专利名称：特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用，特别涉及利用特非那定制备斑马鱼心功能损伤模型，用于筛选心脏保护作用药物中的应用，属于药物筛选技术领域。
背景技术：
心功能损伤是各种心脏腔室结构改变或心肌受损所导致心脏功能进行性障碍综合征。临床表现为心脏扩大、心律失常及心力衰竭等。心功能损伤是心脏整体机能异常的综合反映。病毒感染、自身免疫反应、遗传、药物中毒和代谢异常等都可以引起心功能损伤。开发具有防止、延缓心功能损伤的发生和/或缓解临床心功能损伤症状作用的药物，将会带来显著的经济和社会效益。药物筛选是 发现、开发药物过程中的一个重要的环节，实验动物心功能损伤模型的建立对评价和筛选心功能损伤预防/治疗药物至关重要。目前，心功能损伤动物模型以啮齿类为主的哺乳动物体内评价模型，大多采用冠状动脉结扎手术，建立大鼠心功能损伤动物模型。哺乳动物体内评价模型可从整体水平直观地反映药物的心脏保护作用，但不适合新药研发早期药物毒性的高通量筛选。由于哺乳类动物模型建模方法的局限性，越来越多的研究人员使用斑马鱼进行药物心功能损伤的评价。据文献报道，利用斑马鱼模型进行化合物心功能损伤评价实验的研究结果表明，斑马鱼与哺乳动物的心脏对药物的反应非常相似[Sukardi H, Chng HT, ChanEYj Gong Zj Lam SH.Zebrafish for drug toxicity screening:bridging the in vitrocell—based models and in vivo mammalian models.Expert Opin.Drug Metab.Toxicol.2011，7 (5): 579-589.]。斑马鱼个体小，成鱼体长3_4厘米，样品用量少；斑马鱼基因组与人类基因组同源性达到85%左右；易于养殖，养殖成本低；体外发育，胚胎透明，胚胎发育快，受精后48小时，心脏就已经发育成熟；产卵量大，每对亲鱼每周可产200-300个卵，利于大规模的检测。斑马鱼的心脏包含心房、心室和静脉窦，心电图谱也与哺乳动物类似，这说明利用斑马鱼建立心功能损伤模型切实可行。然而，目前将斑马鱼用来心功能损伤评价都是基于正常的斑马鱼。方芳等[方芳，赵杰，余林中，罗佳波。乌头碱对斑马鱼心脏毒性的初步研究。中药药理与临床，2012，28
(2):31-33.]观察了乌头碱对斑马鱼心脏的影响，王思锋等[王思锋，刘可春，王希敏，何秋霞，韩利文，侯海荣。雷公藤红素对斑马鱼胚胎心脏毒性的初步研究。中国药理学通报，2009,25 (5):634-636。]研究了雷公藤红素对斑马鱼心脏的损伤作用。他们都是以正常发育的2天的斑马鱼为模型，观察斑马鱼心脏形态和心率的变化。该方法的优势是根据斑马鱼心脏形态和心率的变化能够直接快速的发现化合物潜在的致心脏功能受损特性。但是在药物筛选过程中，致心功能受损特性大多属于副作用，要尽可能避免。因此，心功能损伤模型在药物筛选领域应用对于筛选具有保护心脏作用的药物可能更有意义。然而感到遗憾的是，在斑马鱼这个新生模式生物上尚未建立一个稳定并被认可的心功能损伤模型。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用。本发明的目的之二是利用建立的斑马鱼心功能损伤模型，筛选、定性或定量评价用于保护心脏的药物的方法。特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用。上述应用，步骤如下:将受精后2 3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5 20 y mol吨―1的养殖用水溶液中，28°C下恒温培养24 48小时，制得斑马鱼心功能损伤模型。根据本发明优选的，所述的养殖用水溶液是向养殖用水中加入二甲基亚砜配制的体积浓度不大于0.5%的溶液。根据本发明优选的，特非那定浓度为Wmol L'利用上述制备斑马鱼心功能损伤模 型筛选用于保护心脏的药物的方法，步骤如下:(I)将受精后2 3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5 20 u mol L—1的养殖用水溶液中，28°C下恒温培养4 24小时后，加入待测化合物，使待测化合物浓度为0.1 1000 u mol L—1，继续培养20 24小时，得到给药斑马鱼；或者，将受精后2 3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5 20 u mol L'待测化合物浓度为0.1 IOOOiimol L—1的养殖用水溶液中，28°C下恒温培养24 48小时，得到给药斑马鱼；(2)将步骤(I)制得的给药斑马鱼用质量浓度为0.3%。