一种治疗肿瘤的药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医药、生物【技术领域】，具体涉及一种治疗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由一种或多种自噬调节类药物和一种单抗类药物组成；本发明药物组合物中的自噬调节类药物和单抗类药物通过联合或序贯的方式使用，通过调节细胞自噬能增强单抗类药物在治疗各种肿瘤的疗效；并且通过使用细胞自噬调节类药物激活/抑制自噬能加强多种单抗类药物对淋巴瘤、胃癌、乳腺癌，肺癌，卵巢癌和脑瘤，尤其是淋巴瘤、胃癌和乳腺癌的疗效。
【专利说明】一种治疗肿瘤的药物组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药、生物【技术领域】，涉及抗肿瘤药物，具体涉及一种治疗肿瘤的药物组合物，尤其涉及由一种或多种自噬调节类药物和一种单抗类药物组成的药物组合物。
【背景技术】
[0002]目前主要用于肿瘤治疗的方法仍是化疗，然而化疗的副作用大，使得单克隆药物有了巨大的市场和需求。近年来单克隆抗体(McAb，简称单抗)治疗药物迅速发展，一些已经被应用于临床或制成诊断试剂盒、和检测试剂等。其中较为突出的是利妥昔单抗(Rituximab)、chLym-1 单抗和曲妥珠单抗(Trastuzumab)等[Bozhkov B.Monoclonal antibodies—their clinical and diagnostic importance.Vutr Boles.1987; 26 (6):1-9.];如利妥昔单抗用于临床治疗非何杰金淋巴瘤(NHL)，联合CHOP方案8个疗程治疗侵袭性(弥漫大B细胞)淋巴瘤，联合CVP方案8个疗程一线治疗惰性(滤泡性)淋巴瘤，治疗复发或化疗耐药的惰性B细胞性非何杰金淋巴瘤[Clark J, LongoD.Monoclonal antibody_therapy of leukemias and lymphomas.J Exp Pathol.1987;3(4):319-27.] ;chlym_l单抗用于治疗多种B细胞恶性淋巴瘤，且有数据表明其药效强于利妥昔单抗，该单抗对特定的HLA-DR阳性的细胞株如B-35M、Raji, Su-DHL-6等具有较明显的生长抑制作用，研究表明其主要作用机理是通过直接诱导细胞凋亡、抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)从而杀伤肿瘤细胞[LiuC， DeNardo Gj Tobin Ej et al.Antilymphoma Effects of Ant1-HLA-DR and CD20Monoclonal Antibodies (Lym-1 and Rituximab) on Human Lymphoma Cells.CancerBiother Radiopharm .2004;19 (5):545-561; Zhang N，Khawli LA, Hu P，et al.Lym-1-1nduced apoptosis of non-Hodgkin’ s lymphomas produces regression oftransplanted tumors.Cancer Biother Radiopharm.2007; 22 (3): 342-356.];曲妥珠单抗(Trastuzumab)用于治疗乳腺癌和胃癌[Tahover Ej Sonnenblick A, Peretz Tjet al.Update: adjuvant一trastuzumab一in HER2 positive breast cancer.Harefuah.2012:151 (1):37-42, 61.]等；单克隆抗体类药物具有特异性好，副作用小，作用机制较明确等优点，并能有效杀伤肿瘤细胞，然而大部分的单克隆抗体的疗效均不如化疗药物明显。
[0003]细胞自嗷(autophagy)又称II 型程序性死亡(type II programmed celldeath)，是真核生物体内常见的“自我消化”(cellular degradation)的现象，通常根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种方式:大自嗷(macroautophagy)、小自嗷(microautophagy)和分子伴侣介导的自嗷(chaperone-mediated autophagy，CM)。近年来随着分子生物学及基因技术的发展和对细胞自噬的深入认识，发现其与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切。
