专利名称：一种基于稀土金属化合物纳米簇的合成方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及稀土金属化合物纳米簇的合成和成像领域，具体涉及稀土金属化合物纳米簇的合成方法及应用。
背景技术：
随着现代科技的发展，成像技术引起了科学家广泛的兴趣，被应用于活体成像的研究中并取得了令人瞩目的成果。Hayashi等利用荧光标记肿瘤细胞建立的小动物肿瘤模型和实时荧光成像系统，开展了一系列实验。RobertMH通过体内荧光蛋白标记肿瘤细胞和高分辨率的小动物荧光显像系统则有可能观察到肿瘤的转移过程。但是这种技术仍然存在许多局限性，尤其是在体内光照时产生的组织自发荧光和在断波激发光照射下的弱的组织渗透性。为了克服这些困难，科学家研究了一系列发光纳米材料，它们适用于活体成像并能避免内在问题，这种技术的关键是要求纳米发光材料的发射光是在近红外区域。纳米颗粒已经被作为发光探针用于光学成像，但是存在许多缺点:首先，来自组织有机组成的自发荧光能导致弱的信噪比；另外，很难实现深度组织成像，因为内部组织的信号衰弱探针的发射光波长要调整到组织透明的条件。在此波长下，光的衰弱主要是由于光散射而不是被组织吸收，近红外荧光纳米颗粒的使用目前正在探索中，把它与目标分子结合就有可能制成高灵敏的近红外荧光成像造影剂。
发明内容
发明目的:本发明的目的是提供了稀土金属化合物纳米簇的合成方法及稀土金属化合物纳米簇可作为活体肿瘤影像剂以及其他生物医学方面的应用。技术方案:针对目前现有技术的缺陷，本发明提供了一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法，包括以下步骤:
I)将浓度为0.01-lmg/ml的镧试剂和0.01-lmg/ml铕试剂混合溶液与肿瘤细胞在细胞培养箱中37°C，含有5%C02共同孵育10-72小时合成稀土金属化合物纳米簇；2)用荧光光谱仪、共聚焦荧光显微镜等对稀土金属化合物纳米簇进行定性和定量分析；所述镧试剂是氯化镧、硝酸镧、柠檬酸镧、碳酸镧、醋酸镧或硫酸镧中的一种。所述铕试剂是硝酸铕、硫酸铕、氯化铕、氟化铕、碳酸铕、醋酸铕中的一种。所述肿瘤细胞为肝癌、肺癌、宫颈癌、白血病、骨肉瘤等肿瘤细胞株。上述方法制备的稀土金属化合物纳米簇进行肿瘤靶向成像的方法，包括以下步骤:I)构建裸鼠肿瘤模型；2)将所述的稀土金属化合物纳米簇超声分散后通过注射方法，注射到裸鼠肿瘤模型上，在裸鼠肿瘤模型上实现原位、实时肿瘤靶向高分辨成像；3)用活体荧光成像仪对肿瘤部位进行肿瘤成像并对其进行定性及定量分析。
上述步骤2)中的注射方法为尾静脉注射、局部注射或穴位注射。上述步骤3)中的肿瘤成像为荧光成像、核磁成像、拉曼成像、CT成像、热成像或超声成像。上述方法制备的稀土金属化合物纳米簇在肿瘤靶向活体成像中的应用。有益效果:(I)将一定浓度的氯化镧和硝酸铕混合溶液与相关的细胞在一定条件下共同孵育合成纳米簇，共聚焦显微镜检测表明荧光明显增强。(2)将肿瘤细胞合成的稀土金属化合物纳米簇超声分散后通过注射方法，在移植肿瘤裸鼠等动物模型上实现了原位、实时肿瘤靶向性高分辨成像。活体荧光成像仪等检测表明具有很好的靶向成像效果。本发明发现和研制了镧、铕等稀土金属离子靶向肿瘤细胞合成生物相容性良好的纳米簇探针，实现了活体肿瘤部位的高分辨率成像。由于该方法具有操作方便、结果直观、灵敏度高、靶向性强等优点可以对肿瘤进行早期检测与诊断，也可以应用在深部肿瘤、大动物等活体肿瘤追踪观察成像等研究中，具有潜在的临床疾病追踪治疗成像的应用价值。由于镧、铕等稀土金属化合物纳米簇成像为本研究组在细胞内和动物活体内首次合成并用于成像检测。因此国内外专利及其他文献没有涉及该发明的有关报道。该发明可实现无损伤、原位、实时肿瘤早期检测与诊断及荧光、拉曼、超声、CT和核磁等成像，可进行多形态与多模态的同步检测，具有广阔的医学应用前景。
图1是本发明实施例1实验组共聚焦荧光显微镜结果图；图2是本发明实施例1对照组共聚焦荧光显微镜结果图；图3是实验组合对照组荧光强度对比图
图4是不同硝酸铕浓度配比所得纳米簇荧光强度5是硝酸铕和氯化镧摩尔比为1/19时所得纳米簇荧光强度图
