c-Met抗体的组合物和使用方法

专利名称：c-Met抗体的组合物和使用方法
技术领域：
本发明涉及包含特异性结合蛋白质靶标c-Met的抗体的组合物，制备这些抗体的方法，以及治疗增生性病症(例如癌症和转移)以及炎症的使用方法。
背景
肝细胞生长因子受体，本文称作c-Met，是一种受体酪氨酸激酶，其已经被证明在多种恶性肿瘤中过表达和/或突变，特别地，在多种实体期肿瘤中发现许多c-Met突变。c-Met配体，肝细胞生长因子(HGF)，也称作分散因子(SF)，以涉及肿瘤细胞入侵和转移的途径结合 c-Met (Ma 等，2003, Cancer and Metastasis Reviews., 22:309_325)。
HGF与c-Met的相互作用起始一连串细胞内事件(Derman等，1996, J BiolChem23 ;271(8):4251_4255)。HGF的结合导致c-Met内在酪氨酸激酶活性的激活和细胞内结构域上若干酪氨酸残基的自体憐酸化(Ma等,2003, Cancer and Metastasis Reviews.,22:309-325)。HGF/c-Met途径的激活导致广泛的细胞应答，包括细胞分散、血管发生、增殖、细胞运动性提高、侵入和转移。拮抗作用可以起抑制自体磷酸化和/或诱导表面c-Met的内在化和/或下调c-Met活性的作用。
肿瘤细胞可以侵入组织边界，降解和重构周围的细胞外基质，从而使得肿瘤细胞可以通过细胞外基质组织边界迁移，允许传播和形成转移。HGF/c-Met信号是介导正常和恶性侵入生长的途径。已经在多种癌症中鉴定出c-Met的错义突变，大多数突变位于激酶结构域中。突变体的特征是酪氨酸激酶活性提高，由此促进c-Met的生物学作用。
需要治疗癌症，癌症转移和炎症的组合物和方法，例如干扰HGF/c-Met fg号途径的药剂，在所述信号途径中c-Met活性有助于侵入和/或转移。
发明概沭
受体酪氨酸激酶C-Met涉及迁移、侵入和形态发生的过程，其伴随着胚胎发生和组织再生。若干条证据已经表明c-Met还在肿瘤发病中发挥作用。c-Met激酶结构域内种系突变的激活与遗传性乳突状肾细胞癌(PRCC)的发病相关联。虽然数量很少，但是在个别形式的PRCC中，头颈鳞状细胞癌中和在胃癌中也已经报道了激酶结构域内的突变。在多种临床相关肿瘤中以 高频率观察到c-Met与其独特配体HGF/SF —起被提高的水平。表达增加与疾病进程、转移和患者死亡率之间的关联已经在若干种癌症中报道，包括膀胱、乳腺和胃癌、平滑肌肉瘤和成胶质细胞瘤。
本发明抗体以高亲和性特异性结合C-Met并调节疾病的C-Met作用。期望将拮抗c-Met水平或活性的抗体用于治疗增生性疾病或炎性疾病。据认为可以通过本发明抗体治疗的增生性疾病尤其包括癌症。期望将激活c-Met水平或活性的抗体用于器官再生、伤口愈合、组织再生等等。
本发明的实施方案提供选择性结合C-Met蛋白的抗体，或这种抗体的免疫活性部分或功能性抗体片段。在一个实施方案中所述抗体或这种抗体的免疫活性部分来自哺乳动物，其具有例如啮齿动物，人或骆驼科(camelid)动物的来源，或者是人源化抗体。在特定实施方案中，抗c-Met抗体的特征是具有对于靶蛋白c-Met特异性的抗原结合区，以及结合c-Met或其片段的抗体或其部分。所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗体或这种抗体的免疫活性部分是单克隆抗体。本发明的其它实施方案包括例如功能性片段(例如抗原结合部分)，或在非传统或非免疫球蛋白结构或框架基础上提供的这种片段。
在另一个实施方案中，所述抗体或这种抗体的功能性片段以2.0X10_5M或更小，2.0 X KT6M或更小，2.0 X KT7M或更小，2.0 X KT8M或更小，或2.0X 10_9M或更小的Kd结合革巴蛋白c-Met。在相关实施方案中，所述抗体或这种抗体的功能性片段对于靶蛋白c-Met具有1.0X 1(Γ2每秒或较小，1.0XlO-3每秒或较小，IX 1(Γ4每秒或较小，或1.0X 1(Γ5每秒或较小的解离速率(off rate) (Koff)。在相关实施方案中,所述抗体或这种抗体的功能性片段以2.0 X 1(Γ5Μ 或更小，2.0 X 1(Γ6Μ 或更小，2.0 X 1(Γ7Μ 或更小，2.0 X 1(Γ8Μ 或更小，或 2.0XKT9M或更小的Kd结合祀蛋白c-Met,并抑制HGF结合c_Met。在相关实施方案中,所述抗体或其功能性片段拮抗c-Met活性。
在某些实施方案中，所述抗体或这种抗体的功能性片段结合靶蛋白C-Met并调节，即激活(激动)或抑制(拮抗)c-Met活性，该活性包括但不限于磷酸化，特别是自体磷酸化。在某些实施方案中，c-Met磷酸化的激动或激活刺激器官再生、伤口愈合和组织再生活性中的至少一种。在相关实施方案中，所述器官是肾、肝、胰、肺、胃、肠、皮肤、胸腺或甲状腺。
在优选的实施方案中，本发明的抗体拮抗c-Met，其中拮抗作用导致选自下列的至少一种活性:细胞增殖的抑制，细胞迁移的抑制，细胞存活的抑制，转移的抑制和/或HGS结合的抑制或c-Met内在化作用的诱导。在大多数实施方案中，可以将本发明c-Met抗体拮抗剂用于治疗增生性疾病，特别是癌症或炎性疾病。
在相关实施方案中，通过一种或多种测定法来测定所述结合，所述测定法可以用来测量抗体拮抗性或激动性的活性。所述测定法测量抗体对c-Met配体的至少一种作用，其至少包括:c-Met信号转导途径酶活性的诱导；c-Met信号转导途径基因表达的诱导；基于电化学发光的直接结合c-Met ;结合c-Met的酶联免疫吸附测定；以及细胞的增殖、存活、迁移或转移。通过与缺少HGF天然配体的对照相比较来测定抗体是否具有拮抗或激动作用。因而拮抗性抗体即使在HGF存在的情况下也阻抑c-Met诱导，而激动性抗体则在HGF缺失的情况下弓I发诱导。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的氨基酸和提供抗体的核苷酸序列以及选自SEQ ID N0:l-30、73-76和85-88的编码性分离核苷酸序列。在相关实施方案中，本发明提供分别由这些核苷酸序列编码的分离氨基酸序列，以及这些氨基酸序列的保守变体。在另一个相关实施方案中，SEQ ID NO:1-20中每一个分离的核苷酸序列都编码抗原结合轻链的氨基酸序列。在又一个相关实施方案中，SEQ I D NO:21-30中每一个分离的核苷酸序列都编码抗原结合重链的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供选自SEQ ID NO:31-72、77-84和89-96的分离氨基酸序列，以及这些序列的保守变体。在相关实施方案中，SEQ ID NO:31-54中每一个分离的氨基酸序列都包括抗原结合轻链。在另一个相关实施方案中，SEQ ID NO:55-72中每一个分离的氨基酸序列都包括抗原结合重链。
在某一实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO:31-72、77-84和89-96具有至少50，60，70，80，90，95或99%的同一性的分离氨基酸序列。在相关实施方案中，本发明提供与SEQID NO: 1-30，73-76和89-96中所述序列具有至少60，70，80，90，95或99%的同一性的分离核苷酸序列。
在又一个实施方案中，本发明提供这些抗体中任一个分离的抗原结合区或这些抗体中任一个功能性片段。因而在某些实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO:1-20的核苷酸序列编码的轻链。在相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列编码的重链。在另一个相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO:1-20的核苷酸序列编码的轻链和由选自SEQ ID NO:21-34的核苷酸序列编码的重链。
在相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQID NO:31-54的氨基酸序列的轻链。在另一个相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列的重链。在又一个相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQ ID NO:31-54的氨基酸序列以及这些序列保守变体的轻链，和选自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列以及这些序列保守变体的重链。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由SEQID NO:73的核苷酸序列编码的IgX轻链。在相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO:74-76的核苷酸序列编码的IgK轻链。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列的IgX轻链。在另一个相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列的IgK轻链。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的人或人源化抗体或该抗体的功能性片段，所述抗体具有对于c-Met蛋白中发现的表位有特异性的抗原结合区，从而使得该抗体或功能性片段结合细胞上c-Met表面受体，并预防或改善癌症的发展或转移。在相关实施方案中，本发明提供分离的抗体或功能性片段，其具有对靶蛋白c-Met的表位有特异性的抗原结合区，所述表位包含c-Met细胞外结构域(ECD)的一个或多个氨基酸残基。在相关实施方案中，所述表位是构象表位。
在又一个实施方案中，如上所述的分离抗体或功能性片段是Fab或scFv抗体片段，或是骆§它科纳米抗体(nanobody)。在某些实施方案中所述Fab或scFv是单价的。抗体的单价性质特别适合用于设计拮抗c-Met蛋白的试剂。在某一实施方案中,任一种IgG抗体是IgG。在相关实施方案中，以上抗体中的任一种是IgGl，IgG2，IgG3或IgG4。在特定实施方案中，所述IgG是IgG4。在更加具体的实施方案中，所述IgG4由选自SEQ ID NO:85-88的核苷酸序列编码。在又一个相关实施方案中，所述IgG4由与选自SEQ ID NO:85-88的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的同一性的核苷酸序列编码。在另一个相关实施方案中，所述IgG4具有选自SEQ ID NO:89-96的氨 基酸序列以及这些序列的保守变体。或者，本文的抗c-Met抗体是IgA, IgD, IgE或IgM。
在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含以上抗体或功能性片段或这些抗体保守变体中的至少一种，以及其可药用载体或赋形剂。
在又一个实施方案中，本发明提供转基因动物或转基因细胞，其携带编码以上抗体或其功能性片段中的任一种的基因。
在某些实施方案中，本发明提供治疗C-Met相关病症或状况的方法，其包括向需要其的受试者施用有效量的以上药物组合物中的任一种。所述病症或状况是癌症或炎症。
在一个实施方案中，所述癌症是食道癌，乳腺癌，肾癌包括但不限于乳突状肾细胞癌、神经胶质瘤、头颈癌、上皮癌、肺癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑癌、胰腺癌，胃癌、胃肠癌、胃癌、结肠癌、肠癌、肝癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、黑素瘤或前列腺癌，以及本领域技术人员已知的其它肿瘤。在特定实施方案中，所述癌症是肝癌或食道癌，或是肉瘤。更加具体地，所述癌症选自脑癌、胃癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、前列腺癌、膀胱癌(浅表和肌肉侵入型)、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤(包括成胶质细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突星形细胞瘤(oligoastrocytoma)、少突神经胶质细胞瘤)、食道癌、胃癌、胃肠癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)包括小儿HCC、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌、鼻咽癌)、胡尔特尔细胞癌、上皮癌、皮肤癌、黑素瘤包括恶性黑素瘤，间皮瘤，淋巴瘤，骨髓瘤包括多发性骨髓瘤、白血病、肺癌包括非小细胞肺癌(包括所有组织学亚型:腺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、大细胞癌和腺鳞癌混合型)、小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌包括遗传性和偶发性乳突状肾细胞癌、I型和II型，以及透明细胞肾细胞癌；肉瘤，特别是骨肉瘤、透明细胞肉瘤和软组织肉瘤(包括肺泡状和胚胎性横纹肌肉瘤，肺泡状柔软部分肉瘤)；甲状腺癌(乳突状和其它亚型)。