[0004]一般来说，由于细胞自噬有利于细胞的存活，因此无论在正常细胞或是肿瘤细胞中，自噬都普遍被保留下来，并且在一般情况下都维持着基础自噬。但是自噬究竟是抑制还是促进肿瘤细胞的发生发展目前尚没有定论。研究显示，自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因素，一些已知的肿瘤抑制因子，例如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，并且对自噬的抑制可使蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同，但是在癌变之后其自噬能力均减弱。由于自噬在肿瘤发生及发展中所起的作用尚不明确，故其在抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞过程中所起的作用也不尽相同，大致可以概括为两种:一种是对肿瘤细胞的保护，另一种则是对肿瘤细胞的杀伤。研究表明化疗药物5-FU能显著地诱导细胞自噬，且抑制由这3种药物产生的细胞自噬能显著增加肿瘤细胞对治疗的敏感性[Li J, Hou N, FariedA, Tsutsumi S， et al.1nhibition of Autophagy by 3-MA Enhances the Effect of5-FU-1nduced Apoptosis in Colon Cancer Cells.Ann Surg Oncol.2009; 16(3):761 - 771.]。目前细胞自噬的调节类药物按其对自噬的作用可以分为两类，一类是自噬诱导剂如；雷帕霉素(Rapamycin),锂盐(lithium)和海藻糖(trehalose)等,还有一类则是自曬抑制剂如:3_MA (3-Methyladenine),渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002 等，和 NH4C1、氯喹(Chloroquine)和羟基氯喹(hydroxychloroquine)等。
[0005]迄今为止，尚未见有关细胞自噬类调节药物与单克隆抗体药物制成药物组合物或复方药物联合或是序贯给药治疗肿瘤的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种治疗肿瘤的药物组合物，尤其涉及由一种或多种自噬调节类药物和一种单抗类药物组成的药物组合物。该药物组合物可以通过调控单克隆抗体类药物诱导的肿瘤细胞的细胞自噬增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而显著增强单克隆抗体类药物的疗效。
[0007]具体的，本发明提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，该药物组合物由一种或多种自噬调节类药 物和一种单抗类药物组成；该药物组合物通过调节细胞自噬能增强单抗类药物在治疗各种肿瘤的疗效；并且通过使用细胞自噬调节类药物激活/抑制自噬能加强多种单抗类药物对淋巴瘤、胃癌、乳腺癌，肺癌，卵巢癌和脑瘤，尤其是淋巴瘤、胃癌和乳腺癌的疗效。
[0008]本发明中，所述的细胞自噬调节类药物，包括细胞自噬抑制剂和细胞自噬诱导剂，其特点在于，自身无明显细胞毒性或对肿瘤有辅助杀伤作用并且能进一步通过增强/抑制细胞自噬增强所述单克隆抗体类药物对肿瘤细胞的杀伤，增强其疗效。
[0009]本发明中，细胞自噬诱导剂包括(但不限于):雷帕霉素(Rapamycin)、锂盐(lithium)和海藻糖(trehalose)等；本发明中优选雷帕霉素(Rapamycin)。
[0010]本发明中，细胞自卩遼抑制剂包括(但不限于):3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin Al)、NH4Cl、氯喹(Chloroquine)和羟基氯喹(hydroxychloroquine),本发明中优选 3-MA(3-Methyladenine)。
[0011]本发明中，所述的单克隆抗体药物包括(但不限于):chLym-1单抗,利妥昔单抗(Rituximab)和曲妥珠单抗(Trastuzumab)等。
