专利名称：一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritisvirus, TGEV)引起的猪的一种高度接触性、致死性传染病，以引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和脱水为主要特征。其中2周龄内仔猪死亡率可达到100%，5周龄以上的猪病死率较低，较大或成年猪几乎没有死亡，然而可引起掉膘、降低饲料报酬、增加药费和人力等开支，造成严重损失。该病1933年起在美国广泛流行，1946年由Doyle等确定本病的病原，以后世界上许多国家和地区(日本、英国、法国、荷兰、德国、意大利、前苏联、中国台湾省等)都相继报道。从60年代末起，我国许多省、市都有本病流行(殷震，刘景华.动物病毒学.第二版.北京:科学出版社.1997. 11:681-683)。TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属(Coronavirus),是一种单股正链RNA病毒。本病毒只有一个血清型，与猪流行性腹泻病毒抗原无抗原交叉性。病猪及带毒猪是主要的传染源，主要经消化道、呼吸道传染给易感猪，病毒也可通过乳汁传给仔猪。猪流行性腹湾是由猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种急性接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、食欲下降和脱水为基本特征，各种年龄的猪均易感。本病的临床症状和病理变化都与猪传染性胃肠炎十分相似，但哺乳仔猪死亡率较低，在猪群中得传播速度相对缓慢。1971年首次在英国发现，主要引起架子猪和育肥猪急性腹泻，当时称为“猪流行性病毒性腹泻(印idemic virus diahorreaEVD)”。随后该病在许多国家，如比利时、荷兰、德国、法国、匈牙利、前苏联以及日本等均有发生。19 82年将该病统一命名为猪流行性腹泻(PED)。我国至20世纪80年代以来陆续有本病发生的报道，并分离到病毒(宁宜宝.兽用疫苗学.北京中国农业出版社.2008. 11:258-260)。PED和TGE在病毒抗原形态、临床症状、流行病学上极其相似，唯免疫学和血清学相互没有交叉反应。哈尔滨兽医研究所对TGE和PED两种病毒抗原结构蛋白的分析研究证明，两种病毒抗原差异在纤突蛋白上，PED是独立的猪急性肠道传染病(刘矿.猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒的分离、鉴定及部分基因序列分析.11-13)。PEDV为冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的成员，目前发现只有一个血清型。PEDV可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，尤其以哺乳仔猪严重。母猪的发病率在15% 90%。本病主要在冬季多发，夏季也可发生，我国从12月份至次年2月份为本病的高发期。病猪和带毒猪是主要传染源，病毒多经发病猪的粪便排出，运输车辆、饲养员的鞋子或其他带病毒的动物，都可作为传播媒介。自然感染开始于口部吸收病毒以后，主要经消化道传播，也有经呼吸道传播的报道。PED可单一发生或与TGEV混合感染，但以和TGEV的混合感染较为常见。
对于猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻这两种病的防控，国内外兽医工作者进行了大量的工作，目前尚无特效药物和疗法，主要是通过加强饲养管理和疫苗免疫等措施进行预防和控制。国外有多种弱毒疫苗使用，接种的途径也不一样。国内猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联活疫苗，病毒培养的细胞基质多为原代细胞，而原代细胞由多种类型的细胞组成，细胞种类比较复杂，细胞间特性存在差异，动物的个体间存在差异，存在难以保证细胞质量的一致性、外源致病微生物污染的风险大、生产成本高等缺点，给疫苗产量、效力的提高带来困难，难以满足大规模生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供本发明人自行致弱、保存的一株适应于猪睾丸细胞系(ST细胞)的猪传染性胃肠炎病毒株和一株适应于非洲绿猴肾细胞系(Veix)细胞)的猪流行性腹泻病毒株，利用两株病毒制备一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗，用于有效预防猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻两种疾病。为解决上述技术问题，本发明的技术方案在于1.该疫苗含有保藏号为CGMCC No. 6001的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus)SD/L株和保藏号为CGMCC No. 6002的猪流行性腹湾病毒(Porcineepidemic diarrheavirus) LW/L株,两株病毒已于2012年4月13日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。2.猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗的制备方法是将保藏号为CGMCCNo. 6001的猪传染性胃肠炎病毒SD/L株接种于ST细胞上进行病毒扩增、将保藏号为CGMCCNo. 6002的猪流行性腹泻病毒LW/L株接种于Veix)细胞上进行病毒扩增，再经过收获、冻干等步骤制备出高效价的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗。3.给猪使用有 效剂量的该疫苗进行免疫，能使免疫猪对猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒产生免疫保护。利用本发明人自行致弱获得的一株猪传染性胃肠炎病毒SD/L株和自行致弱获得的一株猪流行性腹泻病毒LW/L株，分别在猪睾丸细胞系(ST细胞)和非洲绿猴肾细胞系(Veix)细胞)上进行病毒扩增，再经过收获、混匀、冻干等步骤，制备一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗，该疫苗TGEV和PEDV病毒含量均> IO7-0/头份。