在给定实施方案中，一种例示性炎症是由于感染造成的。在一个实施方案中，治疗方法将是阻抑病原体感染。在特定实施方案中，感染是细菌感染，包括例如李斯特菌属(Listeria)细菌的感染。参见例如Shen等，Cell，103:501_10，(2000)。并不意味着局限于作用机制，据认为细菌利用c-Met结合蛋白将其自身内在化。本发明抗体将会阻抑这种相互作用，由此阻止内在化作用。在另一个实施方案中，所述治疗刺激细胞应答，例如伤口愈合应答。
在某些实施方案中，以上方法的任一种都包括进一步施用化疗剂。在相关实施方案中，化疗剂是抗癌剂。 在整篇申请中提供了具体的组合。
在相关实施方案中，以上方法的任一种都包括进一步施用途径特异性抑制剂。所述途径特异性抑制剂可以是化疗剂或者可以是生物制剂，例如抗体。途径特异性抑制剂包括但不限于EGFR、VEGFR等的抑制剂。
在又一个实施方案中，本发明提供处理有害细胞的方法，其包括将所述细胞与以上抗体或这些抗体的功能性片段中的任一种相接触。在相关实施方案中，所述细胞在细胞表面上具有c-Met。在另一个相关实施方案中，以上方法进一步包括用化疗剂或放射处理细胞。
在涉及若干种上述方法的实施方案中，在对受试者给药或接触细胞后，这些方法可以进一步包括观察癌症进行或转移的改善或延迟。
在又一个实施方案中，本发明提供鉴定具有C-Met表面受体的细胞的方法，该方法包括将细胞与以上抗体或功能性 片段中的任一种相接触，从而使得所述抗体或功能性片段具有可检测的标记。例如，所述标记是放射性的、荧光的、磁性的、顺磁性的或化学发光的标记。相关实施方案中，以上方法进一步包括成像或分离细胞的步骤。例如分离细胞是从更大群细胞中分离出具有c-Met的细胞。
在另一个实施方案中，以上人或人源化抗体或抗体片段是合成的抗体，例如通过固相氨基酸合成仪生产的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包括以上抗体或这些抗体的功能性片段中的任一种和其它治疗剂。所述其它治疗剂选自抗癌剂；抗生素；消炎剂；生长因子和细胞因子。
本发明还涉及用药剂的组合来预防或治疗哺乳动物，特别是人的增生性疾病或疾病(如癌症)的方法，所述药剂的组合包括:
(a)本发明的C-Met拮抗剂；和
(b)—种或多种药学活性剂；
其中至少一种药学活性剂是抗癌治疗剂。
本发明还涉及药物组合物，其包含:
(a) c-Met抗体拮抗剂；
(b)药学活性剂；和
(C)可药用载体；
其中至少一种药学活性剂是抗癌治疗剂。
本发明还涉及商用包装件或产品，其包含:
(a) c-Met抗体拮抗剂的药物制剂；和
(b)同时、共同、单独或连续使用的药学活性剂的药物制剂；
其中至少一种药学活性剂是抗癌治疗剂。
在某一实施方案中，本发明提供分离的抗体，其具有第一氨基酸序列，其是重链例如 SEQ ID NO:55-72 或与选自 SEQ ID NO:55-72 的序列具有至少 60，70，80，90，95 或 99%序列同一性的序列；和第二氨基酸序列，其是轻链例如SEQ ID NO:31-54，或与选自SEQ IDNO:31-54的序列具有至少60，70，80，90，95或99%序列同一性的序列。
在又一个实施方案中，本发明提供免疫缀合物，其具有为上述抗体或片段的第一组分，和为第二种氨基酸序列的第二组分。例如，所述免疫缀合物的第二种化合物是细胞毒素，或是对于不同于c-Met的靶标具有结合特异性的结合蛋白或抗体。例如，结合特异性不同于c-Met的靶标是肿瘤抗原或癌细胞表面上的肿瘤相关蛋白。在某些实施方案中，本发明提供任何以上抗体为双特异性的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供具有任何以上抗体或抗体片段的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒还包含其可药用载体或赋形剂。在其它相关实施方案中，试剂盒中的任何以上抗体都以单位剂量形式存在。在又一个相关实施方案中，该试剂盒包括用于向受试者施用任何以上抗体，或这些抗体的功能性片段，或针对研究用途或筛选的说明书。
预计拮抗C-Met活性的治疗剂对于广泛的临床相关肿瘤的治疗将具有有益效果。本发明中包括完全人抗体，其直接结合c-Met的细胞外结构域并阻抑与HGF/SF的相互作用。
附图简沭


图1是本发明Vh链的序列比对，进一步限定了每条链的FRl，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3 和 FR4 区。
图2是本发明链的序列比对，进一步限定了每条链的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3, CDR3 和 FR4 区。
图3是本发明VlK链的序列比对，进一步限定了每条链的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3, CDR3 和 FR4 区。
发明详沭
本发明涉及分离的抗体，特别是具有人或人源化氨基酸序列的抗体，其特异性结合c-Met，特异性结合c-Met蛋白的细胞外部分并且其抑制c_Met的功能特性。在某些实施方案中，本发明的抗体源自特定重和轻链序列和/或包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的⑶R区。本发明提供分离的抗体，制备这些抗体的方法，检测这些抗体的测定法，包含这些抗体的免疫缀合物和双特 异性分子，以及包含本发明的抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及利用所述抗体抑制，即拮抗c-Met功能的方法，以便抑制与细胞受体靶标c-Met的存在相关联的疾病或状况的发展，从而治疗增生性疾病，例如癌症或炎症。在不同的实施方案中本发明还涉及激活，即激动c-Met磷酸化作用的抗体，和使用激动性抗体的方法，所述抗体刺激例如器官再生、伤口愈合或组织再生。
在给定的实施方案中，炎症是感染。在一个实施方案中，治疗方法将会是阻抑病原体感染。在特定实施方案中，所述感染是细菌感染，包括例如李斯特菌属细菌的感染。
为了使得本发明可以被更加容易地理解，将某些术语定义为具有本文的意义，除非上下文另外说明。其它定义在整个详述中给出。
“c-Met多肽”或“c_Met受体”或指结合肝细胞生长因子的受体酪氨酸激酶。具体的实例包括例如由GenBank登录号NM_000245中提供的核苷酸序列编码的人多肽，或由GenBank登录号NP_000236中提供的多肽序列编码的人蛋白质或其细胞外结构域。原始的单链前体蛋白质在翻译后被剪切以产生α和β亚基，其通过二硫键连接以形成成熟受体。受体酪氨酸激酶c-Met参与细胞过程包括，例如伴随胚胎发生和组织再生的迁移、侵入和形态发生的过程。
短语“c-Met相关病症或状况”指任何源自c_Met的不利表达或缺乏表达，不利调控或缺乏调控，或有害活性或缺乏活性，或可以通过调节c-Met表达或活性来进行调节、治疗或治愈的疾病、病症或状况。例如在大部分癌症患者中，或在其疾病确实由与c-Met途径相关的变化驱动的患者中，可以预期HGF/c-Met途径的激活。例如上调可以归因于不同的机制，象HGF和/或c-Met的过表达，或通过c-Met突变的组成型激活。c_Met相关病症或状况包括但不限于，例如增生性疾病和紊乱和炎性疾病和紊乱。增生性疾病包括但不限于，例如癌症，其包括例如，胃癌、食道癌、乳腺癌、肾癌包括乳突状肾细胞癌、神经胶质瘤、头颈癌、上皮癌、肺癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑癌、胰腺癌、胃肠癌、胃癌、肠癌、结肠癌、肝癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、黑素瘤、和前列腺癌以及本领域技术人员已知的其它肿瘤。炎性疾病包括但不限于，例如细菌感染，包括例如由李斯特菌属细菌引起的感染。在本文和例如在Online Mendelian Inheritance in Man (“OMIM”)端口中描述了其它病症,例如，OMIN登录号164860的Met原癌基因和OMM登录号142409的肝细胞生长因子/散布因子。其它实例对于本领域技术人员来说将是已知的，例如如Corso等，TRENDS in Mol.Med., 11 (6):2841 (2005)和 Christensen 等，Cancer Letts.,225:1-26 (2005)所综述的，将这两篇文献通过引用方式而合并入本文。
术语“免疫应答”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由这些细胞或由肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体的产生和/或分泌)的任何活性，其导致选择性结合、损伤、破坏或从人体中消除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。
“信号转导途径”指一般由蛋白质-蛋白质相互作用例如生长因子结合受体起始的生物化学因果关系，导致信号从细胞一部分传递到细胞的另一部分。通常，所述传递包括在引发信号转导的系列反应中一种或多种蛋白质上一个或多个酪氨酸，丝氨基或苏氨酸残基的特异性磷酸化作用。倒数第二个过程一般包括核事件，导致基因表达的改变。
“表面受体”包括例如能够接收信号并能够将这种信号穿过细胞质膜传递的分子和分子复合物。本发明细胞表面受体的一个实例是c-Met，生长因子蛋白分子，例如肝细胞生长因子(HGF)结合于其上。
术语“抗体”包括具有免疫球蛋白样结合功能的任何部分。该术语包括完整的抗体分子和任何抗原结合片段(即“抗原-结合部分”)或其单链，骆驼科抗体包括例如纳米抗体，曬菌体展示结合构建体等等。天然发生的抗体是糖蛋白，其包含至少两条通过二硫键互联的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(在此缩写为Vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域:CH1，CH2和CH3组成。只有两种类型的轻链:λ和K。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为\)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。Vh区和'区还可以细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其与更加保守的区，称为构架区(FR)的区域一起交替散布。如在自然中所发现的，每个Vh和' 由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排布:FR1，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
术语抗体的“抗原结合部分”(或者简称为“抗原部分”)表示具有与抗原(例如c-Met的一部分)特异性结合能力的抗体的全长或一个或多个片段。业已显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体分子的片段实现。包含抗体的抗原结合部分的结合片段的实例包括Fab片段，其是由Vh, (^和CHl结构域组成的单价片段；F (ab) 2片段，其是包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；具有VdP CHl结构域的Fd片段；具有抗体链单个氨基酸序列的\和Vh结构域的Fv片段；具有Vh结构域的dAb片段(Ward等，1989, Nature341 ；544-546);和分离的互补决定区(CDR)。
