专利名称：京尼平氨基酸衍生物作为NF-κB抑制剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种作为NF-K B抑制剂，用于预防、缓解和/或治疗情感性精神障碍神经系统疾病(抑郁症)及慢性、急性炎症等的药物或保健食品，特别涉及用于治疗NF- K B异常激活有关的药物或保健食品。
背景技术：
核转录因子-κB (nuclear transcription factor kappa-B, NF- κ B)最早是从 B细胞核提取物中发现的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κ B序列(GGGACTTTCC)特异结合的核蛋白因子，因而称之为NF-κ B。通常生理情况下NF-κ B与抑制蛋白因子IKBdnhibitor of κ B) 在胞质中结合，处于非激活状态。当受到外源性刺激后，I κ B激酶(ΙΚΚ，包括IKK α和IKK β )被激活，能在氨基酸末端丝氨酸残基特异位点(I K B α和I K B β )磷酸化抑制蛋白因子I K B。I κ B α在32和36位氨基酸末端丝氨酸残基被磷酸化，而I κ B β在19和23位氨基酸末端丝氨酸残基被磷酸化。磷酸化后的IkB被Ε3泛素连接酶选择性泛素化，导致存在于胞浆内的已磷酸化及泛素化的I κ B被26S蛋白酶降解。降解后的I κ B与NF- κ B分离，NF- κ B由细胞质转移到细胞核内，启动众多细胞介质和炎症因子(如TNF-a，IL-6, IL-1 β，iNOS, COX-2, G-CSF，sICAM-1, IL-1 a，IL-lra, KC, JE, MIP-1 β，RANTES等)的基因转录和蛋白表达，从而参与组织细胞的生理、病理反应。NF- κ B通路激活后产生活化的NF- κ B，而活化的NF- κ B功能的失调与多种人类疾病相关，如恶性肿瘤，自身免疫性疾病(如类风湿关节炎等),心脑血管疾病,急性、慢性炎症，神经系统疾病(如抑郁症，阿尔茨海默病等)。例如:在严重抑郁性障碍病症中，激活NF-κ B通路后能够增加炎性因子的表达，并且能够增加5ΗΤ1Α基因的表达，减少5-ΗΤ神经元和5-羟色胺能神经递质的释放，最终导致抑郁症。因此，NF-κ B已成为一个重要的药物作用靶点。针对NF-κ B通路激活途中的不同环节作为靶点进行拮抗，是治疗上述疾病的关键。寻找NF-κ B通路抑制剂，对哮喘，严重抑郁性障碍等具有重要的临床治疗意义。NF-KB是调控众多炎症基因表达的关键转录因子，其通常以非活性状态存在于细胞质中，当细胞受到LPS、TNF- α等刺激时，NF- κ B得以活化并从细胞质易位到细胞核，启动多种炎症基因表达，使大量的炎性细胞浸润于炎症部位。巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的作用，它通过激活机体的免疫系统，释放细胞因子、具有生物活性的脂类介质等一系列炎症介质，参与炎症反应。NF- κ B发生核转位是一些免疫和炎症反应的重要步骤，应用NF-κ B抑制剂以减少炎症介质的产生成为治疗炎症的新思路。京尼平氨基酸衍生物，又称京尼平蓝或桅子蓝色素，在东亚被作为天然食品添加剂广泛应用于食品加工业及化妆品和医药工业。桅子蓝色素是以桅子的果实为原料，通过酶促反应产生的一种纯天然蓝色素，它是桅子苷在β -葡糖糖苷酶的作用下水解生成京尼平，京尼平与含有伯胺基的氨基酸(甘氨酸，赖氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸等)在合适的条件下发生聚合反应的产物，京尼平与甘氨酸的反应方程式如图1所示。
京尼平氨基酸衍生物除上述作为天然食品添加剂用于食品、化妆品和医药工业夕卜，未见其有抑制NF- κ B活性的报道。
发明内容
