专利名称：一种新型的人源化抗cd22抗体的制作方法
技术领域：
:本发明涉及一种新型的人源化抗⑶22抗体，属于生物工程技术领域。
背景技术：
:非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma, NHL)是一组起源于淋巴结和其他淋巴组织的恶性肿瘤,是淋巴瘤的一大类型(除霍奇金淋巴瘤以外)。主要临床表现可归纳如下:1、浅表淋巴结肿大或形成结节肿块；2、体内深部淋巴结肿块；3、结外淋巴组织的增生和肿块；4、全身症状，包括发热、盗汗、乏力和体重减轻。在美国该病是增长第二快的癌症，以每年新增约55，000例的速度增加。近年来，我国恶性淋巴瘤发病率上升加快，已进入十大高发肿瘤行列，我国NHL的发病率从上个世纪的2/10万已快速上升至7/10万。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种弥漫性、全身性自身免疫病，主要累及皮肤粘膜、骨骼肌肉、肾脏及中枢神经系统，同时还可以累及肺、心脏、血液等多个器官和系统，有多种临床表现；血清中可以检测到自身抗体和免疫学异常。全球SLE患病率为48/10万-117/10万，发病率达1.5/10万-7.6/10万；多发生于20 40岁的育龄女性，男女发病率之比约为1: 7 1: 10，其高患病率、高病死率严重威胁着各国人群的身心健康。过去几十年里，非霍奇金淋巴瘤和系统性红斑狼疮的主要治疗方法为放疗和化疗，然而单克隆抗体药物的开发为我们提供了新的治疗方案，可以使病人有效避免对放疗化疗的依赖和毒副作用。美国FDA批准抗⑶20抗体美罗华(Rituximab)上市是一个历史性的里程碑。尽管美罗华对NHL有效且毒性可以控制，但不是所有的病人都对它有治疗反应，其实每一个有治疗反应的病人最后部会复发，然而美罗华鼓励研究者们去寻找新的靶点(路萍萍等，中国实验而液学杂志，2006 ；14(6):1258-1261)，这些靶点的表达方式和生理特点与CD20不同 ，但是可能比美罗华更有效或能够治疗美罗华无效的B细胞淋巴瘤病人。⑶22抗原是众多淋巴细胞表面靶点中的一个，大约60-80%的B细胞恶性肿瘤表达CD22，由此使其成为被动免疫疗法的潜在靶标(Cesano，A.，Gayko, U.(2003) Semin.0ncol.30:253-257)。⑶22抗原，又称唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素2 (SIGLEC2)，是一种B细胞的II型跨膜糖蛋白，存在α，β两种不同的亚型，分子量约为140KD左右。⑶22的胞外区由7个免疫球蛋白结构域组成，其N端结构域为V-免疫球蛋白结构域，负责与a 2，6Sia配体相结合；从功能角度讲也是免疫球蛋白超家族的一员，限制性表达于成熟B细胞和大多数B细胞NHL的表面，与B细胞的发展、分化和功能有着密切的关系。⑶22分子的生物学功能是通过调节信号传导通路，配体结合结构域，对B细胞信号传导的抑制性调节，直接参与B细胞向骨髓的归巢等方面来达到抗瘤效果。其特点为减弱免疫源性和加强效应因子的相互作用。经过近20年的艰苦努力，抗⑶22抗体治疗NHL已经取得了很大的进展。
目前,处于临床研究阶段的以⑶22抗原为祀点的抗体药物有:Immunomedics公司
的人源化抗体-依帕珠单抗(Epratuzumab);惠氏的Inotuzumab ozogamicin是与化学
毒素偶联的人源化单抗；NIH的BL22是在鼠抗体的基础上融合了 PE38的免疫毒素；以及深圳龙瑞药业的SM03嵌合抗体等。Epratuzumab是人源化单克隆抗体LL2的IgGl类，直接祀向0)22抗原，能通过CD 2 2介导胞浆内相应蛋白磷酸化，促进Ra j i细胞系凋亡，抑制其分化，从而达到治疗Burkitt' s淋巴瘤的目的。Inotuzumab Ozogamicin(CMC-544)是一种抗体革巴向化疗剂，由人源化抗⑶22抗体共价连接肿瘤抗生素calicheamicin(烯二炔类高效抗肿瘤抗生素)组成，是一种强效细胞毒性剂，可有效对抗CD22B细胞性非霍奇金淋巴瘤，主要不良反应为可逆性血小板减少。BL22 (RFB4 (dsFv)-PE38)是重组免疫毒素。BL22为RFB4通过半胱氨酸残基的二硫键与可变区重链的连接物，再与PE38融合成为RFB4(dsFv)-PE38。BL22是第一个在嘌呤同系物抑制的毛细胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)病人中产生高完全反应率的免疫毒素。Kreitman等研究HCL病人的临床I期实验证明BL22是可以耐受和高度有效的。虽然HCL对BL22产生完全反应，但BL22对⑶22抗原表达低的病人疗效较低。研究者希望在补体决定区(CDR)发生突变以增加抗体亲和能力和疗效，但没有成功。SM03嵌合抗体是分别克隆鼠抗人CD22单抗轻/重链可变区基因VL/VH，构建重组SM03嵌合抗体。SM03嵌合抗体特异于B细胞CD22抗原，对恶性淋巴瘤细胞具有生长抑制效应，为恶性B细胞淋巴瘤的临床治疗和应用奠定了基础