关于包含抗原结合部分的抗体片段，可以包括分离的片段或缀合到化学或生物学部分上，或缀合到附于非传统免疫球蛋白衍生的框架或支架结构上的片段，所述框架或支架结构包括但不限于例如锚蛋白、粘连蛋白、结构域抗体、脂笼蛋白、小模块式免疫药物、maxybodies、纳米抗体、蛋白质A、affilin、Y -晶体蛋白和泛素，以及其它本领域技术人员已知和预料到的支架结构。
另外，尽管天然发生的抗体分子中 存在具有Fv结构域\和Vh的两条链，Vl和Vh由分离的基因编码，但可以利用重组方法将其用一个合成接头连接起来，所述合成接头使其能够作为单一蛋白链重组表达，其中'和Vh区形成单价分子(称为单链Fv (scFv);参见例如 Bird 等，1988, Science242:423-426 和 Huston 等，1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.，85:5879-5883)。这样的单链抗体也包括在术语抗体的抗原结合部分内。利用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体或其其它片段相同的方式对所述片段筛选效用。
“分离的抗体”指基本上不含其它具有不同抗原特性的抗体的抗体(例如，特异性结合c-Met上一组氨基酸决定簇的分离抗体，基本上不含特异性和实质上结合c-Met之外抗原的抗体)。不过，特异性结合c-Met蛋白例如人c-Met的分离抗体与其它抗原具有交叉反应性，如来自其它物种的c-Met分子，或与人c-Met氨基酸序列具有高度同一性的蛋白质。另外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学品。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指抗体分子的制品，其全部共有单一分子组分。因而单克隆抗体组合物显示对特定表位单一的结合特性和亲和性。
本文所用的术语“多克隆抗体”指具有异质抗体群的抗体组合物。多克隆抗体通常源自经免疫动物或源自选定人的收集(pooled)的血清。
本文所用的术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中至少一个并且一般是框架区和CDR区都源自人源的序列。另外，如果抗体包含恒定区，所述恒定区也源自这种人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变体。本发明人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变如取代)。
术语“人单克隆抗体”是指展示单一结合特异性的抗体，这些抗体具有可变区，其中框架区和CDR区两者都源自人序列。在一实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤生产，该杂交瘤包括从转基因非人动物，例如转基因小鼠中获得的B细胞，该动物携带包括一般为人源的重链转基因和一般为人源的轻链转基因的基因组，其融合到一般为人源的永生化细胞中。
本文所用的术语“重组人抗体”，包括通过重组方法制备，表达，生成或分离的人抗体，如从转基因或转染色体(transchromosome)人免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)或尤其制备的杂交瘤中分离的抗体，从经转化表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤中分离的抗体，从重组的组合人抗体文库中分离的抗体和通过任何其它方法制备，表达，生成或分离的抗体，所述其它方法包括将一种或多种人免疫球蛋白基因序列的全部或一部分剪接到其它DNA序列上。这样的重组人抗体具有可变区，其中框架区和⑶R区源自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方案中，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列为转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，从而使得所述重组抗体的Vh区和'区的氨基酸序列是尽管来源于人种系Vh和'序列并且与之相关，但可能并不天然存在于体内人抗体种系所有组成成分中的序列。
本文所用的，“同种型”指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgA、IgD、IgM、IgE 或 IgG，例如 IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合抗原的抗体”相互换用。
本文所用的“特异性结合人c-Met”的抗体意在指以2.0X 1(Γ5Μ或更小，2.0X 1(Γ6Μ或更小，2.0Χ1(Γ7Μ或更小，2.0Χ1(Γ8Μ或更小或2.0Χ1(Γ9Μ或更小的Kd结合人c-Met的抗体。本文所用的术语“交叉反应性”指结合其它抗原表位的抗体或抗体群。这可由抗体的低抗体亲抗原性或者低特异性引起，或者由具有同一性或者非常相似表位的多个特殊抗原引起。当希望一般性结合相关组的抗原或如果当抗原表位序列在进化上不是高度保守而尝试跨物种标记时，交叉反应性某些时候是所需的。
“与人c-Met之外的抗原交叉反应”的抗体指以0.5 X IO^7M或更小，5 X 1(Γ8Μ或更小或2X KT9M或更小的Kd结合该抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体意指如果能完全以1.5X10_8M或更大或5-10X10_7M或5X10_6M或更大的Kd结合该抗原的抗体。在某些实施方案中，标准结合测试中，不与抗原交叉反应的抗体显示基本上与这些蛋白质不可检测的结合。
本文所用的“抑制结合c-Met”的抗体指抑制HGF/SF配体以IOnM或更小，5nM或更小，InM或更小，0.75nM或更小，0.5nM或更小或0.25nM或更小的&结合c-Met表面受体的抗体。
本文所用的“抑制c-Met信号转导活性”的抗体意指以小于10nM，5nM，2.5nM，1.0nM, 0.5nM或更小的IC5tl抑制c_Met诱导的增生活性或其它诱导活性的抗体。
本文所用的术语“Kass。。”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的缔合比率，本文所用的术语“Kdis”或“KD”，意指特定抗体-抗原相互作用的解离比率。本文所用的术语“KD”意指获自1^对1 (即Kd/Ka)比率并表示为摩尔浓度(M)的解离常数。可以利用本领域公认的方法测定抗体的Kd值。测定抗体的Kd的方法是通过利用表面等离子体共振，或利用生物传感器系统例如Biaco re⑩系统。
本文所用的术语“激动剂抗体”或“激活性抗体”意指当添加至表达C-Met的细胞、组织或器官时，将一种或多种c-Met诱导的活性提高至少20%-40%的抗体。在一些实施方案中，所述抗体激活c-Met活性至少50%，60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%或大于100%。在一些实施方案中，本发明激动剂抗体将c-Met的至少一种活性提高10倍。一般地，这种提高在缺乏生物学诱导剂HGF的情况下观察到。不过，在一些实施方案中，例如测定的对照中，激活性抗体在存在HGF的情况下添加。
本文所用的术语“亲和性”指在单一抗原性位点上抗体和称作“表位”的抗原部分之间相互作用的强度。在每一个抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在抗体的多个原子位置或氨 基酸残基原子上相互作用；一般地，这种相互作用的数目越大，抗体对抗原的亲和性就越强。
本文所用的术语“抗体亲抗原性”指抗体-抗原复合物的总体稳定性或强度的信息性测量。其由三种主要因素控制:抗体-表位亲和性；每种抗原和抗体的价；这些相互作用部分的结构排列或三维构型。最终这些因素限定抗体的特异性，即特定抗体结合精确抗原表位的可能性以及键的稳定性和持续时间。
为了获得具有较高抗体亲抗原性的探针，可以构建二聚体缀合物(偶联到FACS标记上的两分子抗体蛋白质或多肽)，从而使得低亲和性的相互作用(例如与种系抗体)更加容易通过FACS检测。另一种提高抗原结合的抗体亲抗原性方法包括生成c-Met抗体的任何本文所述构建体的二聚 体或多聚体。这种多聚体可以通过单个模块之间的共价结合生成，例如通过模仿天然C-至-N-末端结合或通过模仿抗体二聚体，所述抗体二聚体通过其恒定区保持在一起。改造入Fc/Fc界面的键可以是共价的或非共价键。此外，可以将Fe之外的二聚或多聚部分用于构建抗-C-Met抗体杂合物，例如双功能性抗体，以生成这种更高级的结构。本文所用对于IgG抗体的“高度亲和性”术语指对于靶抗原具有10_8M或更小，IO-9M或更小或ΙΟ,Μ或更小的Kd的抗体。不过，“高度亲和性”结合可以对其它抗体同种型而变化。例如对于IgM同种型的“高度亲和性”结合指具有IO-7M或更小或IO-8M或更小的Kd的抗体。本文所用术语“受试者”包括包括人的任何哺乳动物,或非人哺乳动物,或其它动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛和非哺乳类例如鸟类、两栖类、爬行动物等。术语“优化的”指核苷酸序列已被改变以利用在生产细胞或生物中优选的密码子编码氨基酸序列，所述细胞一般为真核细胞，例如例如毕赤酵母(Pichia)的酵母细胞，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。对优化的核苷酸序列进行改造，完全或尽可能地保留由最初核苷酸序列，也称作“亲本”序列所编码的氨基酸序列。本文优化的核苷酸已经被改造成具有人细胞中优选的核苷酸序列密码子，不过这里还预想这些序列在其它真核细胞中优化表达。本文中由优化的核苷酸序列所编码的抗体的氨基酸序列也称为优化的。在下面的小节中进一步详述本发明的各个方面。评估抗体对于各物种C-Met结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹和RIA。合适的测定法对于本领域技术人员来说是已知的。参见例如，F.Ausubel 等编著，2006, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishingand Wiley Interscience, New York。抗体的结合动力学(例如结合亲和性)也可以通过本领域已知的标准测定法来评定，例如通过Biacore分析。本文描述了评估抗体对于c_Met功能特性的作用(例如诱导受体的内在化作用、抑制生长因子结合c-Met、抑制c-Met自体磷酸化、抑制c-Met途径激活，由此预防或改善增殖或激酶测定)的测定法。因此，抑制根据本领域已知和本文所述方法所测定的这些C-Met功能特性(例如生化、免疫化学、细胞、生理学或其它生物学活性等等)中的一种或多种的抗体相对于缺少抗体所观察(例如或者存在不相关特异性的对照抗体)到的涉及统计学上显著地拮抗或降低特定活性。抑制c-Met活性的抗体影响这种统计学上显著地降低测量参数的至少10%，至少50%，80%或90%，在某些实施方案中本发明抗体可以抑制大于95%，98%或99%的c-Met功能活性。一般地，在诱导事件，例如添加HGF之后测量活性的降低。或者，“激动”根据本领域已知和本文所述方法所测定的这些C-Met功能特性(例如生化、免疫化学、细胞、生理学或其它生物学活性等等)中的一种或多种的抗体相对于缺少抗体所观察(例如或者存在不相关特异性的对照抗体)到的涉及统计学上显著地提高特定活性。刺激或激动c-Met活性的抗体影响这种统计学上显著地提高测量参数的至少10%，至少50%，80%或90%，在某些实施方案中本发明抗体可以激动大于95%，98%或99%或更大的c-Met功能活性。

重鉬杭体