本发明的目的是提供京尼平氨基酸衍生物在制备治疗人和动物因NF-κ B因子异常激活相关疾病药物或保健品的应用；尤其是恶性肿瘤，自身免疫性疾病(如类风湿关节炎等),心脑血管疾病，急性、慢性炎症，情感性精神障碍神经系统疾病(如抑郁症，阿尔茨海默病等)等相关疾病的应用；其次是该衍生物能够与其他药物连用，作为增敏剂用于治疗急性、慢性炎症及抑郁症等与NF-κ B因子异常激活相关疾病的用途。为实现上述目的，本发明一方面提供一种京尼平氨基酸衍生物在制备核因子NF-κ B抑制剂的用途。京尼平氨基酸衍生物在制备用于预防、缓解和/或治疗由核因子NF-K B活化引起的病理性病症的药物或保健品中的用途。其中，所述病理性病症为恶性肿瘤，自身免疫性疾病(如类风湿关节炎等)，心脑血管疾病，急性炎症、慢性炎症，神经系统疾病(如抑郁症，阿尔茨海默病等)中的一种或多种，优选为急性炎症、慢性炎症或抑郁症中的一种或多种。其中，所述的京尼平氨基酸衍生物为京尼平与含有伯胺基的氨基酸的衍生物。特别是，所述的含有伯胺基的氨基酸选择丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等中的一种或多种。本发明的京尼平氨基酸衍生物按照如下顺序进行的步骤制备而成:本发明选用的是菌草科(Rubiaceae)植物桅子(Gardeniajasminoides Ellis)果实的主要化学成分桅子苷(Geniposide)，在β -葡糖糖苷酶的作用下水解生成京尼平，京尼平与含有伯胺基的氨基酸(丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等)在合适的条件下发生聚合反应的产物。具体制备条件如下:将等摩尔量的京尼平和氨基酸加入到PBSdOOmmol，pH7.0)缓冲溶液中，80°C搅拌4h，接着将得到的京尼平氨基酸衍生物过HP-20大孔树脂柱，进行分离，并收集吸光度值为590nm的洗脱液，将收集到的洗脱液冷冻干燥机干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。得到的京尼平氨基酸衍生物密封于2-8°C冷藏保存，待用。其中，所述京尼平氨基酸衍生物按照如下顺序进行的步骤制备而成:I)将等摩尔的京尼平和氨基酸依次加入到PBS缓冲溶液(磷酸缓冲溶液)中，混匀；2)加热并保持温度为60_80°C，电磁搅拌反应至少4h，即得。特别是，步骤 I)中所述京尼平为桅子苷(Geniposide)在β -葡糖糖苷酶的作用下水解而成；所述氨基酸为含有伯胺基的氨基酸，例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等；所述PBS缓冲溶液的pH值为7.0。尤其是，所述氨基酸选择甘氨酸、酪氨酸。其中，步骤I)中所述京尼平与所述PBS溶液的的摩尔数之比为8.8:100。特别是，每IOOml所述PBS溶液中加入2.2mmol所述京尼平。其中，步骤2)中所述温度优选为80°C，电磁搅拌反应时间为4_8h。特别是，还包括步骤3)，将反应混合物通过HP-20大孔树脂柱，进行洗脱、分离，收集吸光度值为590nm的洗脱液，然后将洗脱液干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。尤其是，所述的梯度洗脱的洗脱剂为乙酸乙酯-甲醇-水的混合溶液，其中洗脱剂中乙酸乙酯-甲醇-水的体积之比为8:3:1。其中，所述药物由京尼平氨基酸衍生物和药学上可接受的载体组成。本发明中所述的京尼平氨基酸衍生物作为一种NF-K B抑制剂时，可以单独使用，也可以通过含有京尼平氨基酸衍生物的药物组合物的形式使用。本发明所述药物是通过口服、舌下、经皮、肌肉、皮下、皮肤黏膜、尿道、阴道、静脉等途径给药。药物组合物，通过本发明药物组合物含有0.1-99.9%重量的京尼平氨基酸衍生物，药物组合可以根据本领域已知的方法制备。本发明所述所述京尼平氨基酸衍生物纯度超过90%。
本发明以京尼平氨基酸衍生物为活性成分，制备用于因核因子NF-κ B活化引起疾病的抑制剂的药物制剂和相应的药物剂型。所述药物制剂是以所述京尼平氨基酸衍生物为有效活性成分，并包括了药剂学上可接受的其它载体组分。本发明所述药物以口服制剂、注射剂、局部给药制剂形式存在。其中所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂；注射剂包括注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂包括霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂。本发明中所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂形式存在，即药物制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂等形式，但不局限于以上形式。在制备口服制剂时可选用的载体可以是淀粉、糊精或环糊精及各种化学修饰环糊精、蔗糖、硬脂酸盐等常规制药辅料。