具体实施例方式1.病毒来源由猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)疑似发病仔猪中，采集粪便、十二指肠、空肠和肠系膜淋巴结组织，在临床症状和RT-PCR确诊的基础上，用细胞传代方法分别分离到一株TGE和PED疑似病毒，RT-PCR和病毒中和试验检测阳性，其它理化特性和生物学特性符合TGEV和PEDV的特点，分别命名为SD株和LW株。随后对这两种病毒进行细胞传代致弱、安全性和免疫原性检测，证明这两种病毒已被致弱并具有良好的免疫原性，可以作为疫苗株分别被命名为猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)SD/L 株和猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus) LW/L 株。
本发明涉及到的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)SD/L株，由本发明人致弱获得，该株病毒已于2012年04月13日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No. 6001 ；本发明涉及到的猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus) LW/L株，由本发明人致弱获得，该株病毒已于2012年04月13日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo. 6002。2.病毒株特性(I)病毒培养TGEV传代培养用细胞为猪睾丸细胞(ST细胞，购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心)。将TGEV病毒样品按维持液量的5%接到ST细胞(营养液为含10%新生牛血清的MEM生长液或含2%新生牛血清的MEM维持液，按常规方法培养)单层上，置37°C、5%C02培养箱中静置培养，每天观察CPE，至96 120小时，当细胞出现肿胀、变圆、融合、脱落，细胞融合性病变达80%时收获，冻融I次后继续传代。连续传代至65代后，生产用病毒毒价彡108_°TCID5Q/ml。PEDV传代培养用细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero细胞，购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心)。将TGEV病毒样品按维持液量的5%接到Veix)细胞(营养液为含10%新生牛血清的MEM生长液或含2%新生牛血清的MEM维持液，按常规方法培养)单层上，置37°C、5%C02培养箱中静置培养，每天观察CPE，至96 120小时，当细胞出现肿胀、变圆、融合、脱落，细胞融合性病变达80%时收获，冻融I次后继续传代。连续传代至90代后，生产用病毒毒价> 108 0TCID50/mlo(2)分子病毒学 鉴定根据GenBank登录的TGEV S gene保守序列，自行设计一对引物，TGEV-Pl 5’ -ATGTCCAGTTGACTTTGTTTCG-3’ ；TGEV-P2 :5’ -CCACCAATCATTTTCGCA-3’从TGEV毒液提取RNA，用TGEV-P2反转录后用以上引物进行PCR扩增，结果可扩增出约IOOObp的特异性核酸带。根据GenBank登录的PEDV S gene保守序列，设计一对引物，PEDV-P1 :5，-TTTATTCTGTCACGCCATGT-3，；PEDV-P2 5，-CCAGATTTACAAACACCTATGTTA-3，从PEDV毒液提取RNA，经PEDV-P2反转录后用以上引物进行PCR扩增，结果可扩增出约200bp的特异性核酸带(陈芳，刘惠莉，孙红立，等.多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒.中国兽医学报，2005，25 (I) 9-12)。(3)安全性用毒种原液经肌肉注射3日龄健康易感仔猪(TGEV、PEDV中和抗体效价彡1:4) 4头，每头2ml,观察14日，均无不良反应。(4)免疫原性分别用猪传染性胃肠炎病毒SD/L株45、60、75代，猪流行性腹泻病毒LW/L株85、95、105代进行免疫原性试验，免疫剂量为I头份(IO8 tlTCID5ci),三个不同代次的两种病毒一免后，14天细胞中和抗体水平均可达到32以上。