本发明抗体是重组抗体，如实施例中所述进行分离和结构表征。抗体Vh核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:21-30中。表C-E提供本发明不同抗体的Vh核苷酸序列实例。抗体\核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:1-20中。(表C-E提供本发明不同抗体的\核苷酸序列实例)。抗体IgA和K轻链核苷酸序列显示于SEQ ID NO:73-76和表C-E中。抗体IgG4核苷酸序列显示于SEQ ID NO:85-88和表C-E中。本发明其它抗体包括已经被突变，但与上述序列具有至少60，70，80，90，95或99%同一性的核苷酸。抗体Vh氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:55_72和表A-B和E中。抗体Vl氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:31-54和表A-B和E中。IgA轻链氨基酸序列分别显示于SEQID NO:77-80和表A-B和E中。抗体IgK轻链氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:81-84和表A-B和E中。抗体IgG4氨基酸序列分别显不于SEQ ID NO:89-96和表A-B和E中。本发明其它抗体包括已经被突变，但保留与上述序列至少60，70，80，90，95或99%同一性的氨基酸。由于这些抗体每种都能够结合C-Met细胞外部分上的位点，所以可以将VH/\ (核苷酸序列和氨基酸序列)，VH/IgX轻链(核苷酸序列和氨基酸序列)dPVH/IgK轻链(核苷酸序列和氨基酸序列)“混合和匹配”以产生本发明抗c-Met结合分子的其它组合。可以利用上述和实施例中(例如ELISA)的结合测定法对这些抗体的c-Met结合进行测试。本发明抗体的VH，VL, IgA轻链和IgK轻链序列特别适于进行新的组合，因为这些抗体使用源自相同或相似种系序列的VH，'，Ig λ轻链和IgK轻链序列，并且因而显示结构相似性。因此，在一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有:包含选自SEQ ID NO:55- 72的氨基酸序列的重链可变区(Vh);含选自SEQ ID NO:31-54的氨基酸序列的轻链可变区(');其中所述抗体特异性结合c-Met。重和轻链组合的实例至少包括:SEQ ID NO:65的VjP SEQ ID NO:32的Vl ;*SEQID NO:66 的 Vh 和 SEQ ID NO:34 的 \ ;或 SEQ ID NO:67 的 Vh 和 SEQ ID NO:37 的 \ ;或SEQ ID NO:68 的 Vh 和 SEQ ID NO:38 的八；或 SEQ ID NO:69 的 Vh 和 SEQ ID NO:51 的八；或 SEQ ID NO:70 的 Vh 和 SEQ ID NO:52 的 \ ;或 SEQ IDNO:71 的 Vh 和 SEQ ID NO:53 的Vl ;或 SEQ ID NO:72 的 Vh 和 SEQID NO:54 的 \ ;或 SEQ ID NO:55 的 Vh 和 SEQ ID NO:31的八；或 SEQ ID NO:58 的 Vh 和 SEQ ID NO:36 的八；或 SEQ ID NO:61 的 Vh 和 SEQ ID NO:41的\ ;或SEQ ID NO:62的V1^P SEQ IDNO:45的V”表A-B举例说明了本发明不同抗体的Vh和\氨基酸序列的“混合和匹配”实例。图1-3是举例说明Vh和\氨基酸序列实例的表，举例说明了可以由替代结构提供的FR和CDR区，以提供具有与本文抗体相同或相似c-Met拮抗活性的构建体。因此，在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有:包含选自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列的Vh区和包含选自SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列的IgX轻链,其中所述抗体特异性结合C-Met。Vh/Ig λ轻链组合的实例至少包括:SEQ ID NO:66的Vh和SEQ ID NO:77的Ig λ轻链；或SEQ ID NO:65的Vh和SEQ ID NO:78的Ig λ轻链；或包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的Vh区和SEQ ID NO:79的Ig λ轻链；或SEQ ID NO:70的Vh区和SEQ ID NO:80的IgA轻链。因此，在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有:包含选自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列的Vh区和包含选自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列的IgK轻链,其中所述抗体特异性结合c-Met。Vh/Ig K轻链组合的实例至少包括:SEQ ID NO:71的Vh区和SEQID NO:81的Ig κ轻链；或SEQ ID NO:68的Vh区和SEQ ID NO:82的Ig κ轻链；或SEQ ID NO:67的Vh区和SEQ ID NO:83 的 IgK 轻链；或 SEQ ID NO:72 的 Vh 区和 SEQ ID NO:84 的 IgK 轻链。在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有:包含选自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列的Vh链和包含选自SEQID NO:1-20的核苷酸序列的\链。因而重和轻链组合的实例至少包括:包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列的VHg和包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ IDNO:23的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQID NO:24的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的VHg和包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列的轻链可变区。参见表A-B举例说明了本发明不同抗体的Vh和\核苷酸序列的“混合和匹配”配对的实例，以便更具体的示例Vh和\核苷酸序列的配对。在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有:包含选自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列的Vh链和包含选自SEQID NO:73的核苷酸序列的IgA轻链。因而VH/Ig λ轻链组合的实例包括:包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:73的核苷酸序列的IgA轻链。在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有:包含选自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列的Vh链和包含选自SEQID NO:74-76的核苷酸序列的IgK轻链。因而Vh和Ig K轻链组合的实例至少包括:包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:74的核苷酸序列的IgK轻链可变区；或包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列的％区和包含SEQ ID NO:75的核苷酸序列的IgK轻链可变区；或包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列的Vh区和包含SEQ ID NO:76的核苷酸序列的IgK轻链可变区。本文所用的人抗体包含重或轻链可变区，其是特定种系序列的“产物”或“源于”特定种系序列，条件是抗体的可变区获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统。这种系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的 转基因小鼠或用目标抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。可以通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择与人抗体序列在序列上最接近(即最大的％同一性)的人种系免疫球蛋白序列，来鉴定是人种系免疫球蛋白序列的产物或源于人种系免疫球蛋白序列的人抗体。是特定人种系免疫球蛋白序列的产物或源于特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可能包含与种系序列相比有差异的氨基酸。这种差异归因于例如至少一个天然发生的体细胞突变或有意导入的定点突变。不过，选定的人抗体一般与人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90%相同，并且包含这样的氨基酸残基，即当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如小鼠种系序列)比较时，所述氨基酸残基鉴定人抗体为人源的。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上可以与种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列具有至少60%，70%, 80%, 90%或至少95%或甚至至少96%，97%, 98%或99%的同一性。一般，源自特定人种系序列的人抗体将会显示与人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体将会显示与种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列不超过5个，甚至不超过4，3，2或I个氨基酸的差异。
同一性抗体
在又一个实施方案中，本发明抗体至少具有与本文所述抗体的氨基酸和核苷酸序列具有同一性或同一性的可变区重和轻链核苷酸序列，或可变区重和轻链氨基酸序列，或IgA核苷酸序列，或Ig X氨基酸序列，或IgK核苷酸序列，或Ig K氨基酸序列，或IgG4核苷酸序列，或IgG4氨基酸序列，其中所述抗体保留本发明抗C-Met抗体的所需功能特性，即显示亲本功能活性。所述亲本功能活性可以是拮抗性的或激动性的。在大多数实施方案中，所述活性是拮抗性的。
例如，本发明提供分离的重组抗体或其具有Vh区和轻链可变区的抗原结合部分，从而所述Vh区包含与选自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列具有至少80%，85%，90%, 95%或99%同一性的氨基酸序列，轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:31-54的氨基酸序列具有至少80%，85%，90%，95%或99%同一性的氨基酸序列，其中所述抗体特异性结合c-Met并且所述抗体显示下列功能性拮抗特性中的至少一种:所述抗体诱导c-Met受体的内在化作用、所述抗体抑制蛋白质生长因子结合c-Met、所述抗体抑制c-Met的自体磷酸化，由此阻止c-Met途径的激活、所述抗体抑制源自信号转导的c-Met途径上调、或所述抗体抑制c_Met结合，由此预防或改善细胞增殖，存活，迁移，侵入或形态变化，尤其是预防或改善癌症，例如肿瘤生长和/或转移。
在备选的实施方 案中，所述抗体是响应性的并且激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。在一个实施方案中，所述细胞应答是伤口愈合应答。
在另一个实施例中，本发明提供分离的重组抗体或其具有IgX轻链的抗原结合部分，从而所述Ig A轻链包含与选自SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示下列功能特性中的至少一种:所述抗体激活诱导c-Met受体的内在化作用、所述抗体抑制蛋白质生长因子结合c-Met，由此用这种抑制阻止受体的激活，例如阻止源自c-Met激活和/或信号转导的途径上调、或者所述抗体预防或改善细胞增殖，细胞存活，迁移，侵入或形态变化、或者所述抗体拮抗c-Met活性，由此预防或改善癌症，例如肿瘤生长和/或转移。