[0012]本发明中，自噬诱导剂或自噬抑制剂中的一种或几种，如:锂盐、海藻糖和/或雷帕霉素，和/或3-MA、渥曼青霉素和/或氯喹与一种单克隆抗体组成治疗肿瘤的药物组合物。
[0013]本发明的由一种或多种自噬调节类药物和一种单抗类药物组成的药物组合物，通过联合或序贯使用其中的自噬调节类药物和单抗类药物治疗淋巴瘤、胃癌、乳腺癌，肺癌，卵巢癌和脑瘤等肿瘤；尤其是淋巴瘤、胃癌和乳腺癌；所述的淋巴瘤包括何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)。
[0014]本发明通过使用一种或者几种自噬调节类药物，包括自噬抑制剂和自噬诱导剂，与一种单克隆抗体制成复方药物或是组合物，联合给药或是序贯给药，从而加强了该单抗对肿瘤的疗效。
[0015]本发明进行了抑制肿瘤细胞体外实验，结果证实，所述的药物组合物能通过增强/抑制细胞自噬增强单克隆抗体类药物对肿瘤细胞的杀伤，增强其疗效。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:chLym-l单抗能显著诱导Raji细胞的LC3_ II表达量上调，
其中,A:经过10 μ g/ml的chLym_l单抗处理24小时后的Raji细胞的LC3_ II蛋白的表达；B:LC3-1I蛋白在经过/未经过O μ g/ml的chLym_l单抗处理的Raji细胞中表达量的统计结果。
[0017]图2:激光共聚焦显微镜视野下的经过chlym-1处理48小时的Raji细胞与对照组Raji细胞。 [0018]图3:chLym-1单抗能显著诱导Raji细胞细胞内的自曬体聚集。
[0019]图4:经过chLym-Ι干预不同时间后Raji细胞中细胞自曬各通路相关蛋白的表达。
[0020]图5:经过不同浓度chLym-Ι干预后Raji细胞中细胞自噬各通路相关蛋白的表达。
[0021]图6:抑制MEK/Erk通路不能抑制chLym_l单抗诱导的细胞自噬。
[0022]图7:通过3-MA抑制自噬能抑制chLym-Ι单抗对Raji细胞的杀伤作用。
[0023]图8:通过NH4Cl抑制自噬能抑制chLym-Ι单抗对Raji细胞的杀伤作用。
[0024]图9:通过雷帕霉素诱导细胞自噬能进一步增强chLym-Ι对Raji细胞的杀伤作用。
[0025]图10:3-MA能显著抑制chLym-Ι单抗诱导的Raji细胞中自噬相关蛋白LC3-1I的增加。
[0026]图1l = NH4Cl能显著增加Raji细胞中自噬相关蛋白LC3-1I的表达。
[0027]图12:雷帕霉素能显著增强Raji细胞中的自噬相关蛋白LC3-1I的表达。
[0028]图13:抑制细胞自噬能抑制chLym-Ι单抗介导的对Raji细胞的⑶C效应。
[0029]图14:3-MA抑制细胞自噬能抑制chLym_l单抗介导的对Raji细胞的ADCC作用。
[0030]图15:抑制细胞自噬能显著减弱chLym-Ι单抗诱导的Raji细胞的细胞凋亡。
[0031]图16:利妥昔单抗能显著地诱导Raji细胞发生细胞自噬。
[0032]图17:自噬抑制剂3-MA和NH4Cl能增强利妥昔单抗诱导的细胞死亡。
[0033]图18:曲妥珠单抗能诱导SKBR3细胞和N87细胞发生细胞自噬。
[0034]图19:抑制细胞自噬能显著增强曲妥珠单抗诱导的SKBR3细胞的生长抑制。[0035]图20:抑制细胞自噬能显著增强曲妥珠单抗诱导的N87细胞的生长抑制。
[0036]【具体实施方式】
[0037]单抗母液的制备:称取IOmg chLym-Ι单抗的冻干粉，溶于Iml 0.02M pH=7.4的PBS溶液中。充分搅拌并用0.1ym无菌滤器过滤。分装成10管保存。体外试验时稀释至10 μ g/mlο
[0038]利妥昔单抗母液的制备:称取IOmg利妥昔单抗的冻干粉，溶于Iml 0.02M pH=7.4的PBS溶液中。充分搅拌并用0.1ym无菌滤器过滤。分装成10管保存。体外试验时稀释至 10 μ g/mlO
[0039]曲妥珠单抗母液的制备:称取IOmg曲妥珠单抗的冻干粉，溶于Iml 0.02M pH=7.4的PBS溶液中。充分搅拌并用0.1ym无菌滤器过滤。分装成10管保存。体外试验时稀释至 10 μ g/mlO
[0040]自噬抑制剂药物配置
(1)氯喹溶液的配制:取适量氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬
(2)氯化铵溶液的配制:取适量氯化铵溶于水配成0.4mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于4°C。体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬。