在制备冻干粉针剂时可以通过无菌喷雾干燥、低温真空干燥、冷冻干燥等方法制备。各制剂的后期制备工艺及设备均属于制药领域的常规技术，本发明对此不作限定。本发明具有如下的明显优点:1、本发明发掘了京尼平氨基酸衍生物新的用途，将其用于核因子NF-κ B抑制剂，并可制备成预防、缓解和/或治疗由核因子NF-κ B活化引起的病理性病症的药物或保健品，从而为京尼平氨基酸衍生物的应用开拓了一个新的领域。2、本发明的京尼平氨基酸衍生物作为核因子NF-κ B抑制剂的作用机理明确，疗效显著，毒副作用小、安全性好，能够长期服用，具有较高的成药性和良好的药用前景。3、本发明的产品来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，使用方便，因此易于推广。
图1是京尼平与甘氨酸的反应方程式。图 2 是以 β -actin 作为内参，Western Blot 分析 Ρ_Ι κ B-α，I κ B-α，IKK-α，ΙΚΚ-β蛋白的表达的凝聚电泳图。图3是与炎症相关40种蛋白表达的蛋白芯片扫描图；其中(a)为空白对照组蛋白芯片扫描图，(b)为模型组(LPS刺激组)蛋白芯片扫描图，(c)为京尼平甘氨酸衍生物组的蛋白芯片扫描图。图4是蛋白芯片中与炎症相关40种蛋白表达结果的光密度分析图；其中LPS为模型组，Blue pigments为京尼平甘氨酸衍生物组。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物或保健品的NF-K B抑制作用，这些试验例包括了本发明药物的药效学试验。本发明采用体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW274.7细胞株，给予京尼平甘氨酸衍生物(25，50，100 μ Μ)干预2h后，LPS (脂多糖200ng/mL)刺激0.5h后，验证药物对NF- κ B通路的抑制作用。本发明通过体外细胞实验 验证京尼平氨基酸衍生物对炎症相关因子基因、蛋白的调节作用；通过体内动物模型(角叉菜胶诱导小鼠足趾肿胀，LPS腹腔注射诱导小鼠急性炎症模型)验证京尼平氨基酸衍生物对急性炎症的调节作用；通过小鼠行为绝望实验、小鼠开放场实验、小鼠利血平拮抗实验以及大鼠慢性温和不可预知性应激实验来验证京尼平氨基酸衍生物的抗抑郁作用。本发明中使用的药物京尼平氨基酸衍生物为京尼平丙氨酸衍生物，京尼平缬氨酸衍生物，京尼平亮氨酸衍生物，京尼平异亮氨酸衍生物，京尼平苯丙氨酸衍生物，京尼平色氨酸衍生物，京尼平甲硫氨酸衍生物，京尼平脯氨酸衍生物，京尼平甘氨酸衍生物，京尼平丝氨酸衍生物，京尼平苏氨酸衍生物，京尼平半胱氨酸衍生物，京尼平酪氨酸衍生物，京尼平天冬酰胺氨酸衍生物，京尼平谷胺酰胺氨酸衍生物，京尼平组氨酸衍生物，京尼平赖氨酸衍生物，京尼平精氨酸衍生物，京尼平天冬氨酸衍生物，京尼平谷氨酸衍生物等。本发明中使用的药物京尼平氨基酸衍生物按照如下方法制备而成:将8.8mmol的京尼平和8.8mmol的氛基酸依次加入到400mT,的PBS(100mmol,PH7.0)溶液中，80°C搅拌4h，接着将得到的京尼平氨基酸衍生物过HP-20大孔树脂柱，进行洗脱分离，并收集吸光度值为590nm的洗脱液，将收集到的洗脱液冷冻干燥机干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。得到的京尼平氨基酸衍生物密封于2-8° C冷藏保存，待用。试验例INF-κ B 核因子转录试剂盒法(NF-κ B Universal EZ-TFA TranscriptionFactor Assay)和 Western Blot 法检测 NF- κ B 活性1.1实验材料
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株，中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供；含有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠及Hepes配方的DMEM高糖培养基(干粉)，Sigma-Aldrich公司(美国)。