专利名称：一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及细胞工程领域，具体的说是涉及一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法。
背景技术：
黄酮是植物经光合作用产生的一大类化合物，其结构母核是以C6-C3-C6为骨架的
2-苯基色原酮。它的存在形式有两种，一种是游离的苷元，另一种是与糖等结合的苷。黄酮类化合物在植物界分布很广泛，如银杏叶、山碴、沙棘、蔷薇果、拘祀、杜仲、茶叶、葛根等。到目前为止，已发现有500多种植物中有黄酮类和异黄酮类物质，它们包括黄烷酮、异黄烷酮、黄酮醇、黄烷酮醇、双黄酮及其衍生物。黄酮类物质主要作用有:抗肿瘤，延缓衰老、增强心血管功能、治疗慢性前列腺炎、增强免疫力、调解内分泌系统、护肝、抗炎、抗过敏、抑菌、抗病毒等。葛根为豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，甘葛藤又习称为粉葛，葛根是最常用的称呼。从成分分析结果看，葛根的葛根素及总黄酮含量显著高于本属其它植物，活性物质主要为大豆素、大豆甙、葛根素、葛根素-7-木糖甙等，是提取黄酮的较优选择。目前提取黄酮的方法有很多，如热水提取法、碱液提取法、丙酮提取法、乙醇浸提法、微波萃取法、超声波法等，但是这些方法的共性是将含黄酮植物粉碎处理后直接进行提取，黄酮收率因工艺和原材料的差别而不稳定，而且提取不够完全，容易造成黄酮成分的损失，整体收率都不高。如文献《葛根总黄酮的提取研究》(李增富，吴荣峰，应用化工第37卷第11期)，其收率为 167.974mg/100g 葛根粉，即 0.17%。利用植物细胞、组织或器官培养来获得对人类有用的次生代谢物已经成为当今植物生物技术领域的研究热点之一，其最大优点就是生产完全在人工控制条件下进行，可以通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超整株植物收率的代谢产物。然而影响植物细胞培养的因素很多，如培养基成分，植物本身的特性，培养条件，环境条件，生物因素，内部因素等，尤其是培养基成分则是关键之关键，其不仅影响机体的生长还影响机体的次生代谢产物合成。因此，提供一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法对于开拓黄酮制备新途径具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法，使得该方法能够提高从葛根中获取黄酮的收率。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案:—种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法，将葛根愈伤组织细胞接种在培养基上在23-27°C温度、800-12001x光照强度下，以每天8_12小时光照时间培养15-20天，然后分离
获得黄酮；所述培养基由NH4NO3、KNO3、MgSO4 *7H20,CaCl2.2Η20,KH2PO4,FeSO4.7Η20、EDTA-Na2、K1、CoCl2.6Η20、H3BO3> Na2MoO2.2Η20、MnSO4.H2O, CuSO4.5Η20、ZnSO4.7Η20、6_ (苄胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖、琼脂组成，pH值为5.8。其中，所述葛根愈伤组织细胞可通过本领域常规的植物组织培养和愈伤组织培养操作制备获得，即通过将葛根外植体进行培养，然后进行愈伤组织培养后获得，所述葛根外植体取自根部。本发明所述葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。本发明针对现有提取黄酮收率不高的缺陷，通过细胞培养技术手段，优化培养条件和选择优良培养体系对葛根细胞进行培养，促使其分泌次生代谢物黄酮，收率得到提升。作为优选，所 述培养基由以下方法制备获得:以质量百分浓度计，配制由8.25% 的 NH4NO3>9.50% 的 KNO3> 1.85% 的 MgSO4.7H20和余量水组成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水组成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水组成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水组成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的烟酸、0.0025%的盐酸吡哆醇、0.0005%的盐酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水组成的第六溶液；分别取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(苄胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖以及琼脂定容至IOOOmL,其中6-(苄胺基)嘌呤浓度为10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸浓度为1.5X10_5M，蔗糖质量百分浓度为3%，琼脂质量百分浓度为0.75%，然后调pH值为5.8高压灭菌后即得培养基。需要说明的是，本发明所述培养基并不局限于配制成IOOOmL,本领域技术人员通过参考本发明所述培养基配制比例，能够轻易的扩大或缩小所述培养基的规格，这也在本发明保护范围内。在本发明培养葛根细胞的过程中，作为优选，所述光照强度为10001X，所述光照时间为10小时，所述温度为25°C，所述培养时间为16-19天。在本发明所述方法的最后，从培养基中提取分离黄酮属于本领域常规技术手段，如采用乙醇进行浸提提取分离。作为优选，本发明所述分离提取获得黄酮具体为:步骤1、收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、粉碎，然后以愈伤组织细胞:50-75%乙醇为lg:15-35mL的质量体积比，向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡20_60min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，滤渣进行步骤2 ；步骤2、以滤渣:50-75%乙醇为lg: 15_35mL的质量体积比，向滤渣中加入乙醇并振荡20-60min，然后过滤，获得滤液和滤洛，滤液备用，滤洛重复本步骤1_3次；步骤3、合并步骤I和步骤2所获得的所有滤液、浓缩并烘干，即得黄酮。其中，作为优选，步骤I和步骤2所述质量体积比为lg:20mL，步骤I和步骤2所述乙醇体积百分数为60%，步骤I和步骤2所述振荡时间为40min。根据现有技术的记载(见背景技术)，现有提取葛根总黄酮的收率为0.17%，而经过本发明所述方法获得的黄酮，其收率将近0.5%，相对于现有技术明显得到提高。同时，本发明还调整培养基部分组分以及用量，结果显示，调整后的培养方法获得的黄酮收率为0.36%，表明随意调整培养基成分易使得黄酮收率降低。由以上技术方案可知，本发明通过优化培养条件和选择优良培养体系，以培养葛根细胞的生物技术手段来制备黄酮，收率明显高于现有乙醇浸提法、水提取法等常规方法的黄酮收率，开拓了制备黄酮的新途径。
