卵磷脂6.0g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0224]称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0225]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0226]实施例45:水包油型亚微乳的制备
[0227]在惰性气体环境下，称取角鲨烷70g，氢化大豆卵磷脂12g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0228]称取木糖醇46g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0229]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0230]实施例46:水包油型亚微乳的制备
[0231]在惰性气体环境下，称取角鲨烷150g，氢化大豆卵磷脂50g，搅拌混合均匀，作为油相。称取山梨醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0232]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0233]实施例47:水包油型亚微乳的制备[0234]在惰性气体环境下，称取角鲨烯45g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)4.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0235]称取Solutol HS152.0g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0236]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0237]实施例48:水包油型亚微乳的制备
[0238]在惰性气体环境下，称取角鲨烯55g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0239]称取Solutol HS151.0g，甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0240]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0241]实施例49:水包油型亚微乳的制备
[0242]在惰性气体环境下，称取角鲨烯70g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)10g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0243]称取Solutol HS150.5g，甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0244]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0245]实施例50:水包油型亚微乳的制备
[0246]在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)4.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0247]称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0248]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0249]实施例51:水包油型亚微乳的制备
[0250]在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0251]称取油酸钠0.2g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0252]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0253]实施例52:水包油型亚微乳的制备
[0254]在惰性气体环境下，称取角鲨烯60g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)10g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0255]称取油酸钠0.2g，甘油20g，柠檬酸1.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。[0256]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0257]实施例53:水包油型亚微乳的制备
[0258]在惰性气体环境下，称取角鲨烯80g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)30g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0259]称取油酸钠0.5g，甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0260]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0261]实施例54:水包油型亚微乳的制备
[0262]在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)4.0g，油酸0.3g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0263]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0264]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0265]实施例55:水包油型亚微乳的制备
[0266]在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)5.0g，油酸0.2g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0267]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0268]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0269]实施例56:水包油型亚微乳的制备
[0270]在惰性气体环境下，称取角鲨烯60g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)IOg,油酸0.2g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0271]称取甘油20g，甘氨酸2.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0272]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0273]实施例57:水包油型亚微乳的制备
[0274]在惰性气体环境下，称取角鲨烯80g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)30g,油酸0.5g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0275]称取甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0276]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0277]实施例58:水包油型亚微乳的制备[0278]在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，作为油相。
[0279]称取Solutol HS155.0g,油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0280]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约0.6ml, lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0_10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0281]实施例59:水包油型亚微乳的制备
[0282]在惰性气体环境下，称取角鲨烷50g，作为油相。
[0283]称取Solutol HS156.0g,油酸钠0.2g,甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0284]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/LNaOH约0.2ml，调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0285]实施例60:水包油型亚微乳的制备
[0286]在惰性气体环 境下，称取角鲨烯20g，角鲨烷25g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)4.0g,搅拌混合均匀,作为油相。
[0287]称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0288]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0289]实施例61:水包油型亚微乳的制备
[0290]在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)4.0g，氢化蛋黄卵磷脂1.0g,搅拌混合均匀,作为油相。
[0291]称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0292]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0293]实施例62:水包油型亚微乳的制备
[0294]在惰性气体环境下，称取角鲨烷50g，大豆卵磷脂5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0295]称取油酸钠0.3g，甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0296]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0297]实施例63:水包油型亚微乳的制备
[0298]在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，氢化大豆卵磷脂4.0g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0299]称取Solutol HS152.0g,甘油25g，甘氨酸3.5g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。[0300]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。调节初乳pH值至5.0-10.0,以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0301]实施例64:水包油型亚微乳的制备
[0302]在惰性气体环境下，称取角鲨烯25g，角鲨烷25g，蛋黄卵磷脂(含80%磷脂酰胆碱)5.0g,搅拌混合均匀,作为油相。
[0303]称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0304]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0305]实施例65:水包油型亚微乳的制备
[0306]在惰性气体环境下，称取角鲨烷60g，大豆卵磷脂6.0g,搅拌混合均匀，作为油相。
[0307]称取Solutol HS151.0g，甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0308]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0309]实施例66:水包油型亚微乳的制备
[0310]在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，大豆卵磷脂5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
[0311]称取油酸钠0.2g，甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