发明内容
:本发明在现有技术的基础上，研制出一种新型的人源化抗CD22单抗。以鼠源RFB4为亲本抗体，采用CDR移植技术对其进行人源化，将亲本抗体的CDR区移植到人IgGl中，并应用计算机大分子模拟技术对 人源化后的CD22抗体的蛋白结构模型进行分析，最终确定进行突变的6个氨基酸位点，如序列中斜体字部分所示，通过合成兼并性引物的方法，构建包含64种多态性的人源化抗体hRFB4噬菌体抗体库。对该噬菌体抗体库进行展示并筛选出5种亲和力较高的抗体DNA序列，并根据核苷酸序列翻译得到相应的氨基酸序列。通过序列分析比较发现这5个人源化hRFB4抗体的基因序列分别在4个不同的氨基酸位点存在差异，但是它们都可以与CD22抗原结合，表现出较高的抗体亲和力，具有相似的生物学功能。将5个人源化的⑶22抗体——hRFB4,分别命名为YQ22-1至YQ22-5，五个抗体的重链可变区的氨基酸序列均为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2，3，4，5，6所示，具体如下:YQ22-1:vh:evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfs ^ydmsI'
WVRQAPGKGLEffVS IyISSGGGTTYYPDTVKGI RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
JhSC^Iygssygvlf^1 Wgqgtlytyss [seq id no:i]Vl:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINC ![RasqdiSNYLNI WYQQKPGKAPKLLIY @|TSILHS|<GVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYFC jQQGNTLPWlI FGQGT [SEQ ID NO:2]
权利要求
1.一种特异性结合人CD22的单克隆抗体，由可变区和恒定区构成，可变区包含鼠源的CDR和人源的框架区，其特征在于，所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO:1组成，所述抗体的轻链可变区分别由SEQ ID NO:2，3，4，5，6组成。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的恒定区为人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的恒定区为人IgGl。
4.根据权利要求1-3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体是CDR移植的人源化抗体。
5.多核苷酸序列，其编码如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体。
6.—种表达载体,所述载体包含权利要求5所述的多核苷酸序列，所述的载体是PCDNA3.1。
7.—种宿主细胞，所述的宿主细胞经由权利要求6所述的载体转染而来。
8.一种制备权利要求1_3、4所述单克隆抗体的制备方法，所述方法包括:使用编码所述单克隆抗体的DNA表达载体转染宿主细胞，获得含有所述抗体的细胞培养上清液，并经Protien A柱纯化制备目的蛋白。
9.权利要求1_3、4中任一项的单克隆抗体用于制备治疗由表达CD22的细胞介导的疾病中的用途。
10.根据权利要求9所述的单克隆抗体的用途，所述的疾病是恶性淋巴瘤和自身免疫性疾病，具体指非霍奇金淋巴瘤和系统性红斑狼疮。
全文摘要
本发明涉及生物工程领域，更具体的涉及一种新型的人源化抗CD22抗体。本发明以鼠源抗体RFB4为亲本抗体，采用CDR移植技术进行人源化，人源化后的新抗体hRFB4具有与亲本抗体相近的亲和力，同时保持了亲本抗体与CD22抗原的结合能力，以及抗体引起的抗原抗体复合物的细胞内化活性。与亲本抗体比较，人源化hRFB4抗体中人源蛋白序列比例达到90％以上，大大降低了免疫原性，避免了HAMA反应的发生。
文档编号A61P37/02GK103214578SQ20131017000
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月10日 优先权日2013年5月10日
发明者尹琪, 王康, 郭晶晶, 高震, 孟艳敏, 刘志刚 申请人:北京东方百泰生物科技有限公司