图1所示为不同培养基黄酮收率对比试验折线图；其中，折线A代表本发明培养基的黄酮收率，折线B代表对照培养基的黄酮收率，横坐标表示时间(天)，纵坐标表示黄酮收率(％)。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。按照本发明所述方法，将葛根愈伤组织细胞接种在培养基上在23_27°C温度、800-12001x光照强度下，以每天8-12小时光照时间培养15-20天，然后分离获得黄酮；所述培养基由NH4NO3、KNO3、MgSO4 *7H20,CaCl2.2Η20,KH2PO4,FeSO4.7Η20、EDTA-Na2、K1、CoCl2.6Η20、Η3Β03、Na2MoO2.2Η20、MnSO4.H2O, CuSO4.5Η20、ZnSO4.7Η20、6_ (苄胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖、琼脂组成，pH值为5.8。其中，葛根愈伤组织细胞可采用常规细胞培养方法进行制备，如切取葛根根部外植体接种到MS培养基中进行植物组织培养，然后将切口处的愈伤组织接种到诱导愈伤组织的培养基上进行培养获得愈伤组织细胞，所述诱导愈伤组织的培养基一般由MS培养基、6-BA、NAA组成，属本领域公知。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法进行详细说明。实施例1:通过培养葛根细胞制备黄酮1、配制培养基(质量百分浓度)配制由8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水组成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水组成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水组成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水组成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的烟酸、0.0025%的盐酸吡哆醇、0.0005%的盐酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水组成的第六溶液；
分别取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(苄胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及琼脂定容至IOOOmL,其中6-(苄胺基)嘌呤浓度为10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸浓度为1.5X10_5M，蔗糖质量百分浓度为3% (即30g/1000mL培养基)，琼脂质量百分浓度为0.75% (即7.5g/1000mL培养基)，然后调PH值为5.8，分装到三角烧瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下灭菌15min，冷却凝固后即得培养基。2、制备方法葛根愈伤组织 细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上，并在25°C温度、lOOOlx光照强度下，以每天10小时光照时间(上午8时至下午6时)培养16天；收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、粉碎，然后以愈伤组织细胞:60%乙醇为lg:20mL的质量体积比，向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡40min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，滤渣进行如下步骤；以滤渣:60%乙醇为lg:20mL的质量体积比，向滤渣中加入乙醇并振荡40min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡2次；合并前述个步骤中所获得的所有滤液、浓缩并烘干，即得黄酮，收率为0.43%。实施例2:通过培养葛根细胞制备黄酮1、配制培养基(质量百分浓度)配制由 8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水组成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水组成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水组成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水组成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的烟酸、0.0025%的盐酸吡哆醇、0.0005%的盐酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水组成的第六溶液；分别取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(苄胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及琼脂定容至IOOOmL,其中6-(苄胺基)嘌呤浓度为10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸浓度为1.5X10_5M，蔗糖质量百分浓度为3% (即30g/1000mL培养基)，琼脂质量百分浓度为0.75% (即7.5g/1000mL培养基)，然后调PH值为5.8，分装到三角烧瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下灭菌15min，冷却凝固后即得培养基。2、制备方法葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上，并在26°C温度、IIOOIx光照强度下，以每天11小时光照时间(上午8时至下午7时)培养17天；
收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、粉碎，然后以愈伤组织细胞:65%乙醇为lg:25mL的质量体积比，向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡60min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，滤渣进行如下步骤；以滤渣:65%乙醇为lg:25mL的质量体积比，向滤渣中加入乙醇并振荡60min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡3次；合并前述个步骤中所获得的所有滤液、浓缩并烘干，即得黄酮，收率为0.47%。实施例3:通过培养葛根细胞制备黄酮1、配制培养基(质量百分浓度)
配制由8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水组成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水组成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水组成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水组成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的烟酸、0.0025%的盐酸吡哆醇、0.0005%的盐酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水组成的第六溶液；分别取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(苄胺基)嘌呤(即6BA)、2，4- 二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及琼脂定容至IOOOmL,其中6-(苄胺基)嘌呤浓度为10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸浓度为1.5X10_5M，蔗糖质量百分浓度为3% (即30g/1000mL培养基)，琼脂质量百分浓度为0.75% (即7.5g/1000mL培养基)，然后调PH值为5.8，分装到三角烧瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下灭菌15min，冷却凝固后即得培养基。