3.猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联活疫苗的制备(I)将TGEV和PEDV毒种采用异步接毒法(接入病毒液，37 °C吸附Ih后加入维持液)分别接种到单层ST细胞和Veix)细胞，然后将转瓶细胞置37°C培养，转速为8 10r/h。(2)当细胞病变达80%左右时即可收获病毒液，冻融I次，置_20°C冻结保存，此为半成品，待检备用。(3)经过半成品检验合格后，TGEV和PEDV与常规冻干保护剂按体积比例为1:1:2混合，进行冻干。冻干完成后，贴签，入库保存。4.疫苗的成品检验( I)无菌检验应无菌生长。按《中国兽药典》中的规定进行检验。(2)支原体检验应无支原体。按《中国兽药典》中的规定进行检验。(3)鉴别检验将疫苗作1000倍稀释，分别与等量TGEV和PEDV特异性阳性血清混合，经37°C中和60分钟后，分别接种已长成单层的ST细胞和Veix)细胞24孔细胞培养板，中和组接种12孔，不中和对照和细胞对照各6孔，每孔0. 5ml。将细胞培养板置37°C、5%C02培养箱中培养，观察96 120小时，中和组合细胞对照组不产生CPE，不中和组出现典型CPE。(4)外源病毒检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，应无外源病毒。(5)安全检验用3 5日龄健康易感仔猪(TGEV、PEDV中和抗体效价彡1:4)4头，肌肉接种疫苗，每头2ml，观察14日，均无不良反应。(6)效力检验用3 5日龄健康易感仔猪(TGEV、PEDV中和抗体效价彡1:4)8头，接种疫苗，每头I头份，14日后，连同条件相同的对照猪2头，采血，分别用ST细胞和Veix)细胞，用中和试验方法检测血清`TGEV和PEDV中和抗体。8头猪中应至少有7头发生血清阳转，TGEV和PEDV中和抗体效价均应彡1:16,2头对照仔猪TGEV和PEDV中和抗体均应(1:4。(7)剩余水分测定每批冻干制品任抽4个样品，各样品剩余水分均不应超过4%。如果有超过时，可重检I次，重检后如有I个样品超过规定，该批次样品应判为不合格(《中国兽药典》)。(8)真空度测定包装前测定真空度，无真空制品，应予剔除报废，不得重抽空出售(《中国兽药典》)。
图1TGEV PCR产物电泳中1为TGEV毒液；2为阴性对照；M为MarkerDL2000。图2PEDV PCR产物电泳中I为阴性对照；M为Marker DL2000 ； 2为PEDV毒液。本发明涉及的微生物菌种本发明涉及到的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)SD/L株，2012年04月13日该株病毒已送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为=CGMCCNo.6001 ；本发明涉及到的猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus) LW/L株，2012年04月13日该株病毒已送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为=CGMCC No. 6002。本发明的积极意义本发明提供一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗，该疫苗是由本发明人利用自行致弱、保存的一株猪传染性胃肠炎病毒SD/L株和一株流行性腹泻病毒LW/L株，分别在猪睾丸细胞系(ST细胞)或非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)上进行病毒扩增，再经过收获、混匀、冻干等步骤，制备一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗。该疫苗能够有效预防猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻两种疾病，并有以下优点1.猪传染性胃肠炎病毒SD/L株和猪流行性腹泻病毒LW/L株两株病毒具有良好免疫原性、安全性和传代稳定性。TGEV连续传代至65代后，生产用病毒毒价彡108_°TCID5(l/ml。PEDV连续传代至90代后，生产用病毒毒价> 108 0TCID50/mlo2.用ST细胞系和Veix)细胞系分别接种相应病毒生产的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗，相比原商品化疫苗产品生产中的原代细胞生产工艺病毒含量更高、更易于生产，传代细胞工艺相比原代细胞工艺大大节约了生产成本。3.根据动物使用本发明的疫苗免疫后血清中和抗体水平，本发明提供的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗相比原商品化猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗产品，有显著地免疫效力优势。实施例 以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1——毒株的纯净性1.参照GenBank上已发表的TGEV序列(AB115401)，针对0RF7基因设计引物TG1 5' -ATGCTCGTCCTCCTCCATG-3'，TG2 :5' -CCATTGTTGGCTCGTCGTAG-3'，从 TGEV 毒液提取RNA，经反转录后用以上引物进行RT-PCR扩增，结果可扩增出436bp的特异性核酸带，确定所分尚的病毒为TGEV。参照GenBank上已发表的PEDV序列(FJ158546. 1)，针对M基因设计引物，引物序列为PED-1 :5' -TGATGAGGTGATTCAACACCT-3'，PED-2:5' -TGAGAACCGAACTCGGATT-3'。从TGEV毒液提取RNA，经反转录后用以上引物进行RT-PCR扩增，结果可扩增出626bp的特异性核酸带，确定所分离的病毒为PEDV。2.将TGEV病毒液1000倍稀释后与TGEV特异性阳性血清等量混合，经37°C中和60分钟后，接种已长成单层的ST细胞24孔细胞培养板，中和组接种12孔，不中和对照和细胞对照各6孔，每孔0. 5ml。将细胞培养板置37°C、5%C02培养箱中培养，观察96 120小时，中和组合细胞对照组不产生CPE，不中和组出现典型CPE。3.将PEDV病毒液1000倍稀释后与PEDV特异性阳性血清等量混合，经37°C中和60分钟后，接种已长成单层的Vero细胞24孔细胞培养板，具体方法同TGEV，中和组合细胞对照组不产生CPE，不中和组出现典型CPE。4.根据《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，本发明以下简称《中国兽药典》)规定进行无菌检验，无菌检验T. G、G. P小管和G. A斜面培养基均未观察到菌落。