按照说明书用MilliQ级纯水配制并过滤除菌，2-8°C冷藏保存；含有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠，不含酚红配方的DMEM高糖培养基(液体)，Hyclone公司(美国)；热灭活胎牛血清(H1-FBS), Bioind公司(以色列)；核蛋白提取试剂盒，Active Motif公司(日本)；NF- κ B Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay (NF-κ: B 核因子转录试剂盒)，Millipore公司(美国);Ρ_Ι κ B- α , I κ B- a , IKK-α，IKK-β单克隆抗体和过氧化物酶标记的二抗，Cell Singaling Technology 公司(美国)；β -actin 单克隆抗体,Sigma-AIdrich公司(美国)；Horseradish peroxidase substrate 显色底物，Millipore 公司(美国)；NF- κ B inhibitor BAY11-7082,碧云天生物技术研究所(中国)；京尼平甘氨酸衍生物,京尼平酪氨酸衍生物，本实验室自制；Ma_alian Cell Lysis细胞裂解试剂盒,上海生工生物工程技术服务有限公司(中国)；BCA总蛋白测定试剂盒，Pierce公司(美国)；Tris Base,Sigma-Aldrich 公司(美国)。1.2实验方法1.2.1核蛋白提取I)将RAW264.7细胞以每孔5.0 X IO6个细胞种植到6孔细胞培养板，培养24h后换液，将供试细胞分成6组，空白对照组，模型组，京尼平甘氨酸衍生物高剂量组，京尼平甘氨酸衍生物中剂量组，京尼平甘氨酸衍生物低剂量组和对照药物组，其中空白对照组换入无酚红DMEM培养基组；模型组换入含LPS (200ng/mL)的无酚红DMEM培养基；京尼平甘氨酸衍生物高剂量组换入含有京尼平甘氨酸衍生物(100 μ Μ) +LPS (200ng/mL)的无酚红DMEM培养基；京尼平甘氨酸衍生物中剂量组换入含有京尼平甘氨酸衍生物(SOyMHLPSOOOng/mL)的无酚红DMEM培养基；京尼平甘氨酸衍生物低剂量组换入含有京尼平甘氨酸衍生物(25 μ M)+LPS (200ng/mL)的无酚红DMEM培养基；对照药物组换入含有NF-κ B抑制剂BAYl 1-7082 (10 μ Μ) +LPS (200ng/mL)的无酚红 DMEM 培养基。
2)换入无酚红DMEM培养基药物干预2h后，加入浓度为200ng/mL的LPS再刺激30min，然后用冷的PBS(磷酸缓冲液，pH7.4)清洗细胞3次。加入细胞裂解液后按照核蛋白提取试剂盒(Active Motif)进行。将提取得到的核蛋白用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)进行蛋白定量，最后用无菌的PBS将蛋白浓度调整为2mg/mL。1.2.2NF- κ B核因子转录实验NF-κ B是调控众多炎症基因表达的关键转录因子，其通常以非活性状态存在于细胞质中，当细胞受到LPS、TNF-α等刺激时，NF-kB得以活化并从细胞质易位到细胞核，启动多种炎症基因表达。NF- κ B活化入核主要是其亚基Ρ50和Ρ65，因此测定其亚基Ρ50和Ρ65的活性，能够反映出NF-κ B入核情况。核因子转录实验采用Universal EZ-TFATranscription Factor Assay试剂盒进行，将 1.2.I 提到的核蛋白，按照Universal EZ-TFATranscription Factor Assay试剂盒说明书进行操作。1.2.3ffestern Blot 法检测 NF- κ B 活性I)将RAW264.7细胞以每孔5.0X IO6个细胞种植到6孔细胞培养板，培养24h后换液，换入含有药物的无酚红DMEM培养基，药物组分别为京尼平甘氨酸衍生物组(给药组)，BAYl 1-7082组(阳性对照药组)，和无酚红DMEM培养基组(空白对照组)。供试细胞分成6组，分别为(I)空白对照组，(2)模型组:LPS (200ng/mL), (3)京尼平甘氨酸衍生物高剂量组:京尼平甘氨酸衍生物(100yM)+LPS(200ng/mL)，(4)京尼平甘氨酸衍生物中剂量组:京尼平甘氨酸衍生物(50 μ M)+LPS (200ng/mL)，(5)京尼平甘氨酸衍生物低剂量组:京尼平甘氨酸衍生物(25 μ Μ) +LPS (200ng/mL) (6)对照药物组:BAY11-7082 (10 μ M) +LPS (200ng/mL)。