具体实施例方式实施例1一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法，包括以下步骤:I)将1/17、1/18、1/19、1/20、1/21、1/22、1/23等不同浓度配比的硝酸铕和氯化镧
混合溶液与肝癌细胞在细胞培养箱中37°C，含有5%C02共同孵育10小时合成稀土金属化合物纳米簇；2)用荧光光谱仪对稀土金属化合物纳米簇进行定量分析；选用肝癌细胞(!fepG2)作为研究对象，实验组将处于对数生长期的肝癌细胞(H印G2)按照1.6X 105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养24h后加入已灭菌并用新鲜无菌的DMEM培养基进行稀释的含有不同浓度配比的氯化镧和硝酸铕混合溶液在细胞培养箱中共同孵育10小时合成稀土金属化合物纳米簇。培养时间终止后向每孔加入磷酸缓冲溶液(PBS，pH=7.4)冲洗2-3次。将所得细胞收集超声破碎，1000转离心10分钟，然后用荧光光谱仪对稀土金属化合物纳米簇进行检测。实验结果如图4所示，氯化镧和硝酸铕不同浓度比下的荧光强度，当氯化镧和硝酸铕的浓度比为19:1时，合成的稀土金属化合物纳米簇具有较强的荧光。图5为硝酸铕和氯化镧摩尔比为1:19时在不同波长下所得纳米簇荧光强度图，从图中可以看出当730nm时，荧光强度最强。实施例2一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法，包括以下步骤:I)将浓度为lmg/ml的氯化镧和0.01mg/ml硝酸铕混合溶液与肝癌细胞在细胞培养箱中37°C，含有5%C02共同孵育10小时合成稀土金属化合物纳米簇；2)用荧光光谱仪、共聚焦荧光显微镜等对稀土金属化合物纳米簇进行定性和定量分析；选用肝癌细胞(!fepG2)作为研究对象，实验组将处于对数生长期的肝癌细胞(H印G2)按照1.6X 105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养24h后加入已灭菌并用新鲜无菌的DMEM培养基进行稀释的含有浓度为0.0 lmg/ml的氯化镧和lmg/ml硝酸铕混合溶液。对照组将培养基中的肝癌细胞(IfepG2)按照1.6X105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养24h。培养时间终止后向实验组和对照组的每孔加入磷酸缓冲溶液(PBS, pH=7.4)冲洗2-3次。然后用共聚焦显微镜进行观察检测。实验组实验结果如图1所示，对照组实验结果如图2所示。图1所示细胞具有较强荧光，在细胞内部具有纳米颗 粒聚集，图2所示细胞没有明显荧光。二者荧光强度比较如图3所示。实施例3一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法，其特征在于包括以下步骤:I)将浓度为lmg/ml的氯化镧和0.0 lmg/ml硝酸铕混合溶液与乳腺癌细胞在细胞培养箱中37°C，含有5%C02共同孵育24小时合成稀土金属化合物纳米簇；2)用荧光光谱仪、共聚焦荧光显微镜等对稀土金属化合物纳米簇进行定性和定量分析；构建裸鼠皮下接种乳腺癌模型，乳腺癌细胞培养24h后加入已灭菌并用新鲜无菌的DMEM培养基进行稀释过的氯化镧和硝酸铕混合溶液，于细胞培养箱中孵育24小时制得稀土金属化合物纳米簇，将含有稀土金属化合物纳米簇的溶液超声分散后，通过尾静脉注射方法注射到裸鼠体内，24h后，对裸鼠进行活体荧光成像。实验表明相关纳米簇可对肿瘤部位实现靶向成像，一定浓度稀土金属化合物纳米簇可对肿瘤部位实现高分辨快速靶向成像。实施例5一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法，其特征在于包括以下步骤:I)将浓度为0.5mg/ml的硫酸镧和0.5mg/ml氯化铕混合溶液与肺癌细胞在细胞培养箱中37°C，含有5%C02共同孵育72小时合成稀土金属化合物纳米簇；2)用荧光光谱仪、共聚焦荧光显微镜等对稀土金属化合物纳米簇进行定性和定量分析；构建裸鼠皮下接种肺癌模型，肺癌细胞培养72h后加入已灭菌并用新鲜无菌的DMEM培养基进行稀释过的硫酸镧和氯化铕混合溶液，于细胞培养箱中孵育72小时制得稀土金属化合物纳米簇，将含有稀土金属化合物纳米簇的溶液超声分散后，通过尾静脉注射方法注射到裸鼠体内，72h后，对裸鼠进行活体荧光成像。