在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其具有IgK轻链的抗原结合部分，其中所述Ig K轻链具有与选自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列；所述抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是IgG4，从而IgG4具有与选自SEQ ID NO:89-96的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列；所述抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的，并且激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在多个实施方案中，所述抗体可以显示本文所讨论拮抗功能特性中的一种或更多种，两种或更多种，或三种或更多种。所述抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其具有Vh区和轻链可变区的抗原结合部分，从而Vh区由与选自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所编码；轻链可变区由与选自SEQ ID NO:1-20的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所编码；编码的抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在又一个实施例中，本发明提供分离的重组抗体或其具有IgX轻链的抗原结合部分，从而IgA轻链由与选自SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所编码；编码的抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活c-Met磷酸化作用，刺激细胞应答。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其具有IgK轻链的抗原结合部分，其中IgK轻链由与选自SEQ ID NO:74-76的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所编码；所述抗 体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是IgG4，其中所述IgG4由与选自SEQ ID NO:85-88的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所编码；编码的抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在多个实施方案中，所述抗体可以显示本文所讨论的拮抗功能特性中的一种或更多种，两种或更多种，或三种。所述抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其它实施方案中，Vh和/或\氨基酸序列可以与以上给出的序列具有50%，60%,70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 或 99% 的同一性。具有分别与 SEQ ID NO:31-72 的 Vh 和 Vl区具有高度(即80%或更大)同一性的Vh和\区的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO:31-72的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，重链和/或轻链核苷酸序列的可变区可以与以上给出的序列具有 60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性。具有分别与 SEQ ID NO:21-30的可变区重链和SEQ ID NO:1-20的可变区轻链具有高度(即80%或更大)同一性的可变区重链和轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)包含SEQ ID NO:1-30的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，IgX轻链氨基酸序列可以与以上给出的序列具有50%，60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性。具有分别与 SEQ ID NO:77-80 的 Ig 入轻链具有高度(即80%或更大)同一性的IgX轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO:77-80的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，IgX轻链核苷酸序列可以与以上给出的序列具有60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%的同一性。具有分别与SEQ ID N0:73的Ig入轻链具有高度(即80%或更大)同一性的IgA轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)包含SEQ ID NO:73的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，IgK轻链氨基酸序列可以与以上给出的序列具有50%，60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性。具有分别与 SEQ ID NO:81-84 的 IgK 轻链具有高度(即80%或更大)同一性的Ig K轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO:81-84的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，IgK轻链核苷酸序列可以与以上给出的序列具有60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性。具有分别与 SEQ ID NO:74-76 的 IgK 轻链具有高度(即80%或更大)同一性的IgK轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)包含SEQ ID NO:74-76的核酸分子，随后利用本文所述的功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即，上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，所述抗体是可以与以上给出的氨基酸序列具有50%，60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性的 IgG4。分别与 SEQ ID NO:89-96 的 IgG4 组合物具有高度(即80%或更大)同一性的IgG4，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO:89-96的核酸分子，随后利用本文所述的功能测定法对编码的源于诱变而改变的抗体测试保留的功能(即，上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，所述抗体是与以上给出的核苷酸序列具有60%，70%, 80%, 90%，95%, 96%, 97%, 98% 或 99% 同一性的 IgG4。分别与 SEQ ID NO:85-88 的 IgG4 具有高度(即80%或更大)同一性的IgG4，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)包含SEQ ID NO:85-88的核酸分子，随后利用本文所述的功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
本文所用的两个氨基酸序列或两个核苷酸 序列之间的百分比同一性等同于所述两种序列之间的百分比同一性，这些术语在本文中可以交换使用。两种序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性=相同位置的数目/位置总数X 100)，为了优化两种序列的比对，该函数应考虑需要引入的缺口数目以及每个缺口长度。两个序列之间的序列比较和百分比同一性测定可以利用数学运算法来完成，如下面非限制性实施例中所述的。
两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以利用并入ALIGN程序(版本 2.0)的 E.Meyers 和 ff.Miller 的算法(Comput.Appl.Biosc1.,4:11-17,1988)来测定，并使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12以及缺口罚分为4的参数。此外，可以用已经并入到GCG软件包的GAP程序(可得自http://www.gcg.com)中的Needleman和Wunsch (J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法，使用 Blossom62 矩阵或 PAM250 矩阵以及缺口权重为16、14、12、10、8、6、或4和长度权重为1、2、3、4、5或6，测定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的百分同一丨I"生。
此外或备选地，本发明蛋白质序列还可以进一步用作“查询序列”，对公共数据库进行搜索，以便例如鉴定相关序列。这样的搜索可以用Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215 =403-10的XBLAST程序(版本2.0)来进行。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序，分值=50，字长=3来进行，以获得与本发明抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得加入缺口的比对以供比较,可以如 ALtschul 等，1997，Nucleic Acids Res.,25 (17):3389-3402 中所述，利用Gapped BLAST。当用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST 和 NBLAST)的缺省参数。参见 http://www.ncb1.nlm.nih.gov。
根据已知技术可以测定允许核苷酸序列杂交到本文所示核苷酸序列上的条件。核苷酸的杂交在降低的严谨性，中等严谨性或甚至是严谨条件下进行。根据6+0%和多核苷酸的长度而定，示例性低严谨条件是37° C的包含35-40%甲酰胺与5XDenhardt氏溶液，0.5%SDS和I X SSPE的缓冲液。示例性中等严谨性条件是42° C的包含40-45%甲酰胺与5X Denhardt氏溶液，0.5%SDS和IXSSPE的缓冲液。示例性高度严谨性条件是42° C或更高的温度的包含50%甲酰胺与5XDenhardt氏溶液，0.5%SDS和IXSSPE的缓冲液。参见J.Sambrook 等，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第二版)(Cold SpringHarbor Laboratory)。
在任何以上示例性严谨条件下的核苷酸序列杂交都是在溶液中进行并在滤膜上收集。或者在任何以上示例性严谨条件下的核苷酸序列杂交都是在凝胶中进行的，例如DNA印迹法。
具有保守性修 饰的抗体
在某些实施方案中，本发明抗体具有包括选自SEQ ID NO:55-72的序列的Vh区和包括选自SEQ ID NO:31-54的序列的轻链可变区，从而这些序列中的一种或多种具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或其保守性修饰，并且所述抗体具有本发明抗c-Met抗体的所需功能特性。因此，本发明提供分离的抗体或其具有Vh链和'链的抗原结合部分，从而Vh链具有选自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列及其保守性修饰，'链具有选自SEQ IDNO:31-54的氨基酸序列及其保守性修饰；所述抗体特异性结合c-Met ;并且所述抗体显示下列功能特性中的至少一种:所述抗体激活诱导c-Met受体的内在化作用，所述抗体抑制蛋白质生长因子结合c-Met，由此用这种抑制阻止受体的激活，例如阻止源自c-Met激活和/或信号转导的途径上调，或者所述抗体预防或改善细胞增殖，细胞存活，迁移，侵入或形态变化，或者所述抗体拮抗c-Met活性，由此预防或改善癌症例如肿瘤生长和/或转移。
