专利名称：白念珠菌减毒活菌疫苗、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体说是一种白念珠菌减毒活菌疫苗、制备方法及其应用。
背景技术：
真菌大多属条件性致病菌，临床艾滋病的发生，侵袭性治疗手段的发展及广谱抗生素、肾上腺皮质激素、细胞毒药物、免疫抑制剂等长期不合理应用导致了机体菌群失凋，抵抗力下降，这极大的增加了真菌感染率的发生，而深部真菌感染致死率极高。国内外临床统计分析发现，大多数医院深部真菌感染是由念珠菌引起的，其中白念珠菌构成比最高。机体抗白念珠菌的感染是一个复杂的过程，包括非特异性免疫和特异性免疫，后者又分为细胞免疫和体液免疫。证实细胞免疫在抗白念珠菌感染中处于主导地位，体液免疫在抗白念珠菌感染中的作用至今仍持有不同观点。真菌疫苗有减毒活疫苗，即由减毒的活白念珠菌组成，可在自然状态下发生或在实验室中通过敲除一个或多个致病力相关重要基因产生。它能够模仿自然感染过程感染细胞、复制。其结构与野毒株最相似，因此白念珠菌成分可以与自然感染相同的方式传递给免疫细胞并被处理。其接种过程与自然的亚临床感染相似，通常只需要一两次免疫，就能够全方位调动机体的免疫应答。人们在动物模型中已经开展了深入的研究，研究减毒活疫苗的保护机制、研究通过基因重组技术选择性地去除编码毒力的基因来设计疫苗、发展新的动物模型阐明保护机制和致病性等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白念珠菌减毒活菌疫苗、制备方法及其应用。本发明提出的白念珠菌减毒活菌疫苗，为含有白念珠菌GPI7全基因缺失菌株的白念珠菌活菌株，所述GPI7全基因缺失菌株通过基因工程技术将GPI7基因敲除得到。
GPI锚定蛋白是白念珠菌细胞壁的重要组成部分，白念珠菌细胞壁GPI锚定蛋白的缺失将导致其细胞壁不完整，从而使其毒力减弱，抗原暴露。而GPI锚定蛋白需要GPI锚的参与介导其在内质网、高尔基体的糖基化、脂质重塑等修饰，并转运至细胞壁。白念珠菌GPI7是GPI锚合成通路中的重要基因之一，该基因功能主要是将磷酸乙醇胺脱水缩合至GPI锚第三个甘露糖的6位羟基上，而第三个甘露糖上的磷酸乙醇胺中的氨基是GPI锚定蛋白的结合位点。因此GPI7基因的缺失将影响磷酸乙醇胺的接入，从而影响下游GPI锚定蛋白的识别结合，使得白念珠菌细胞壁缺失，导致其毒力下降，并伴随抗原暴露。通过基因工程技术将GPI7基因敲除得到沿7i7/斯i7基因缺失菌，电镜观察沿7i7/斯i7基因缺失菌细胞壁结构不完整。体内毒力实验和主动免疫保护实验证明，斯i7/^7i7基因缺失菌毒力下降，并能够介导机体产生免疫保护作用。本发明提出的白念珠菌减毒活菌疫苗的制备方法，具体步骤如下:
(I)用融合 PCR 方法扩增出 GPI7up-his-GPI7down，GPI7up-leu-GPI7down 片段，PCR 产物纯化后备用；其中:GPI7 up 上:TCTATGTGGGGGAGGTCAAA，
GPI7 up 下:cacggcgcgcctagcagcggTGTGTGGATGGGTCTGAAAA，
GPI7down 上:gtcagcggccgcatccctgcGGATCTCTGAAATGAGGTTGG，
GPI7 down 下:TGGATGGTGATGGTGAAGAA，
GP17 检测 up: GGCATCAATTATTGGGCATT,
GP17 检测 down: CTGCTGAAGCTGCAAGAGAA,
GPI7 orfl 上:TCACCACAGGAGGTACACCA,
GPI7 orfl 下:TCATCCCATGATCTCCCATT,
GPI7 orf2 上:TCTAGCCGTGATTGTGGTGT，
GPI7 orf2 下:TGCAAATGTTGGCACTAAGC，
GPI7 orf3 上:CCTGGTGGGTTGATTTCATT，
GPI7 orf3 下:ACCCCACCAAAAACACATTG ；