的三卡因麻醉，然后用3%甲基纤维素固定于载玻片上，在显微镜下观察斑马鱼心脏形态，或者，显微镜下观察记录斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离；(3)取斑马鱼心功能损伤模型，用质量浓度为0.3%。的三卡因麻醉，然后用3%甲基纤维素固定于载玻片上，在显微镜下观察模型斑马鱼心脏形态，或者，显微镜下观察记录模型斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离；(4)将步骤(2)得到的斑马鱼心脏形态与步骤(3)得到的模型斑马鱼心脏形态进行比较；待测化合物组的斑马鱼心脏水肿面积和血细胞淤积面积与心脏损伤模型组的心脏水肿面积和血细胞淤积面积相比减少20%以上或者与溶剂对照组/空白对照组的心脏水肿面积和血细胞淤积面积相当，则待测化合物具有心脏保护作用；或者，将步骤(2)得到的斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离长度数据与步骤
(3)得到的模型斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离长度进行比较；经统计分析后，化合物处理组的心率与心脏损伤模型组的心率相比升高且满足统计学上的p值< 0.05，动脉球-静脉窦距离缩短且满足统计学上的P值< 0.05，则待测化合物具有心脏保护作用。根据本发明优选的，所述步骤(I)中特非那定浓度为5 y mol L'根据本发明优选的，所述步骤(I)中养殖用水溶液是向养殖用水中加入二甲基亚砜配制的体积浓度不大于0.5%的溶液。根据本发明优选的，所述步骤(2)或步骤(3)中，显微镜下观察的温度为25°C。根据本发明优选的，所述步骤(2)或步骤(3)中，心脏形态为心包水肿形态和心脏出血形态。根据本发明优选的，所述步骤(2)或步骤(3)中，测量动脉球-静脉窦距离的方法如下，使待测量斑马鱼胚胎呈侧卧状态，使两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面，通过体视显微镜的目镜中的测微尺测量动脉球与静脉窦之间的距离。
上述养殖用水为本领域常用斑马鱼养殖用水,养殖用水中含有:摩尔浓度为5mM的NaCl、摩尔浓度为0.17mM的KC1、摩尔浓度为0.33mM的CaCl2、摩尔浓度为0.33mM的Mg2SO4,以及质量百分浓度为10_5%的甲基蓝，去离子水配制而成。有益效果1、本发明首次利用特非那定建立斑马鱼心功能损伤模型，建立的斑马鱼心功能损伤模型具有制作简便、快速、稳定可靠和重复性好的优点，降低了心功能损伤模型的制作成本，提高了实验研究结果的可靠性。2、本发明提供利用斑马鱼心功能损伤模型筛选具有心功能损伤保护作用药物的方法，该方法通过观察斑马鱼心脏形态实现了定性分析，通过记录斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离进行定量分析。
图1:特非那定对斑马鱼心功能损伤的形态学照片其中:A、空白对照组，B、溶剂对照组，C、I μ mol.Γ1的特非那定处理组，D、5 μ mol.L-1的特非那定处理组，E、10 μ mol.L-1的特非那定处理组，F、15 μ mol.L-1的特非那定处理组，G、20 μ mol.Γ1的特非那定处理组；图2:尼卡地尔对特非那定引起斑马鱼心功能损伤的修复作用形态学照片。 其中:Α、空白对照组，B、溶剂对照组，C、5 μ mol.Γ1的特非那定处理组，D、5 μ mol.L—1的特非那定+1 μ mol.L—1尼卡地尔处理组，Ε、5 μ mol.L—1的特非那定+10 μ mol.L—1尼卡地尔处理组，F、5 μ mol.L—1的特非那定+100 μ mol.L—1尼卡地尔处理组；图3:卡维地洛对特非那定引起斑马鱼心功能损伤的预防作用形态学照片。其中:A、空白对照组，B、溶剂对照组，C、5 μ mol.Γ1的特非那定处理组，D、5 μ mol.L—1的特非那定+1 μ mol.L—1卡维地洛处理组，Ε、5 μ mol.L—1的特非那定+10 μ mol.Γ1卡维地洛处理组，F、5 μ mol.Γ1的特非那定+100 μ mol.Γ1卡维地洛处理组。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实验材料养殖用水(EmbryoMedium)养殖用水配方如表I所示表1.养殖用水的配方
权利要求
1.特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下: 将受精后2 3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5 20 μ mo 1-Γ1的养殖用水溶液中，28°C下恒温培养24 48小时，制得斑马鱼心功能损伤模型。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的养殖用水溶液是向养殖用水中加入二甲基亚砜配制的体积浓度不大于0.5%的溶液。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，特非那定浓度为δμπιο .ΙΑ