在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活刺激细胞应答的C-Met磷酸化作用。
在某些实施方案中，本发明抗体是具有选自SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列的IgA轻链，从而这些序列中的一种或多种具有源自本文所述抗体的氨基酸序列并具有保守性修饰的氨基酸序列，从而衍生的抗体保留本发明抗c-Met抗体的所需功能特性。因此，本发明提供分离的亲本抗体或其具有Ig X轻链的抗原结合部分，从而Ig X轻链具有选自SEQID NO:77-80的氨基酸序列及其保守修饰；所述抗体特异性结合c-Met ;并且所述抗体显示本文所述的功能性拮抗特性中的至少一种。
在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活刺激细胞应答的c Met磷酸化作用。
在其它实施方案中，本发明提供具有IgK轻链的抗体，所述IgK轻链具有选自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列，从而这些抗体中的一种或多种具有源自本文所述抗体的氨基酸序列并具有其保守性修饰，并且其中所述抗体显示本发明亲本抗c-Met抗体的功能特性。因此，本发明提供具有IgK轻链的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，从而IgK轻链具有选自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列及其保守性修饰形式；所述抗体特异性结合c-Met ;并且所述抗体显示本文提供的功能特性中的至少一种。
在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的C-Met磷酸化作用。
在其它实施方案中，本发明抗体是IgG4，其具有选自SEQ ID NO:89_96的氨基酸序列，其中这些序列中的一种或多种具有源自本文所述抗体亲本氨基酸序列的氨基酸序列或其保守性修饰，并且所述抗体显示本发明抗c-Met抗体的所需功能特性。因此，本发明提供分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是IgG4，其中:IgG4具有选自SEQ ID NO:89-96的氨基酸序列及其保守性修饰；所述抗体特异性结合c-Met ;并且所述抗体显示本文所述功能性拮抗特性中的至少一种。
在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活刺激细胞应答的C-Met磷酸化作用。
在多个实施方案中，所述抗体可以显示出上面讨论列出的拮抗功能特性中的一种或更多种，两种或更多种，或三种或更多种。这些抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
本文所用的术语“保守性序列修饰”意指这样的氨基酸修饰，其不会显著影响或改变包含所述氨基酸序列的抗体的结合特异性。这类保守性修饰包括本文所述的氨基酸取代，添加和缺失。通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR-介导的诱变，将修饰导入本发明抗体中。
保守性氨基酸取代用具有化学和物理学相似侧链的不同氨基酸残基来替代氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电核极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，^分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，本发明抗体CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其它氨基酸替代，并且可以利用本文所述的功能测定法对变化的抗体测试保留的功能。
抗体框架
可以采用许多种抗体/免疫球蛋白框架或支架结构，只要得到的多肽包括一种或多种结合区，其对于本文示例性序列的c-Met蛋白具有特异性。这类框架或支架结构包括人免疫球蛋白或其片段(例如本文其它处所披露的那些)的5种主要同种型，并包括其它动物物种的免疫球蛋白，其优选为人源化方面的。单一重链抗体例如在骆驼科动物中鉴定的那些在这一方面特别令人感兴趣。新的框架、支架结构和片段不断被本领域技术人员所发现和开发。
或者，可以采用已知的或未来的非免疫球蛋白框架和支架结构，只要其包含特异性针对c-Met蛋白的结合区。本文将这些化合物称作“包含c-Met-特异性结合区的多肽”。已知的非免疫球蛋白框架或支架结构包括Adnectins (纤连蛋白)(CompoundTherapeutics, Inc., Waltham, MA),锚蛋白(Molecular Partners AG, Zurich,瑞士)，结构域抗体(Domantis, Ltd (Cambridge, MA)和 Ablynx nv (Zwi jnaarde,比利时))，脂笼蛋白(Anticalin) (Pieris Proteolab AG, Freising,德国)，小模块式免疫药物(TrubionPharmaceuticals Inc., Seattle,WA),maxybodies (Avidia,Inc.(Mountain View,CA)),蛋白质 A (Affibody AG,瑞典)和 affilin ( y 晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,德国)。
结合与本发明抗c-Met抗体相同表位的抗体
在另一个实施方案中，本发明提供抗体，其与本文提供的本发明各种抗c-Met抗体结合相同表位。在标准c-Met结合测定中，可以基于与本发明其它抗体交叉竞争的能力(例如以统计学上显著意义的结合的竞争性抑制)而鉴定这些另外的抗体。抑制抗体(已知具有结合人c-Met能力)结合的受试抗体的能力表明受试抗体可以与该抗体竞争。根据非限制性理论，这样的抗体可以与其所竞争的抗体结合人c-Met上相同或相关的(例如结构类似或空间接近)的表位。如实施例中所述可以制备和分离这类抗体。
骆驼科抗体
已经对由胳马它和单峰胳马它家族成员(双峰马它(Camelus bactrianus)和Calelusdromaderius)获得的抗体蛋白质进行了关于大小、结构复杂性和在人受试者中的抗原性表征，所述骆§它和单峰骆§它家族成员包括新大陆成员例如美洲骑(llama)物种(Lama paccos,大羊§它(Lama glama)和大羊骑(Lama vicugna))。在自然界中发现来自这种哺乳动物科的某些IgG抗体缺少轻链，因而具有与具有两条重链和两条轻链的典型四链结构明显不同的结构，所述四链结构是来自其它动物的抗体的特征。参见PCT/EP93/02214 (1994年3月3日公开的W094/04678)。
骆驼科抗体的区域，被鉴定为Vhh的小的单一可变结构域，可以通过遗传工程改造来获得产生对靶标具有高度亲和性的小蛋白，导致一种低分子量抗体来源的蛋白质，称作“骆驼科纳米抗体”。见1998年6月2日发布的美国专利5，759，808 ;还见Stijlemans,B.等，2004, J Biol Chem,279:1256-1261 ；Dumoulin, M.等，2003, Nature,424:783-788 ；Pleschberger, M.等，2003, Bioconjugate Chem,14:440-448 ；Cortez-Retamozo, V.等，2002, Int J Cancer，89:456-62 ;和 Lauwereys，M.等，1998，EMB0J，17:3512_3520。骆驼科抗体和抗体片段经改造过的文库可以，例如从Ablynx,Ghent,Belgium商购。如本领域对于其它非人源抗体已知的，可以重组改变骆驼科抗体的氨基酸序列，以获得更加近似人序列的序列，即纳米抗体可以被人源化。因而骆驼科抗体对人的天然低抗原性可以再减弱。
骆驼科纳米抗体具有人IgG分子大约十分之一的分子量，并且所述蛋白只有几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼科纳米抗体结合对于较大抗体蛋白而言为功能上不可识别的抗原性位点的能力，即骆驼科纳米抗体可用作检测抗原的试剂，而所述抗原对于利用经典免疫技术而言是隐蔽的，骆驼科纳米抗体还可用作可能的治疗剂。小尺寸的又一个结果例如是骆驼科纳米抗体能够结合到靶蛋白凹槽或狭缝中特定位点而产生抑制性结果，因此能够形成这样的能力，其比经典高分子量抗体更近似地模仿经典低分子量药物的功能。
低分子量和紧凑的尺寸还导致骆驼科纳米抗体极端热稳定，对于极端pH稳定和对于蛋白水解消化稳定，并且具有低抗原性。另一个结果是骆驼科纳米抗体容易从循环系统移入组织内，即外渗，甚至穿过血脑屏障并因而可以进行改造来治疗影响神经组织的病症。纳米抗体还可以促进药物转运穿过血脑屏障。参见公布于2004年8月19日的美国专利申请20040161738。这些特征结合对人的低抗原性表明极大的治疗潜力。另外，这些分子可以在原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)中完全表达,其作为与噬菌体的融合蛋白而表达，这样表达的蛋白质是功能性的。
因此，本发明一个特征是对靶蛋白C-Met具有高度亲和性的骆驼科抗体或纳米抗体。在本文某些实施方案中，骆驼科抗体或纳米抗体天然产生于骆驼科动物中，即利用本文对其它抗体所述的技术，在用靶蛋白c-Met或其肽片段免疫后由骆驼科动物产生，或在转基因骆驼科动物中重组产生。或者，对抗c-Met骆驼科纳米抗体进行改造，即，如本文实施例中所述以c-Met作为靶标，利用淘选方法例如由噬菌体文库通过选择来产生，所述噬菌体展示适当诱变的骆驼科纳米抗体蛋白。可以通过遗传工程来进一步定制改造的纳米抗体，以便在受体受试者体内具有45分钟到两周的半衰期。
经改诰或修饰的杭体
可以利用具有一种或多种本文所示的￥11和/或'序列，IgX轻链序列或IgK轻链序列的抗体作为起始材料(即作为亲本序列)来制备本发明抗体，以改造衍生修饰的抗体，所述抗体是经修饰的抗体，与起始抗体相比其可以具有变化和改善的特征。可以通过在一个或两个可变区(即％和/或VJ或只在IgX轻链内，或只在IgK轻链内，在一个或多个⑶R区和/或在一个或多个框架区内修饰一个或多个残基来改造抗体。此外或备选地，可以通过修饰恒定区内的 残基，例如改变抗体的效应子功能来改造抗体。
可以进行的一类可变区改造是⑶R移植。抗体主要通过位于重和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，在各种抗体间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更加多变。由于CDR序列负责大多数的抗体-抗原相互作用，有可能通过构建表达载体来表达模仿特定天然发生抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括来自天然发生抗体的CDR序列，其移植到来自具有不同特性的不同抗体框架序列上(参见例如Riechmann，L.等，1998，Nature，332:323-327 Jones, P.等，1986，Nature，321:522-525 ；Queen, C.等，1989, Proc.Natl.Acad ;参见 U.S.A.86:10029-10033 ;授予 winter 的美国专利 5，225，539，和授予 Queen 等的美国专利 5，530，101 ；5, 585，089 ；5, 693，762 和 6，180，370)。
这类框架序列可以获自包括种系抗体基因序的公共DNA数据库或公开发表的参考文献。例如，人重和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(可从互联网获得，网址为 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase),以及在 Kabat, E.A.，等，1991，Sequence of Protein of Immunological Interest,第5版，U.S.,Department of Healthand human Services, NIH 出版号 91-3242 ；Tomlinson, 1.M.,等，1992, J.Mol.Biol., 227:776-798 ;和 Cox, J.P.L.等，1994，Eur.J Immunol.,24:827-836 中发现；每一篇的内容都通过引用的方式而合并入本文。已经发现在某些情况下诱变框架区内的残基对于保持或提高抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如，授予Queen等的美国专利5，530，101 ；5，585，089 ;5，693，762 和 6，180，370)。