[0041](3)3-MA溶 液的配制:取适量3-MA溶于无菌水配制成200mM的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于-20°C。体外实验时稀释至2mM用于抑制细胞自噬。
[0042]自噬诱导剂药物配置
(I)雷帕霉素溶液的配制:将适量雷帕霉素溶解于DMSO中，配成I μ mol/L的储存液，保存于_20°C，使用时稀释至5nM-20nM用于激活细胞自噬。
[0043](2)锂盐的配制:称取适量LiCl溶于无菌水配制成400mM的储存液，使用0.1 μ m的无菌滤器过滤除菌后并保存于4°C。使用时稀释至5mM用于激活细胞自噬。
[0044](3)海藻糖溶液的配制:称取海藻糖溶于去离子水配制成400mM的储存液，使用0.1ym的无菌滤器过滤除菌后并保存于4°C。使用时稀释至20mM-40mM用于激活细胞自噬。
[0045]细胞培养:细胞生长至对数生长期后，以5*105cellS/ml的浓度转入细胞培养板内培养，各组细胞分别给予0-10 μ g/ml的chLym-ι单抗、利妥昔单抗或曲妥珠单抗,并在给药前Ih加入20 μ mol/L的氯喹，5mmol/L的NH4C1或IOnM的雷帕霉素用于抑制或激活Raji细胞的细胞自噬。连续培养48h，以1000r/min离心收集细胞。
[0046]
实施例1 chLym-Ι单抗诱导Raji细胞的LC3-1I表达量上调
收集经过10 μ g/ml的chLym-ι单抗处理了 24h的Raji细胞与对照组Raji用WesternBlot和IP裂解液裂解抽取细胞总蛋白，进行蛋白定量，按每孔50 μ g蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果如图1所示:经过10 μ g/ml chLym-1单抗处理了 24h的Raji细胞自噬相关蛋白LC3 II的表达量高于对照组，并经过灰度处理软件IQuentTL分析发现两者具备极显著的差异(/7〈0.01)，由于LC3 II的表达量与自噬体的数量现正相关性，LC3 II的表达量越高，细胞自噬也就越活跃；结果表明，chLym-1单抗能显著地诱导Raji细胞发生细胞自曬；
通过将10 μ g/ml chLym-1单抗处理48h的Raji细胞与对照组Raji细胞用Cyto-1D自噬体相关蛋白LC3-1I蛋白染色试剂染色后通过在激发波长在560nm的激光共聚焦显微镜下观察，结果显示:经过10 μ g/ml chLym-Ι单抗处理了 48h的Raji细胞的细胞质内存在更多的绿色荧光斑点(如图2所示);绿色荧光斑点的多少取决于自噬体相关蛋白LC3-1I的表达水平，与对照组相比，chLym-Ι单抗显著地诱导了 Raji细胞的LC3-1I表达量上调。
[0047]
实施例2 chLym-Ι单抗诱导Raji细胞细胞内的自噬体聚集收集经过chLym-Ι单抗干预24h的Raji细胞进行固定、包埋、切片、染色后在电子显微镜下观察其超微结构，结果显示:对照组的Raji细胞核完整，呈正常的圆形，而经过10 μ g/ml chLym-1单抗干预了 24h的Raji细胞细胞核严重变形,在8000 X的放大倍数下,在核外区域发现很多空泡样结构，在50000X的倍数下，可以清晰地见到大量明显的双层膜结构(如图3所示)，根据文献报道，自噬体的直径一般在300多纳米到数微米之间，与本实施例图中所示的双层膜结构空泡的大小吻合，经分析确证箭头所指的双层膜样的空泡为自噬体，相比对照组细胞，在10 μ g/ml chLym-1诱导Raji细胞发生明显的细胞自噬。
[0048]
实施例3 chLym-Ι调控Akt/mTOR，MEK/Erk通路并诱导细胞自噬用10 μ g/ml的chLym-Ι单抗处理的Raji细胞与对照组Raji用Western Blot和IP裂解液裂解抽取细胞总蛋白，进行蛋白定量，按每孔60 yg蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果显示(如图4，5所示):经过不同时间的和不同浓 度的chLym-Ι单抗处理后Raji细胞中的p-mT0R,p-Akt的表达量减弱，此外P-TSC2和P-4E-BP1的表达量增强，提示chLym-Ι单抗的作用能下调mTOR信号通路的活性，此外P-Erk的表达量也有所增强，表明chLym-Ι单抗能上调MEK/Erk通路的活性；经不同时间和不同浓度的chLym-Ι单抗处理后Raji细胞中LC3-1I的表达量均有所增强，表明chLym-Ι单抗诱导了细胞自噬；用U0126对MEK/Erk信号通路抑制后检测抑制MEK/Erk通路后Raji细胞中LC3-1I的表达量，结果显示:抑制MEK/Erk信号通路的激活并不能减弱chLym-Ι单抗诱导的Raji细胞中的LC3-1I表达量的增加(如图6所示)。证明MEK/Erk信号通路不参与chLym-Ι诱导的细胞自曬的调控。