2、制备方法葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上，并在27°C温度、12001x光照强度下，以每天12小时光照时间(上午8时至下午8时)培养18天；收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、粉碎，然后以愈伤组织细胞:70%乙醇为lg:30mL的质量体积比，向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡50min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，滤渣进行如下步骤；以滤渣:70%乙醇为lg:30mL的质量体积比，向滤渣中加入乙醇并振荡50min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡I次；合并前述个步骤中所获得的所有滤液、浓缩并烘干，即得黄酮，收率为0.47%。实施例4:通过培养葛根细胞制备黄酮1、配制培养基(质量百分浓度)配制由 8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水组成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水组成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水组成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水组成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的烟酸、0.0025%的盐酸吡哆醇、0.0005%的盐酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水组成的第六溶液；分别取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(苄胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及琼脂定容至IOOOmL,其中6-(苄胺基)嘌呤浓度为10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸浓度为1.5X10_5M，蔗糖质量百分浓度为3% (即30g/1000mL培养基)，琼脂质量百分浓度为0.75% (即7.5g/1000mL培养基)，然后调PH值为5.8，分装到三角烧瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下灭菌15min，冷却凝固后即得培养基。2、制备方法葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。
将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上，并在26°C温度、IOOOIx光照强度下，以每天10小时光照时间(上午8时至下午6时)培养19天；收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、粉碎，然后以愈伤组织细胞:75%乙醇为lg:35mL的质量体积比，向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡40min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，滤渣进行如下步骤；以滤渣:75%乙醇为lg:35mL的质量体积比，向滤渣中加入乙醇并振荡40min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡2次；合并前述个步骤中所获得的所有滤液、浓缩并烘干，即得黄酮，收率为0.48%。实施例5:通过培养葛根细胞制备黄酮1、配制培养基(质量百分浓度)配制由8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水组成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水组成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水组成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水组成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的烟酸、0.0025%的盐酸吡哆醇、0.0005%的盐酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水组成的第六溶液；分别取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(苄胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及琼脂定容至IOOOmL,其中6-(苄胺基)嘌呤浓度为10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸浓度为1.5X10_5M，蔗糖质量百分浓度为3% (即30g/1000mL培养基)，琼脂质量百分浓度为0.75% (即7.5g/1000mL培养基)，然后调PH值为5.8，分装到三角烧瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下灭菌15min，冷却凝固后即得培养基。2、制备方法葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。将葛根愈伤组织 细胞接种在灭菌后的培养基上，并在23°C温度、8001x光照强度下，以每天8小时光照时间(上午8时至下午4时)培养20天；收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、粉碎，然后以愈伤组织细胞:50%乙醇为lg:15mL的质量体积比，向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡20min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，滤渣进行如下步骤；以滤渣:50%乙醇为lg:15mL的质量体积比，向滤渣中加入乙醇并振荡20min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡3次；合并前述个步骤中所获得的所有滤液、浓缩并烘干，即得黄酮，收率为0.46%。