另一种类型的可变区修饰是￥11和/或Vl的⑶Rl，⑶R2和/或⑶R3区内氨基酸残基的突变，由此提高目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和性)，称作“亲和性突变”。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变来导入突变，通过本文所述的和在实施例中提供的体外或体内测定法来评估对于抗体结合或另一种目标功能特性的重要影响。可以引入保守性修饰(如上面讨论的)。突变可以是氨基酸取代，添加或缺失。一般CDR区内不超过一个，两个，三个，四个或五个残基被改变，尽管还可以预想另外的变化。
本发明经改造的抗体包括那些抗体，其中对Vh和/或\，和/或Ig入轻链，和/或IgK轻链内的框架残基进行修饰，以便例如改善抗体的特性。一般进行这类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应种系序列的框架残基。更加具体地，已经进行过体细胞突变的抗体可以包含与该抗体源自的种系序列不同的框架残基。通过比较抗体框架序列与该抗体源自的种系序列可以鉴定这类残基。为了将框架区序列回复为其的种系构型，通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变回复突变为种系残基。这类回复突变的抗体也包括在本发明中。
另一种类型的框架修饰包括在框架区内，或甚至在一个或多个⑶R区内突变一个或多个残基，以便除去T细胞表位，由此减弱抗体的潜在免疫原性。这种方法也称作“去免疫”并在Carr等的美国专利公开20030153043中作进一步描述。
除了在框架或⑶R区内制作的修饰之外或备选地，可以对本发明抗体进行改造以便在Fe区内包括修饰，一般地以改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期，补体结合，Fe受体结合，和/或抗原依赖型细胞毒性。另外，可以对本发明抗体进行化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分附着在抗体上)或进行修饰以便改变其糖基化，再来改变抗体的一种或多种功能特性。下面进一步详述这些实施方案中的每一种。Fe区的残基编号是Kabat的EU索引的编号。
在一个实施方案中，对CHl的铰链区进行修饰从而改变(例如提高或降低)铰链区中半胱氨酸残基的数目。在Bodmer等的美国专利5，677，425中对这一方法作进一步描述。改变CHl的铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如促进轻和重链的组装，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，对抗体的Fe铰链区进行突变以便降低抗体的生物学半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fe-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，从而使得抗体相对于天然Fe-铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合。在Ward等的美国专利6，165，745中对这一方法 作了进一步详述。
在另一个实施方案中，对抗体进行修饰以便提高其生物学半衰期。多种方法是可能的。例如，在授予Ward的美国专利6，277，375中所述，可以导入下列突变中的一种或多种:T252L、T254S、T256F。或者，如在 Presta 等的美国专利 5，869，046 和 6，121，022 中所述为了提高生物学半衰期，可以在CHl或CL区内改变抗体以便包含取自IgG的Fe区中CH2结构域的两个环内的补救(salvage)受体结合表位。
在又一个实施方案中，可以通过用不同氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fe区，以便改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基代替一个或多个氨基酸，从而使得抗体对效应子配体具有改变的亲和性但保留亲本抗体的抗原-结合能力。对于其亲和性改变的效应子配体可以是例如Fe受体或补体的Cl组分。在Winter等的美国专利5，624，821和5，648，260中对这一方法作了进一步详述。
在另一个实施方案中，可以用不同的氨基酸残基代替选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，从而使得抗体具有改变的Clq结合和/或减弱或消除的补体依赖性细胞毒性(⑶C)。在Idusogie等的美国专利6，194, 551中对这一方法作了进一步详述。
在另一个实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体结合补体的能力。在Bodmer等的PCT公开文本W094/29351中对这一方法作了进一步描述。
在又一个实施方案中，通过修饰一个或多个氨基酸而修饰Fe区，以便提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或来提高抗体对Fe y受体的亲和性。在Presta的PCT公开文本W000/42072中对这一方法作了进一步描述。另外，已经对人IgGl上对Fe YRl，Fe Y RII，Fe YRIII和FcRn的结合位点进行作图并已经描述了结合改善的变体(参见 Shields, R.L.等，2001J.Biol.Chem.276:6591_6604)。具有这类经修饰 Fe 区的抗体在本文组合物的范围内。
在又一个实施 方案中，对抗体糖基化进行修饰。例如，可以制备糖苷化(aglycoslated)的抗体(即缺少糖基化作用的抗体)。例如可以改变糖基化以提高抗体对c-Met靶抗原的亲和性。这种糖修饰可以通过例如改变抗体序列内糖基化作用的一个或多个位点来实现。例如可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致一个或多个可变区读码框内糖基化作用位点的消除，由此消除该位点上的糖基化作用。这种糖苷化作用(aglycosylation)可以提高抗体对抗原的亲和性。在Co等的美国专利5，714，350和6，350, 861中对这种方法作了进一步详述。
此外或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有岩藻糖基残基数量减少的hypofucosylated抗体或具有等分GlcNac结构增多的抗体。已经证明这种改变的糖基化作用模式提高抗体的ADCC活性。这种糖修饰可以通过，例如在具有改变的糖基化作用酶学机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化作用机制的细胞已经在现有技术中描述并且可以用作宿主细胞，其中表达本发明重组抗体，由此产生具有改变的糖基化作用的抗体。例如，Hang等的EP1，176，195描述了具有功能被破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，从而使得在这种细胞中表达的抗体显示hypofucosylation。Presta的PCT公开文本W003/035835描述了 CHO细胞系变体，Lecl3细胞，其将岩藻糖附着于Asn (297)-连接的糖上的能力减弱，也导致在该宿主细胞中所表达抗体的 hypofucosylation (还参见 Shields, R.L.等，2002, J.Biol.Chem., 277:26733-26740)。Umana等的PCT公开文本W099/54342描述了这样的细胞系，其经改造来表达糖蛋白修饰型糖基转移酶(例如0 (1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III (GnTIII))，从而使得在经改造细胞系中表达的抗体显示增多的等分GlcNac结构，其导致抗体ADCC活性提高(还参见 Umana 等，1999，Nat.Biotech.，17:176-180)。
本发明所预期的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化，例如以提高抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了对抗体聚乙二醇化，一般在一个或多个PEG基团共价连于抗体或抗体片段上的条件下将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水性聚合物)酰化反应或通过烷化反应来实施。本文所用的术语“聚乙二醇”意在包括已被用来衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，例如单(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是糖苷化的抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明抗体。参见例如Nishimura等的 EPO154316 和 Ishikawa 等的 EP0401384。
改造抗体的方法
如上面所讨论的，具有本文所示VH, Vlj, IgA轻链或IgK轻链序列的抗c-Met抗体可以通过修饰Vh和/或 '，和/或Ig X轻链，和/或Ig K轻链序列中的残基，或通过修饰连接其的恒定区而改造其它抗c-Met抗体。因而，本发明另一方面，本发明抗c-Met抗体的结构特征被用来生成结构上相关的抗c-Met抗体，其保留本发明亲本拮抗或激动性抗体的至少一种功能特性，例如结合人c-Met还有抑制c-Met的一种或多种功能特性(例如,诱导内在化作用、阻止激活、例如源自信号转导的上调、预防或改善细胞增殖，存活，迁移，侵入或形成变化、或者所述抗体抑制c-Met受体结合，预防或改善癌症，例如肿瘤生长和/或转移)，或在激动性的情况下，激活c-Met磷酸化作用以及刺激细胞应答，以及本文所提供的功能特性。
例如，如上所讨论的，可以将本发明抗体的一个或多个CDR区，或其突变与已知框架区和/或其它CDR重组组合以生成另外的，重组改造的本发明抗c-Met抗体。其它类型的修饰包括前节中所述的那些。改造方法用作亲本序列的起始材料是本文提供的一个或多个Vh和/或' 序列或其一个或多个⑶R区。为了生成改造的抗体，不必实际制备(即表达为蛋白质)具有本文提供的一个或多个Vh和/或\序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是，将包含在核苷酸或氨基酸序列中的信息用作本领域已知突变技术中的起始材料来生成源自起始序列的“二代”序列，随后制备“二代”核苷酸序列并表达为蛋白质。
因此，在某些实 施方案中，本发明提供制备抗C-Met抗体的方法，所述抗体具有作为起始亲本材料的Vh抗体序列和'抗体序列，所述Vh抗体序列具有选自SEQ ID NO:55-72的序列，所述\抗体序列具有选自SEQ ID NO:31-54的序列。该方法包括改变Vh和/或\抗体亲本序列内至少一个氨基酸残基以生成至少一种经改变的抗体序列；和将所述经改变的抗体序列表达为蛋白质。
在其它实施方案中，本发明提供制备抗c-Met抗体的方法，该抗体包括具有选自SEQ ID NO:77-80的序列的IgA轻链抗体序列，并改变Ig入轻链抗体序列内的至少一个氨基酸残基以生成至少一种经改变的抗体序列；和将所述经改变的抗体序列表达为蛋白质。
在相关实施方案中，本发明提供制备抗C-Met抗体的方法，该抗体包括具有选自SEQ ID NO:81-84的序列的IgK轻链抗体序列，并改变Ig IgK轻链抗体序列内至少一个氨基酸残基以生成至少一种经改变的抗体序列；和将所述经改变的抗体序列表达为蛋白质。
所述经改变的抗体可以显示本文所讨论的功能特性中的一种或更多种，两种或更多种，或三种或更多种。
可以利用本领域已有的和/或本文所述的标准测定法，例如在实施例中给出的那些(例如ELISA)，来评估所述经改变的抗体的功能特性。