[0049]
实施例4
抑制细胞自曬能抑制chLym-Ι单抗诱导的细胞死亡,激活细胞自曬能增强chLym_l单抗诱导的细胞死亡，
将各组Raji细胞于96孔细胞板内连续培养48h后直接加入10 μ IMTT反应液，37°C避光孵育4h待MTT与细胞内琥珀酸脱氢酶充分反应生成甲瓒后加入三联液(50%DMF、20%SDS的水溶液)裂解细胞，37°C孵育6h溶解甲瓒，于570nm处测定各组的0.D值，以对照组的0.D.为100%进行细胞活力百分比换算，并用SPSS statistics 19进行统计学分析；采用10 μ g/ml的chLym-ι单抗干预Raji细胞,并在给药前Ih加入3-MA或NH4Cl抑制Raji细胞的细胞自噬或雷帕霉素激活细胞自噬，连续培养48h后采用MTT法测定细胞活力，结果显示，与对照组相比，经过10 μ g/ml chLym-1单抗干预的Raji细胞的细胞活力有显著性下降ip<Q.01)，加入自噬抑制剂3-MA和NH4Cl的Raji细胞的细胞活力与单纯chLym-Ι单抗干预的Raji细胞的细胞活力相比，有显著性提高0X0.05，/7〈0.01)(如图7，8和图9所示)，证明自曬抑制剂和chLym-Ι单抗的联合给药会削弱chLym_l单抗的药效,并且只加抑制剂3-MA和NH4Cl的组的细胞活力与对照组相比，无显著差异，说明抑制剂本身对细胞生长无明显促进作用，结果表明，自噬抑制剂和chLym-Ι单抗的联合给药所增加的Raji细胞的细胞活性并非是抑制剂和药物的协同作用所致，而是抑制自噬后减弱了 chLym-Ι单抗对Raji细胞的杀伤；加入自噬诱导剂雷帕霉素的Raji细胞的细胞活力与单纯chLym-Ι单抗干预的Raji细胞的细胞活力相比，有显著下降0X0.05)，表明增强自噬能增加chLym-Ι对Raji细胞的杀伤作用。
[0050]
实施例5抑制和诱导自噬后自噬相关蛋白LC3 II的表达水平检测各组Raji细胞经过离心收集后用RIPA裂解液裂解抽取细胞总蛋白，定量后按每孔50 yg蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果3-MA能显著抑制chLym-Ι单抗诱导的Raji细胞中自噬相关蛋白LC3-1I的增加，NH4Cl能显著增加Raji细胞中自噬相关蛋白LC3-1I的表达，雷帕霉素能显著增强Raji细胞中的自噬相关蛋白LC3-1I的表达(如图10，图11和图12所示)；经过IOyg/ml chLym-1单抗处理的Raji细胞的LC3 II的表达量均高于对照组,经过2mmol/L 3-MA或lmmol/L 3-MA和10μg/ml chLym-Ι单抗处理后的Raji细胞的LC3 II的表达量低于10 μ g/ml chLym-Ι单抗处理后的Raji细胞,而经过10 μ g/ml chLym_l单抗和5mmol/L NH4Cl或2.5mmol/L NH4Cl处理后的Raji细胞的LC3 II的表达量高于10 μ g/ml chLym-1单抗处理后的Raji细胞,且经过5nmol/L或10nmol/L雷帕霉素和10 μ g/ml chLym-Ι单抗处理后的Raji细胞的表达量要高于10 μ g/ml chLym-1单抗处理后的Raji细胞，结果表明3-MA和NH4C1能有效抑制chLym-Ι单抗诱导的Raji细胞的细胞自噬，而雷帕霉素能进一步增强chLym-1单抗诱导的Ra ji细胞的细胞自卩遼。
[0051]
实施例6抑制细胞自噬能抑制chLym-Ι单抗介导的对Raji细胞的CDC效应各实验组Raji细胞加入人血清及chLym-Ι单抗后连续培养2h后用MTT法测定细胞存活，与对照组相比，经过10 μ g/ml chLym-1单抗和5 μ I血清干预的Raji细胞的细胞活力有显著性下降，并且加入2mmol/L 3-MA或5mmol/L NH4Cl抑制细胞自噬的Raji细胞的细胞的活力与单纯10 μ g/ml chLym-1单抗和5μ I血清干预的Raji相比，有显著性提高(/7〈0.05)(如图13所示),结果证明了在chLym-Ι单抗介导⑶C杀伤Raji细胞的过程中，抑制细胞自噬能促进Raji细胞的存活，抑制细胞自噬能削弱在chLym-Ι单抗介导的CDC效应，诱导自噬能提高chLym-Ι在淋巴瘤细胞中介导的CDC效应。