实施例6:通过培养葛根细胞制备黄酮1、配制培养基(质量百分浓度)配制由8.25% 的 NH4N03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7H20 和余量水组成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水组成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水组成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水组成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的烟酸、0.0025%的盐酸吡哆醇、0.0005%的盐酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水组成的第六溶液；分别取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(苄胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及琼脂定容至IOOOmL,其中6-(苄胺基)嘌呤浓度为10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸浓度为1.5X10_5M，蔗糖质量百分浓度为3% (即30g/1000mL培养基)，琼脂质量百分浓度为0.75% (即7.5g/1000mL培养基)，然后调PH值为5.8，分装到三角烧瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下灭菌15min，冷却凝固后即得培养基。2、制备方法葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上，并在24°C温度、9001x光照强度下，以每天9小时光照时间(上午8时至下午5时)培养15天；收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、粉碎，然后以愈伤组织细胞:55%乙醇为lg:20mL的质量体积比，向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡30min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，滤渣进行如下步骤；以滤渣:55%乙醇为lg:20mL的质量体积比，向滤渣中加入乙醇并振荡30min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡2次；合并前述个步骤中所获得的所有滤液、浓缩并烘干，即得黄酮，收率为0.40%。实施例7:对比试验调整本发明所述培养基成分中的蔗糖更换为常规碳源-葡萄糖，同时调整MnSO4 -H2O质量百分浓度为0.1115%、盐酸硫氨素质量百分浓度为0.0025%,并且去掉6_(苄胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸，一次配方作为对照培养基进行黄酮的制备，制备方法参照实施例1，结果见表I和图1。表I不同培养基黄酮收率对比试验结果
权利要求
1.一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法，其特征在于，将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上，并在23-27°C温度、800-12001X光照强度下，以每天8-12小时光照时间培养15-20天，然后分离提取获得黄酮；所述培养基由 NH4N03、KNO3> MgSO4.7H20、CaCl2.2H20、KH2PO4, FeSO4.7H20、EDTA-Na2,K1、CoCl2.6H20、H3BO3' Na2MoO2.2H20、MnSO4.H2O, CuSO4.5H20、ZnSO4.7H20、6_ (苄胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖、琼脂组成，pH值为5.8。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养基由以下方法制备获得: 以质量百分浓度计，配制由8.25%的NH4NO3^9.50%的ΚΝ03、1.85%的MgSO4.7H20和余量水组成的第一溶液； 配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水组成的第二溶液； 配制由0.85%的KH2PO4和余量水组成的第三溶液； 配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液；配制由 0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水组成的第五溶液； 配制由0.5%的肌醇、0.0025%的烟酸、0.0025%的盐酸吡哆醇、0.0005%的盐酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水组成的第六溶液； 分别取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(苄胺基)嘌 呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖以及琼脂定容至IOOOmL,其中6-(苄胺基)嘌呤浓度为10_6M，2，4 一二氯苯氧乙酸浓度为1.5X10_5M，蔗糖质量百分浓度为3%，琼脂质量百分浓度为0.75%，然后调pH值为5.8高压灭菌后即得培养基。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述葛根愈伤组织细胞通过将葛根外植体进行培养，然后进行愈伤组织培养后获得。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述光照强度为ΙΟΟΟΙχ。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述光照时间为10小时。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述温度为25°C。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养时间为16-19天。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述分离提取获得黄酮具体为: 步骤1、收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、粉碎，然后以愈伤组织细胞:50-75%乙醇为lg:15-35mL的质量体积比，向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡20_60min，然后过滤，获得滤液和滤渣，滤液备用，滤渣进行步骤2 ； 步骤2、以滤渣:50-75%乙醇为lg: 15-35mL的质量体积比，向滤渣中加入乙醇并振荡20-60min，然后过滤，获得滤液和滤洛，滤液备用，滤洛重复本步骤1_3次； 步骤3、合并步骤I和步骤2所获得的所有滤液、浓缩并烘干，即得黄酮。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤I和步骤2所述质量体积比为lg:20mL。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤I和步骤2所述乙醇体积百分数为 60%。
全文摘要
本发明涉及细胞工程领域，具体公开了一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法。该方法将葛根愈伤组织细胞接种在培养基上在23-27℃温度、800-1200lx光照强度下，以每天8-12小时光照时间培养15-20天，然后分离获得黄酮。本发明通过优化培养条件和选择优良培养体系，以培养葛根细胞的生物技术手段来制备黄酮，收率明显高于现有乙醇浸提法、水提取法等常规方法的黄酮收率，开拓了制备黄酮的新途径。
文档编号A61P39/06GK103146637SQ201310045809
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者周天琼, 周正兵, 高留根 申请人:杭州华缔投资管理有限公司