2)换入无酚红DMEM培养基药物干预2h后，加入浓度为200ng/mL的LPS再刺激30min，然后用冷的PBS(磷酸缓冲液，pH7.4)清洗细胞3次。蛋白提取按照Mammalian CellLysis说明书进行。将提取得到的核蛋白用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)进行蛋白定量，最后用无菌的PBS将蛋白浓度调整为2mg/mL。5)配置蛋白电泳分离胶即配制浓度为8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳分离，其中，蛋白上样量为30 μ g ;电泳条件为:层积胶电压80V，30min ;分离胶电压100V，60min，电泳完后湿法转至 PVDF 膜，一抗(P-1 κΒ-α , I κ B- a , IKK- α，IKK- β，β -actin) 4°C过夜，清洗干净后二抗室温孵育lh，二抗清洗干净后加入显色底物，X光片曝光显影，凝胶成像分析系统扫描，凝胶电泳分析结果如图2所示。1.3实验结果1.3.1Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay 结果实验数据以平均值土标准偏差(X土s)表示，使用SPSSl1.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way AN0VA)法，以P〈0.05和P〈0.01为具有统计学意义。核因子NF- κ B p50和p65转录实验结果如表I所示。表I 核因子 NF-K B p50 和 p65 转录(x土 s，n=6)
权利要求
1.京尼平氨基酸衍生物的核因子NF-K B抑制剂的用途。
2.京尼平氨基酸衍生物在制备用于预防、缓解和/或治疗由核因子NF-κB活化引起的病理性病症的药物或保健品中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征是所述病理性病症为恶性肿瘤，自身免疫性疾病，心脑血管疾病，急性炎症、慢性炎症，神经系统疾病中的一种或多种。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征是所述的京尼平氨基酸衍生物为京尼平与含有伯胺基的氨基酸的衍生物。
5.如权利要求4所述的用途，其特征是所述的含有伯胺基的氨基酸选择丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等中的一种或多种。
6.如权利要求1或2所述的用途，其特征是所述药物由京尼平氨基酸衍生物和药学上可接受的载体组成。
7.如权利要求1或2所述的用途，其特征是所述药物是通过口服、舌下、经皮、肌肉、皮下、皮肤黏膜、尿道、阴道、静脉途径给药。
8.如权利要求1或2所述的用途，其特征是所述药物以口服制剂、注射剂或局部给药制剂形式存在。
9.如权利要求8所述的用途，其特征是所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂或溶液剂；注射剂包括注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂包括霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或贴剂。
10.如权利要求1或2所述的用途，其特征是所述京尼平氨基酸衍生物纯度超过90%。
全文摘要
本发明公开了一种京尼平氨基酸衍生物的NF-κB抑制剂的用途，京尼平氨基酸衍生物作为NF-κB抑制剂控制参与肿瘤转移的各种炎性细胞因子、主要的组织适合性复合基因、粘着分子的表达，通过阻断核因子NF-κB活化来抑制和治疗因NF-κB活化引起的病理性病症，如恶性肿瘤，自身免疫性疾病(如类风湿关节炎等)，心脑血管疾病，急性、慢性炎症，神经系统疾病(如抑郁症，阿尔茨海默病等)，而且京尼平氨基酸衍生物能以与剂量和时间依赖的方式抑制NF-κB活性。本发明为NF-κB抑制剂及其NF-κB控制的相关疾病提供了一种新的药物来源。
文档编号A61P29/00GK103191106SQ20131007377
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月8日 优先权日2012年3月29日
发明者崔元璐, 王强松, 胡利民, 高秀梅, 田俊生, 王跃飞 申请人:天津中医药大学