[0052]
实施例7抑制细胞自噬能抑制chLym-Ι介导的对Raji细胞的ADCC效应各实验组Raji细胞(靶细胞)加入人单个核细胞(效应细胞)及chLym-Ι单抗后连续培养5h后用CytoTox 96试剂盒测定细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放，结果如图14所示:各效靶比组的chLym-Ι单抗组的乳酸脱氢酶(LDH)释放量显著高于对照组，并呈现出良好的效应细胞数量比的依赖性，证明chLym-Ι单抗在Raji细胞中诱导了显著的ADCC效应(/7〈0.05)，并且在加入PI3K抑制剂2mmol/L 3-MA抑制细胞自噬后，与chLym-Ι比较，乳酸脱氢酶(LDH)的释放量明显减少(/7〈0.05,/7<0.01)，证明自噬抑制剂3-MA抑制了 chLym-Ι单抗在Raji细胞中介导的ADCC作用，提示增强自卩遼能增强chLym-Ι单抗在淋巴瘤细胞中介导的ADCC作用。
[0053]实施例8抑制细胞自噬能减弱chLym-Ι单抗诱导的Raji细胞的细胞凋亡 各组Raji细胞分别给予O μ g/ml和10 μ g/ml chLym-1单抗，并在给药前Ih加入
2mmol/L的3-MA和 5mmol/L的NH4Cl抑制Raji细胞的细胞自嗤，连续培养48h后使用细胞凋亡检测试剂盒进行Annexin V和PI染色后通过流式细胞术检测处理后的Raji细胞，结果显示，抑制细胞自曬能显著减弱chLym-Ι单抗诱导的Raji细胞的细胞凋亡(如图15所示),经10 μ g/ml chLym-1单抗干预的Raji细胞的Anexin V +的细胞比例显著高于对照组，10 μ g/ml chLym-1 单抗 +2mmo1 /T, 3-MA 组和 10 μ g/ml chLym-1 单抗 +5mmol/L 的 NH4Cl组的Raji细胞的Anexin V阳性细胞比例显著低于单纯10 μ g/ml chLym-1单抗干预的Raji 细胞，10 μ g/ml chLym-1 单抗 +2mmo1 /T, 3-MA 组和 10 μ g/ml chLym-1 单抗 +5mmol/L的NH4Cl组的Raji细胞PI+细胞比例与10 μ g/ml chLym-1干预的Raji细胞相比，无明显差异，表明抑制Raji细胞自噬能削弱chLym-Ι单抗所诱导的细胞凋亡。
[0054]
实施例9利妥昔单抗能诱导Raji细胞发生细胞自噬
收集经10 μ g/ml的利妥昔单抗处理24h的Raji细胞与对照组Raji细胞用WesternBlot和IP裂解液裂解抽取细胞总蛋白，进行蛋白定量，按每孔50 μ g蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot,用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果显示利妥昔单抗能显著地诱导Raji细胞发生细胞自噬(如图16所示):经过10μ g/ml利妥昔单抗处理24h的Raji细胞自噬相关蛋白LC3 II的表达量高于对照组，由于LC3 II的表达量与自噬体的数量现正相关性，LC3 II的表达量越高，细胞自噬就越活跃，表明利妥昔单抗能显著地诱导Raji细胞发生细胞自噬。
[0055]
实施例10抑制细胞自噬能增强利妥昔单抗诱导的Raji细胞的细胞死亡将各组Raji细胞于96孔细胞板内连续培养48h后直接加入10 μ IMTT反应液，37°C避光孵育4h待MTT与细胞内琥珀酸脱氢酶充分反应生成甲瓒后加入三联液(50%DMF、20%SDS的水溶液)裂解细胞，37°C孵育6h溶解甲瓒，于570nm处测定各组的0.D值，结果显示自噬抑制剂3-MA和NH4Cl能增强利妥昔单抗诱导的细胞死亡(如图17所示):与对照组相比，经10 μ g/ml利妥昔单抗干预的Raji细胞的细胞活力有显著性下降01),加入自曬抑制剂3-MA和NH4Cl的Raji细胞的细胞活力与单纯利妥昔单抗干预的Raji细胞的细胞活力相比，有显著性降低(/7〈0.05，p<0.01)，证明自噬抑制剂和利妥昔单抗的联合给药会增强利妥昔单抗的药效，并且只加抑制剂3-MA和NH4Cl的组的细胞活力与对照组相比，无显著差异，说明抑制剂本身对细胞生长无明显抑制作用，自噬抑制剂和利妥昔单抗的联合给药所增加的对Raji细胞的杀伤作用并非是抑制剂和药物的协同作用所致，而是抑制自噬后增强了利妥昔单抗对Raji细胞的杀伤。