[0312]在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入lmol/L盐酸、lmol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
[0313]实施例67:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
[0314]将适量疫苗加入到实施例2制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例I制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例1制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0315]实施例68:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
[0316]将适量疫苗加入到实施例20制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例18制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例18制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0317]实施例69:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
[0318]将适量疫苗加入到实施例28制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例26制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例26制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0319]实施例70:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
[0320]将适量疫苗加入到实施例36制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例34制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例34制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0321]实施例71:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备[0322]将适量疫苗加入到实施例43制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例41制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例41制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0323]实施例72:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
[0324]将适量疫苗加入到实施例48制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例46制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例46制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0325]实施例73:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
[0326]将适量疫苗加入到实施例51制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例49制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例49制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0327]实施例74:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
[0328]将适量疫苗加入到实施例55制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例49制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例49制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0329]实施例75:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
[0330]将适量疫苗加入到实施例60制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例54制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例54制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0331]实施例76:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
`[0332]将适量疫苗加入到实施例64制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例58制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例58制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0333]实施例77:水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
[0334]将适量疫苗加入到实施例66制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例60制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例60制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前以生理盐水复融。
[0335]下述实验例进一步阐明本发明的技术效果，但所列举的实验例并不代表本发明的全部应用范畴。
[0336]实验例1:水包油型亚微乳佐剂粒径与粒径分布测定
[0337]将实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂以注射用水作适当稀释，采用MalvernNano-ZS90动态光散射粒径电位测定仪测定其粒径及粒径分布。
[0338]结果(图2A、2B)显示，本发明实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂平均粒径为184.2nm，多分散性系数(PdI)为0.087，粒径小且粒径分布窄。
[0339]实验例2:水包油型亚微乳佐剂与MF59佐剂的ζ电位测定
[0340]乳滴之间的静电斥力是亚微乳保持稳定的主要原因，静电斥力可通过ζ电位表征。通常认为，?电位绝对值大于30mV时，亚微乳稳定性较佳。
[0341]将实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂以注射用水作适当稀释，采用MalvernNano-ZS90动态光散射粒径电位测定仪测定其ζ电位。[0342]根据专利文献TO9014837、EP0399843A2、US6299884B1、US6451325B1、US20090191226A2所述，通过以下方法制备MF59佐剂:(I)将0.5 %司盘85 (Span85)与
5.0%角鲨烯搅拌混合均匀，作为油相；将0.5%吐温80(Tween80)加至适量柠檬酸缓冲液中，搅拌混合均匀，作为水相。(2)将油相加至水相中，10000转/分钟(rpm)剪切5min,形成初乳。将初乳转至高压乳匀机中，12000psi乳匀5次。过滤除去大粒子后，灌装，0.22 μ m过滤除菌，即得。
[0343]取上述MF59佐剂，同法测定其ζ电位。
[0344]结果显示，本发明实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂ζ电位为-38.9mV, MF59佐剂的4电位为-25.7mV，表明本发明的0/W亚-微乳佐剂稳定性显著优于MF59佐剂。
[0345]实验例3:水包油型亚微乳佐剂、MF59佐剂的长期稳定性
[0346]将实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂、实施例2制备的水包油型亚微乳佐剂、MF59佐剂分别于2-8°C与20-25°C下放置I周、2周、I个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样，观察外观，测定粒径。结果见下表:
[0347]水包油型亚微乳佐剂(实施例1)
【权利要求】
1.作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳，其特征在于含有: (1)角鲨烯或角鲨烷； (2)乳化剂；和 (3)注射用辅料； 所述的乳化剂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、油酸、油酸钠中的一种或其以任何比例组成的混合物。
2.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述角鲨烯或角鲨烷的用量为.1.0% -20% (w/v)，优选为 2.0%-10% (w/v)，更优选为 3.0% -6.0% (w/v)。
3.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述乳化剂的用量为.0.05% -10% (w/v)，优选为 0.1 %-8% (w/v)，更优选为 0.2%-1.0% (w/v)。
4.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述注射用辅料选自PH调节剂、等渗调节剂、注射用水或其它可接受的辅料。
5.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述pH调节剂选自盐酸、醋酸、甘氨酸、柠檬酸、磷酸盐、氢氧化钠、氢氧化钾或其它可接受的酸碱。
6.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述PH调节剂的用量为0-2%(w/V)。
7.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇、木糖醇中的一种或其以任何比例组成的混合物。
8.如权利要求7所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述等渗调节剂的用量为.0.5% -10% (w/v)，优选为 0.8%-8% (w/v)。
9.如权利要求1-8任一项所述的水包油型亚微乳，其特征在于其粒径为100-500nm，优选为 100-300nm，更优选为 150_200nm。
10.制备权利要求1-9任一项所述的作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳的方法，包括以下步骤: (1)制备油相: 在惰性气体环境下，将脂溶性乳化剂加入角鲨烯或角鲨烷中，至搅拌均匀作为油相； (2)制备水相: 在惰性气体环境下，将水溶性乳化剂、PH调节剂、等渗调节剂或其它可接受的辅料加入注射用水中，搅拌均匀作为水相； (3)制备初乳: 在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切得初乳，用PH调节剂调节初乳的pH值至5.0-10.0，定容； (4)制备水包油型亚微乳: 在惰性气体环境下，将初乳转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至500nm或以下，除菌，灌装，或灌装后热压灭菌，即得作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳。
11.如权利要求10所述的方法，其中(4)中所述除菌步骤采用0.22μ m滤膜过滤来进行。
12.使用权利要求1-9任一项所述的作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳的方法，所述方法包括:(1)所述水包油型亚微乳在使用前与疫苗混匀；(2)所述水包油型亚微乳与疫苗混匀后，灌封，贮藏于2-8°C，直至临床使用；和(3)所述水包油型亚微乳与 疫苗混匀后，灌封，冻干，贮藏于2-8°C，临床使用前复融。
【文档编号】A61K39/39GK103784953SQ201310030726
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年1月28日 优先权日:2012年10月26日
【发明者】金方, 蔡伟惠, 邓家华 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院