5.利用斑马鱼心功能损伤模型筛选用于保护心脏的药物的方法，其特征在于，步骤如下: (1)将受精后2 3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5 20μ mo 1-Γ1的养殖用水溶液中 ，28°C下恒温培养4 24小时后，加入待测化合物，使待测化合物浓度为0.1 1000 μ mo I.ιΛ继续培养20 24小时，得到给药斑马鱼； 或者，将受精后2 3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5 20 μ mo I.L'待测化合物浓度为0.1 IOOOymol.Γ1的养殖用水溶液中，28°C下恒温培养24 48小时，得到给药斑马鱼； (2)将步骤(I)制得的给药斑马鱼用质量浓度为0.3%。的三卡因麻醉，然后用3%甲基纤维素固定于载玻片上，在显微镜下观察斑马鱼心脏形态，或者，显微镜下观察记录斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离； (3)取斑马鱼心功能损伤模型，用质量浓度为0.3%。的三卡因麻醉，然后用3%甲基纤维素固定于载玻片上，在显微镜下观察模型斑马鱼心脏形态，或者，显微镜下观察记录模型斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离； (4)将步骤(2)得到的斑马鱼心脏形态与步骤(3)得到的模型斑马鱼心脏形态进行比较；待测化合物组的斑马鱼心脏水肿面积和血细胞淤积面积与心脏损伤模型组的心脏水肿面积和血细胞淤积面积相比减少20%以上或者与溶剂对照组/空白对照组的心脏水肿面积和血细胞淤积面积相当，则待测化合物具有心脏保护作用； 或者，将步骤(2)得到的斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离长度数据与步骤(3)得到的模型斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离长度进行比较；经统计分析后，化合物处理组的心率与心脏损伤模型组的心率相比升高且满足统计学上的P值< 0.05，动脉球-静脉窦距离缩短且满足统计学上的P值< 0.05，则待测化合物具有心脏保护作用。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中特非那定浓度为5 μ mo I.L 1。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中养殖用水溶液是向养殖用水中加入二甲基亚砜配制的体积浓度不大于0.5%的溶液。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)或步骤(3)中，显微镜下观察的温度为25°C。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)或步骤(3)中，心脏形态为心包水肿形态和心脏出血形态。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)或步骤(3)中，测量动脉球-静脉窦距离的方法如下，使待测量斑马鱼胚胎呈侧卧状态，使两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面， 通过体视显微镜的目镜中的测微尺测量动脉球与静脉窦之间的距离。
全文摘要
本发明涉及特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用，步骤如下将受精后2～3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定的养殖用水溶液中，28℃下恒温培养24～48小时，制得斑马鱼心功能损伤模型。本发明首次利用特非那定建立斑马鱼心功能损伤模型，建立的斑马鱼心功能损伤模型具有制作简便、快速、稳定可靠和重复性好的优点，降低了心功能损伤模型的制作成本，提高了实验研究结果的可靠性。
文档编号A61K31/445GK103230397SQ20131016343
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者何秋霞, 刘可春, 韩利文, 彭维兵, 陈锡强, 张云, 王雪, 侯海荣, 王希敏, 楚杰 申请人:山东省科学院生物研究所