[0056]
实施例11曲妥珠单抗能诱导SKBR3和N87细胞发生细胞自噬收集经10 μ g/ml的曲妥珠单抗处理48h的SKBR3细胞和N87细胞与对照组细胞用Western Blot和IP裂解液裂解抽取细胞总蛋白，进行蛋白定量，按每孔50 μ g蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot,并用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果显示，曲妥珠单抗能诱导SKBR3细胞和N87细胞发生细胞自噬(如图18所示):经过10 μ g/ml曲妥珠单抗处理了 24h的SKBR3细胞和N87细胞的细胞自噬相关蛋白LC3 II的表达量均高于对照组，由于LC3 II的表达量与自噬体的数量现正相关性，LC3 II的表达量越高，细胞自噬也就越活跃，曲妥珠单抗能显著地诱导SKBR3细胞和N87细胞发生细胞自噬。
[0057]
实施例12抑制细胞自噬能增强曲妥珠单抗对SKBR3细胞和N87细胞的杀伤经96h曲妥珠单抗和细胞自噬抑制剂3-MA或NH4Cl的处理后，SKBR3细胞和N87的细胞活力经过MTT法检测，结果显示，抑制细胞自噬能显著增强曲妥珠单抗诱导的SKBR3细胞或N87细胞的生长抑制(如图19，20所示):与对照组相比，曲妥珠单抗在作用于N87细胞和SKBR3细胞96h后，均能显著诱导细胞生长抑制，3-MA或NH4Cl与曲妥珠单抗的联合给药能进一步增强曲妥珠单抗对N87细胞和SKBR3细胞的杀伤效果(/7〈0.05，/7〈0.01 )，证明抑制自噬能显著增强曲妥珠单 抗对乳腺癌SKBR3细胞和胃癌N87细胞的杀伤作用。
【权利要求】
1.一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，该药物组合物由一种或多种自噬调节类药物和一种单抗类药物组成；所述的细胞自噬调节类药物包括细胞自噬抑制剂和细胞自噬诱导剂。
2.按权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬诱导剂选自雷帕霉素(Rapamycin)、锂盐(lithium)或海藻糖(trehalose)。
3.按权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬诱导剂是雷帕霉素(Rapamycin)。
4.按权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin Al)、NH4Cl、氯喹(Chloroquine)或羟基氯喹(hydroxychloroquine)。
5.按权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂是 3-MA (3-Methyladenine)。
6.按权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的单抗类药物选自chLym-1单抗,利妥昔单抗(Rituximab)或曲妥珠单抗(Trastuzumab)。
7.按权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，该药物组合物中的自噬调节类药物和单抗类药物通过联合或序贯的方式使用。
8.按权利要求1-7任一的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤选自淋巴瘤、胃癌、乳腺癌， 肺癌，卵巢癌或脑瘤。
9.按权利要求1-7任一的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤选自淋巴瘤，胃癌或乳腺癌。
10.按权利要求8或9所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的淋巴瘤是何杰金淋巴瘤(HL)或非何杰金淋巴瘤(NHL)。
11.权利要求1的药物组合物在制备治疗肿瘤的单克隆抗体增效药物中的用途。
【文档编号】A61K39/395GK103990127SQ201310052018
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年2月17日 优先权日:2013年2月17日
【发明者】鞠佃文, 范佳君, 曾贤, 王绍飞, 李玉彬, 王子玉 申请人:复旦大学