实验表明相关纳米簇可对肿瘤部位实现靶向成像，一定浓度稀土金属化合物纳米簇可对肿瘤部位实现高分辨快速靶向成像。实施例6构建裸鼠药物诱导卵巢肿瘤模型，向裸鼠体内通过尾静脉注射方法直接注射制得的稀土金属化合物纳米簇0.lmmol/ml，24h后，对裸鼠进行靶向荧光成像并对成像结果进行定性及定量分析。因为稀土金属纳米簇在近红外区域发荧光，能制成高灵敏的近红外荧光成像造影剂。本发明的一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法只有在一定的摩尔配比下才能制得较强的近红外荧光纳米簇，该纳米簇是首次在肿瘤细胞内合成，所制得的纳米簇可以在近红外区域有较强荧光，所以能制成高灵敏的近红外荧光成像造影剂。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范 围。
权利要求
1.一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将浓度为0.01-lmg/ml的镧试剂和0.01-lmg/ml铕试剂混合溶液与肿瘤细胞在细胞培养箱中37°C，含有5%C02共同孵育10-72小时合成稀土金属化合物纳米簇； 2)用荧光光谱仪、共聚焦荧光显微镜等对稀土金属化合物纳米簇进行定性和定量分析。
2.如权利要求1所述的一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法，其特征在于:所述镧试剂是氯化镧、硝酸镧、柠檬酸镧、碳酸镧、醋酸镧或硫酸镧中的一种。
3.如权利要求1所述的一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法，其特征在于:所述铕试剂是硝酸铕、硫酸铕、氯化铕、氟化铕、碳酸铕、醋酸铕中的一种。
4.如权利要求1所述的一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法，其特征在于:所述肿瘤细胞为肝癌、肺癌、宫颈癌、白血病、骨肉瘤等肿瘤细胞株。
5.权利要求1-4任意一项所述的方法制备的稀土金属化合物纳米簇进行肿瘤靶向成像的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)构建裸鼠肿瘤模型； 2)将所述的稀土金属化合物纳米簇超声分散后通过注射方法，注射到裸鼠肿瘤模型上，在裸鼠肿瘤模型上实现原位、实时肿瘤靶向高分辨成像； 3)用活体荧光成像仪对肿瘤部位进行肿瘤成像并对其进行定性及定量分析。
6.如权利要求5所述的肿瘤靶向成像的方法，其特征在于所述步骤2)中的注射方法为尾静脉注射、局部注射或穴位注`射。
7.如权利要求5所述的肿瘤靶向成像的方法，其特征在于所述步骤3)中的肿瘤成像为突光成像、核磁成像、拉曼成像、CT成像、热成像或超声成像。
8.权利要求1-4任意一项所述的方法制备的稀土金属化合物纳米簇在肿瘤靶向活体成像中的应用。
9.权利要求1-4任意一项所述的方法制备的稀土金属化合物纳米簇在制备造影剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种稀土金属化合物纳米簇的合成方法及该稀土金属化合物纳米簇在肿瘤等病变部位靶向成像方面和制备造影剂中的应用。本发明制得的稀土金属化合物纳米簇粒径小、渗透性好、荧光稳定性高、灵敏度高、靶向性强，可以实现对肿瘤的精确定位；本发明的稀土金属化合物纳米簇通过生物肿瘤细胞直接合成，具有很好的生物相容性；本发明操作方便、结果直观，可进行多形态与多模态的同步分析检测，具有广阔的医学应用前景。
文档编号A61K49/22GK103143037SQ20131006733
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者王雪梅, 高生平, 李水红 申请人:东南大学