5.根据《中国兽药典》规定进行，支原体检验在观察期内，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无“煎蛋”状支原体菌落。6.按《中国兽药典》规定的外源病毒检验方法进行，分别进行了致细胞病变外源病毒检验、荧光抗体检查、红细胞吸附病毒检测，证明毒种是纯净的。实施例2—疫苗制备1.毒种繁殖将TGEV毒种按0. 1%和1%细胞维持液(含2%新生牛血清的MEM和DMEM维持液)的量接种到ST细胞上，将PEDV毒种按0. 1%和1%细胞维持液(含2%新生牛血清的MEM和DMEM维持液)的量接种到Vero细胞单层上。置37°C、5%C02培养箱中静置培养，每天观察CPE，当细胞出现肿胀、变圆、融合、脱落，细胞融合性病变达80%时收获，冻融I次后测定病毒含量，毒价彡108 0TCID50/ml的病毒液作为生产用毒种。2.制苗用毒液的制备将制备好的TGEV和PEDV生产用种毒，采用异步接毒的方法分别接种到转瓶ST和Vero细胞单层，接毒量分别为细胞维持液的0. 1%和1%，然后将转瓶细胞置37°C培养，转速为8 10r/h。当细胞病变达80%左右时即可收获病毒液，冻融I次，置_20°C冻结保存，此为半成品。 3.冻干经过半成品检验合格后，用TGEV和PEDV与脱脂奶常规冻干保护剂按体积比例为1:1:2混合，分装成2. 8ml/瓶，进行真空冷冻干燥而成。实施例3——疫苗的成品检验本检验所用疫苗为按照本发明所述方法生产的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗批号为101批和102批。1.无菌检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，两批疫苗均无菌生长。2.支原体检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，两批疫苗均无支原体。3.鉴别检验将两批疫苗分别作1000倍稀释，再分别与等量TGEV和PEDV特异性阳性血清混合，经37°C中和60分钟后，分别接种已长成单层的ST细胞24孔细胞培养板，中和组接种12孔，不中和对照和细胞对照各6孔，每孔0. 5ml。将细胞培养板置37°C、5%C02培养箱中培养，观察96 120小时，中和组和细胞对照组不产生CPE，不中和组出现典型CPE。4.外源病毒检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，两批疫苗均无外源病毒。5.安全检验用3 5日龄健康易感仔猪(TGEV、PEDV中和抗体效价彡1:4) 4头，肌肉接种疫苗，每头2ml，观察14日，两批疫苗均无不良反应。6.效力检验用3 5日龄健康易感仔猪(TGEV、PEDV中和抗体效价彡1:4) 8头，接种疫苗，每头I头份，14日后，连同条件相同的对照猪2头，采血，分别用ST细胞和Veix)细胞，用中和试验方法检测血清TGEV和PEDV中和抗体。8头猪均发生血清阳转，TGEV和PEDV中和抗体效价均彡1:16,2头对照仔猪TGEV和PEDV中和抗体均彡1: 4，详细见表I所
不结果。表I猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗效力检验结果
权利要求
1.一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗，其特征是该疫苗含有保藏号为 CGMCCNo. 6001的猪传染性胃肠炎病毒SD/L株病毒和保藏号为CGMCC No. 6002的猪流行性腹泻病毒LW/L株病毒，两株病毒已于2012年4月13日送交北京市朝阳区北辰西路I号院 3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
2.—种权利要求1所述的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗的制备方法，其特征在于将保藏号为CGMCC No. 6001的猪传染性胃肠炎病毒SD/L株接种于ST细胞上进行病毒扩增、将保藏号为CGMCC No. 6002的猪流行性腹泻病毒LW/L株接种于Vero细胞上进行病毒扩增，再经过收获、冻干等步骤制备出高效价的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗。
3.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗，其特征是给猪使用有效剂量的该疫苗进行免疫，能使免疫猪对猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒产生免疫保护。
全文摘要
本发明涉及一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗及其制备方法。本发明利用自行致弱、保存的一株猪传染性胃肠炎病毒SD/L株和一株猪流行性腹泻病毒LW/L株，分别在猪睾丸细胞系(ST细胞)或非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)上进行病毒扩增，再经过收获、混匀、冻干等步骤，制备一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗。该疫苗能够有效预防猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻两种疾病。
文档编号A61P31/14GK103041385SQ201310034269
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者张淑刚, 张中波, 张青婵, 徐龙涛, 王蕾, 鲍海忠, 李一经 申请人:齐鲁动物保健品有限公司