在本发明改造抗体的方法的某些实施方案中，可以在全部或部分抗C-Met抗体编码序列上随机或选择性地导入突变，并且如本文所述可以表达得到的经修饰抗c-Met抗体并筛选结合活性和/或其它功能特性。突变方法已在现有技术中描述过。例如，Short的PCT公开文本W002/092780描述了利用饱和诱变、合成性连接组装或其组合来生成和筛选抗体突变的方法。或者Lazar等的PCT公开文本W003/074679描述了利用计算机筛选法来优化抗体的生理化学特性的方法。
本发明抗体
下面提供了本发明抗体的核苷酸和多肽序列。亲本或初筛抗体的氨基酸和核苷酸序列分别在表A和表C中提供。与亲本抗体相比亲和性修饰的抗体的氨基酸和核苷酸序列分别在表B和表D中提供。
表A:亲本抗c-Met Fab抗体的重和轻链可变区氨基酸序列
权利要求
1.包含对靶蛋白C-Met具有特异性的抗原结合区的分离的人或人源化抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段结合c-Met。
2.根据权利要求1的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段以2.0XKT5M或更小，2.0XKT6M或更小，2.0XKT7M或较小，2.0XKT8M或较小以及2.0X KT9M或较小的Kd结合靶蛋白c-Met。
3.根据权利要求1或2的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段对于靶蛋白c-Met具有1.0Χ1(Γ2每秒或较小，1.0Χ1(Γ3每秒或更小，1Χ1(Γ4每秒或更小或1.0X 10_5每秒或更小的解离速率(Ktjff)。
4.根据权利要求1的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段以2.0XKT5M或更小，2.0XKT6M或更小，2.0XKT7M或更小，2.0XKT8M或更小以及2.0X 10_9Μ或更小的Kd结合靶蛋白c-Met，并抑制HGF结合c_Met。
5.根据权利要求1的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段结合靶蛋白c-Met并调节c-Met磷酸化。
6.根据权利要求5的抗体或其功能性片段，其中激活c-Met磷酸化刺激选自器官再生，伤口愈合和组织再 生的活性中的至少一种。
7.根据权利要求6的抗体或其功能性片段，其中所述器官选自肾、肝、胰、肺、肠、皮肤、胸腺和甲状腺。
8.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体与c-Met的结合由选自下列多种拮抗性或激动性的测定法中的至少一种测定:配体诱导的c-Met信号转导途径酶活性；配体诱导的c-Met信号转导途径基因表达；配体与c-Met基于电化学发光的结合；配体结合c_Met的酶联免疫吸附测定；和细胞的增殖，存活，迁移或转移。
9.根据权利要求1的抗体或其功能性片段的分离的抗原结合区。
10.分离的核苷酸序列，其选自SEQID NO:1-30、73-76和85-88。
11.由根据权利要求10的核苷酸序列编码的分离的氨基酸序列，以及所述氨基酸序列的保守变体。
12.根据权利要求10的分离的核苷酸序列，其中SEQID NO:1_20中的每一种都编码抗原结合轻链。
13.根据权利要求10的分离的核苷酸序列，其中SEQID NO:21-30中的每一种都编码抗原结合重链。
14.分离的抗原结合区，其包含由选自SEQID NO:1-20的核苷酸序列编码的轻链。
15.分离的抗原结合区，其包含由选自SEQID NO:21-30的核苷酸序列编码的重链。
16.分离的抗原结合区，其包含由选自SEQID NO:1-20的核苷酸序列编码的轻链，和由选自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列编码的重链。
17.选自SEQID NO:31-72、77-84和89-96的分离的氨基酸序列及其保守变体。
18.根据权利要求17的分离的氨基酸序列，其中SEQID NO:31-54中的每一种都包含抗原结合轻链。
19.根据权利要求17的分离的氨基酸序列，其中SEQID NO:55-72中的每一种都包含抗原结合重链。
20.分离的抗原结合区，其包含具有选自SEQID NO:31-54的氨基酸序列的轻链。
21.分离的抗原结合区，其包含具有选自SEQID NO:55-72的氨基酸序列的重链。
22.分离的抗原结合区，其包含具有选自SEQID NO:31-54的氨基酸序列的轻链及其保守变体，且包含具有选自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列的重链及其保守变体。
23.分离的氨基酸序列，其与SEQID勵:31-72、77-84和89-96具有至少50，60，70，.80，90，95 或 99%的同一性。
24.分离的核苷酸序列，其与SEQID NO:1-30、73-76和85-88中所示序列具有至少60，.70，80，90，95 或 99%的同一性。
25.分离的抗原结合区，其包含由选自SEQID NO:73的核苷酸序列编码的IgA轻链。
26.分离的抗原结合区，其包含由选自SEQID NO:74-76的核苷酸序列编码的IgK轻链。
27.分离的抗原结合区，其包含如选自SEQID NO:77-80的氨基酸序列所示的IgA轻链。
28.分离的抗原结合区，其包含如选自SEQID NO:81-84的氨基酸序列所示的IgK轻链。
29.根据权利要求1的分离的抗体，其是IgG。
30.根据权利要求29的分离的抗体，其是IgGl,IgG2，IgG3或IgG4。
31.根据权利要求30的分离的抗体，其中所述IgG4由选自SEQID NO:85-88的核苷酸序列编码。
32.根据权利要求31的分离的抗体，其中所述IgG4由与选自SEQID NO:85-88的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的同一性的核苷酸序列编码。
33.根据权利要求30的分离的抗体，其中所述IgG4如选自SEQID NO:89-96的氨基酸序列及其保守变体所示。
34.一种包含对c-Met表位有特异性的抗原结合区的分离的人或人源化抗体或其功能性片段，其中所述抗体或功能性片段结合细胞上的c-Met表面受体，并预防或改善癌症的进行或转移，或预防或改善炎症。
35.根据权利要求1-34中任一项的分离的抗体或功能性片段，其是Fab或scFv抗体片段。
36.根据权利要求35的分离的抗体，其是IgG。
37.根据权利要求36的分离的抗体，其是IgGl,IgG2，IgG3或IgG4。
38.根据权利要求37的分离的抗体，其中所述IgG4由选自SEQID NO:85-88的核苷酸序列编码。
39.根据权利要求38的分离的抗体，其中所述IgG4由与选自SEQID NO:85-88的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的同一性的核苷酸序列编码。
40.根据权利要求37的分离的抗体，其中所述IgG4包含选自SEQID NO:89-96的氨基酸序列及其保守变体。
41.根据权利要求1-34中任一项的分离的抗体或功能性片段，其是Fab片段或scFv抗体片段或骆驼科纳米抗体。
42.根据权利要求1-41中任一项的分离的抗体或其功能性片段，其中所述表位是构象表位。
43.根据权利要求42的表位，其中表位包含c-Met细胞外结构域的氨基酸序列的残基。
44.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-42中任一项的抗体或功能性片段的至少一种，以及可药用载体或赋形剂。
45.一种转基因动物，其携带编码根据权利要求1-42中任一项的抗体或其功能性片段的基因。
46.一种治疗c-Met相关病症或状况的方法，其包括向需要其的受试者施用有效量的根据权利要求44的药物组合物。
47.根据权利要求46的方法，其中所述病症或状况是癌症或炎症。
48.根据权利要求47的方法，其中所述癌症选自脑癌、胃癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、前列腺癌、膀胱癌(浅表和肌肉侵入型)、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤(包括成胶质细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤)、食道癌、胃癌、胃肠癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)包括小儿HCC、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌、鼻咽癌)、胡尔特尔细胞癌、上皮癌、皮肤癌、黑素瘤包括恶性黑素瘤，间皮瘤，淋巴瘤，骨髓瘤包括多发性骨髓瘤、白血病、肺癌包括非小细胞肺癌(包括所有组织学亚型:腺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、大细胞癌和腺鳞癌混合型)、小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌包括遗传性和偶发性乳突状肾细胞癌I型和II型，以及透明细胞肾细胞癌；肉瘤，特别是骨肉瘤、透明细胞肉瘤和软组织肉瘤(包括肺泡状和胚胎性横纹肌肉瘤、肺泡状柔软部分肉瘤)；甲状腺癌(乳突状和其它亚型)。
49.根据权利要求48的方法，其中所述癌症选自肝癌和食道癌。
50.根据权利要求46的方法，其中所述方法还包括施用化疗剂。
51.根据权利要求50的方法，其中所述化疗剂是抗癌剂。
52.治疗有害细胞的方法，其包括将细胞与根据权利要求1-42中任一项的抗体或其功能性片段相接触。
53.根据权利要求52的方法，其中所述细胞具有c-Met。
54.根据权利要求52或53的方法，还包括用化疗剂或放射来处理细胞。
55.根据权利要求46-54中任一项的方法，其中在施用或接触后，该方法还包括观察癌症进行或转移的改善或延迟。
56.一种鉴定包含c-Met的细胞的方法，该方法包括将细胞与根据权利要求1-42中任一项的抗体或抗体片段相接触，其中所述抗体或片段还包括可检测标记。
57.根据权利要求56的方法，其中所述标记是放射性的，荧光的，磁性的，顺磁性的或化学发光的标记。
58.根据权利要求56的方法，还包括成像或分离细胞的步骤。
59.根据权利要求1-42中任一项的人抗体或人源化抗体或抗体片段，其中所述抗体是合成抗体。
60.根据权利要求44的药物组合物，还包括另外的治疗剂。
61.根据权利要求60的药物组合物，其中另外的治疗剂选自抗癌剂；抗生素；消炎剂；生长因子和细胞因子。
62.一种分离的抗体，其具有第一氨基酸序列，其是选自SEQ ID NO:55-72的重链及与选自SEQ ID NO:55-72的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的序列同一性的序列;和第二氨基酸序列，其是选自SEQ ID NO:31-54的轻链及与选自SEQ ID NO:31-54的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的序列同一性的序列。
63.包含第一组分的免疫缀合物，所述第一组分是根据权利要求1-42中任一项的抗体或其片段。
64.根据权利要求63的免疫缀合物，其包括具有第二种氨基酸序列的第二组分。
65.根据权利要求64的免疫缀合物，还包括细胞毒素。
66.根据权利要求64的免疫缀合物，其中第二序列是对不同于c-Met的靶标具有结合特异性的结合蛋白质或抗体。
67.根据权利要求64的双特异性抗体。
68.根据权利要求67的双特异性抗体，其中结合特异性不同于c-Met的靶标是癌细胞表面上的肿瘤抗原或肿瘤相关蛋白。
69.包含根据权利要求1-42中任一项的抗体或其片段的试剂盒。
70.根据权利要求69的试剂盒，还包括可药用载体或赋形剂。
71.根据权利要求69的试剂盒，其中所述抗体以单位剂量的形式存在并且还包括向受试者给 药的使用说明书。
全文摘要
本发明提供了结合蛋白靶标c-Met，特别是结合位于c-Met细胞外结构域中的表位的抗体和片段，还提供了所述抗体的使用方法和试剂盒，以及用于治疗有害细胞，特别是与c-Met相关状况例如癌症、转移或炎症相关联的细胞的方法。
文档编号A61P35/00GK103183738SQ20131007300
公开日2013年7月3日 申请日期2007年3月29日 优先权日2006年3月30日
发明者D·R·斯托弗, J·普拉斯勒, C·博格尔, B·布洛克斯 申请人:诺瓦提斯公司