(2)将回收片段转入白念珠菌SN152，通过两次醋酸锂法转化，得到GPI7全基因缺失菌 株;
(3)提取基因缺失菌株基因组DNA，PCR鉴定。本发明提出的白念珠菌减毒活菌疫苗用于预防白念珠菌感染。本发明提出的白念珠菌减毒活菌疫苗具有以下优点:一、制作工艺较简单，只要缺失菌株构建好后，可以大规模培养，成本低，周期短；二、真菌感染保护效果好、基本无毒性、安全性好。本发明采用基因工程方法构建的GPI7全基因缺失菌株，基本无毒性，用其作为免疫抗原对C57BL/6 SPF级近交系小鼠进行免疫，并采用主动免疫保护实验来评估该疫苗的保护性。实验已证实该疫苗可用于抵抗不同浓度的白念珠菌系统性感染。
图1表示了沿7i7/沿7i7基因缺失菌的PCR鉴定产物电泳图:泳道1、9、17为marker,泳道2、3、4、5为验证基因缺失菌的中插入的his, Ieu营养标记的上下游片段，长度分别为:1240bp、1522bp、1235bp和1412bp。泳道6、7、8为扩增GPI7基因开放阅读框的片段，沿7/斯i7基因缺失菌无条带出现，说明GPI7基因已被敲除。泳道10、
11、12、13为验证亲本菌株SN152的his，Ieu营养标记的上下游片段，其无条带出现。泳道14、15、16为扩增GPI7基因开放阅读框的片段，亲本菌株SN152有条带出现，长度分别为:416bp 、204bp 和 589bp。图2表示了基因缺失菌株的体内毒力实验结果-.gpi7/gpi7缺失菌及亲本菌SN152造成系统性真菌感染，结果显示，亲本菌SN152组小鼠于7天全部死亡，而沿7i7/斯i7缺失菌组小鼠30天内没有小鼠死亡并且状态良好(图2A)，肾脏荷菌量几乎无(图2B)。两组动物的存活率及肾脏荷菌量均存在显著差异(P〈0.0001)。图3表示了斯i7/斯i7基因缺失菌株体内毒力实验的病理切片结果:PAS染色中，亲本菌SN152组小鼠的肾脏可以清晰地看见大面积的病灶，可见白念珠菌菌丝，并伴随明显的中性粒细胞侵润。而斯i7/^pi7基因缺失菌组没有明显的病灶结构，也无可见菌丝。在HE染色中，亲本菌SN152肾髓质出现大范围炎性病变，并伴大量中性粒细胞侵润，炎症反应严重。而斯i7/^pi7基因缺失菌组肾组织并未出现异常，炎症反应轻微。图4表示了沿7i7/斯i7基因缺失菌与亲本菌株SN152的细胞壁电镜比较'gpi7/斯i7基因缺失菌与亲本菌SNHL相比，细胞壁不完整，细胞壁显著变薄。图5表示斯i7/沿7i7基因缺失菌主动免疫保护实验结果:沿7i7/斯i7基因缺失菌和SN152紫外灭活菌组小鼠免疫一次，21天后，以白念珠菌SC5314感染小鼠，SN152组小鼠8天全部死亡，平均存活天数为5.7天。斯i7/沿7i7基因缺失菌的小鼠生存时间显著延长，在感染后25天内仍有80%的存活率(图5A)。沿7i7/斯i7基因缺失菌和SN152紫外灭活菌免疫组小鼠免疫两次后，以白念珠菌SC5314感染小鼠，SN152组小鼠平均存活天数为14天，沿7i7/沿7i7基因缺失菌组小鼠存活时间显著延长，在50天内能维持60%的生存率(图5B)。图6表示斯i7/沿7i7基因缺失菌主动免疫保护实验小鼠的肾脏病理切片结果:在PAS染色中，对照组注射紫外灭活亲本菌SN152，在白念珠菌SC5314的攻击下肾脏出现白念珠菌菌丝侵袭的病灶。而免疫斯i7/斯i7基因缺失菌组小鼠没有明显的病灶结构，也无可见菌丝。在HE染色中，SN152组小鼠在SC5314的攻击下肾髓质出现大范围炎性病变，并伴大量中性粒细胞侵润，炎症反应严重。而斯i7/^pi7基因缺失菌组肾组织并未出现异常。
具体实施例方式以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1.缺失菌gpi7/gpi7的构建:
(I)材料:基因组DNA抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA纯化试剂盒购于北京天根基因科技有限公司，rTaq、exTaq、dNTP等购于Takara公司。96weIIsPCR仪购于B10-RAD公司。(2)实验试·剂配制:
1.PBS缓冲液
NaCl 8.0g, KCl 0.4g, Na2HPO4.1ffi2O 3.48g, KH2PO40.2g，调节 PH 至 7.4，加三蒸水至IOOOml，溶解后分装，高压灭菌后于4°C保存备用。2.沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)
蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml充分搅拌溶解，定容至IOOOml，高压灭菌(12rC，15min)后于4°C保存备用。3.人工合成完全氛基酸培养基(synthetic complete medium, SC)
酵母氮源6.7g,葡萄糖20g,氨基酸混合物1(见Tablel-2.)1.05g,补充组氨酸(20 μ g/ml)、亮氨酸(60 μ g/ml)及精氨酸(40 μ g/ml)。加三蒸水900ml充分搅拌溶解，定容至1000ml，高压灭菌(12rC，15min)后于4°C保存备用。固体培养基在高压灭菌前加入琼脂20g，灭菌后冷却至50°C左右于超净台中倒入无菌培养皿，冷却凝固后于4°C保存。Tablel.缺三种氨基酸组氨酸(HIS)、亮氨酸(LEU)、精氨酸(ARG)的SC培养基
权利要求
1.一种白念珠菌减毒活菌疫苗，其特征在于为含有白念珠菌GPI7全基因缺失菌株的白念珠菌活菌株，所述GPI7全基因缺失菌株通过基因工程技术将GPI7基因敲除得到。
2.一种如权利要求I所述的白念珠菌减毒活菌疫苗的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)用融合PCR 方法扩增出 GP17up-hi s_GP17down，GP17up_l eu_GP17down 片段，PCR 产物纯化后备用；其中GP17 up 上TCTATGTGGGGGAGGTCAAA， GPI7 up 下cacggcgcgcctagcagcggTGTGTGGATGGGTCTGAAAA， GPI7down 上gtcagcggccgcatccctgcGGATCTCTGAAATGAGGTTGG， GP17 down 下TGGATGGTGATGGTGAAGM， GP17 检测 up GGCATCAATTATTGGGCATT, GP17 检测 down CTGCTGAAGCTGCAAGAGAA, GPI7 orfl 上TCACCACAGGAGGTACACCA, GPI7 orfl 下TCATCCCATGATCTCCCATT, GPI7 orf2 上TCTAGCCGTGATTGTGGTGT， GPI7 orf2 下TGCAAATGTTGGCACTAAGC， GPI7 orf3 上CCTGGTGGGTTGATTTCATT， GPI7 orf3 下ACCCCACCAAAAACACATTG ； (2)将回收片段转入白念珠菌SN152，通过两次醋酸锂法转化，得到GPI7全基因缺失菌株; (3)提取基因缺失菌株基因组DNA，PCR鉴定。
3.—种如权利要求I所述的白念珠菌减毒活菌疫苗用于预防白念珠菌感染。
全文摘要
本发明涉及一种用于预防白念珠菌感染的白念珠菌减毒活菌疫苗、制备方法及其应用，该疫苗为含有白念珠菌GPI7全基因功能缺失的白念珠菌菌株，能够有效预防白念珠菌感染，并延长白念珠菌感染存活率，故可用于制备预防白念珠菌感染的减毒活菌疫苗。
文档编号A61K39/02GK103251939SQ20131017683
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月14日 优先权日2013年5月14日
发明者安毛毛, 陈思敏, 刘伟, 慎慧, 张石群, 黄鑫, 徐国彤, 姜远英 申请人:同济大学