生物药非共价结合聚合物延长治疗浓度的方法及用途

生物药非共价结合聚合物延长治疗浓度的方法及用途
【专利摘要】本发明涉及生物药的非共价结合物，制备方法及由所述非共价结合物形成的药物组合物的用途，生物药在高浓度时结合到高分子聚合物形成所述非共价结合物，在浓度低时从高分子聚合物解离释放行使其药理活性；其特征在于既稳定保留物药，降低药物的免疫原性、又减缓扩散速度和从血液中清除速度，延长维持药物血浆有效治疗浓度时间、半衰期，基本消除药物爆发释放的特征；本发明还涉及所述含生物药非共价结合物的药物组合物的用途。
【专利说明】生物药非共价结合聚合物延长治疗浓度的方法及用途 发明领域
[0001] 本发明涉及一种携带亲和配体的聚合物及与物药非共价结合物的方法和试剂，属 于生物制药领域。
[0002] 发明背景
[0003] 蛋白类药物，具有靶点明确、疗效显著、不易形成抗药性、副作用小的优点，但因 其体内半衰期较短，因此临床应用时，为维持其在体内的有效血药浓度，需要多次给药，患 者依从性较差。为了解决这个问题，欧洲专利EP0539167和美国专利US4904584公开了 用PEG直接修饰蛋白的解决方案。PEG单元可以共价联接到蛋白质的多个不同氨基位点 上；由于蛋白或多肽分子中存在多个氨基，制备的共价偶联物是多种偶联产物的混合物， 不同分子大小及分子结构的PEG对活性位点的影响不同，在特异性、被修饰后的蛋白空间 结构、产物稳定性及产物活性等反面存在很大不均一性。偶联物位置异构体的混合物[欧 洲专利 EP593868 ;Monkarsh 等，ACS. Symp. Ser.，680 :207-216,1997]，需要繁琐的纯化步 骤准备最适偶联物。专利PCT/US2004/025864中公开了一种在IL28和IL29分子N-末端 上的氨基进行PEG化的均一化方法，控制反应pH条件选择性控制诸如醛（如甲氧基聚乙 二醇丙醛）等试剂在N-末端的α氨基上反应，而不影响赖氨酸残基的ε氨基，制备蛋 白质Ν-末端修饰产物。较未修饰的生物药，PEG偶联物具有较高的可溶性、稳定性、较弱 的免疫原性；但尽管连接到药物蛋白分子氨基酸残基上的PEG链本身并不参与受体的识 别与结合，但是PEG链的空间位阻以及PEG化导致的蛋白分子表面性质的改变影响了与 受体的结合，降低了修饰后蛋白的活性；随PEG链长度增加和PEG修饰度提高，生物活性 降低幅度增大。如PEG-IL-15只有10%的天然活性[中国专利申请201110095641. 6]; Peglntron? (Peginterferon a-2b，Schering-Plough)只有天然活性约 10% 28%， PEGASYS(IFNα-2a)只有约7%天然活性。
[0004] 此外，蛋白质PEG化修饰的化学反应、产物不均一性需要纯化不仅增加了生产步 骤，造成了产品损失，加大了生产成本。因此需要发展稳定和延长药物血药有效浓度的更理 想方法。


【发明内容】

[0005] 本发明涉及一种携带亲和配体的高分子聚合物，物药能够以非共价形式与之结合 形成非共价结合物；制备操作简单，活性损失小，易于保存，更稳定，与天然物药比较，具有 更长的体内半衰期和有效血药浓度、用药次数少、治疗效果长、用药更为安全。
[0006] 具体地说，本发明在于提供一种带亲和配体的高分子聚合物，物药通过非共价形 式与之结合形成非共价结合物，可以加赋形剂、非离子表面活性剂等，过滤除菌、分装，如果 需要可以冻干存放。因此该高分子聚合物有望开发成为一种保健产品或药物或者辅佐药物 而用于临床。
[0007] 因此，本发明的一个目的在于提供一种药物-高分子聚合物的非共价聚合物。
[0008] 其特征在于：
[0009] [1]高分子聚合物分子上含共价连接的亲和配体；
[0010] [2]高分子聚合物在药物制剂阶段加入，混匀、除菌、过滤后形成。
[0011] [3]所述的药物包括但不限于重组生物药、提取生物药和合成生物药。
[0012] 本发明中所述物药-高分子非共价结合物具有如下通式：
[0013] BioPM …Ligand一Polymer
[0014] 式中，所述非共价结合物的优选摩尔比为：BioPM : Ligand - Polymer = 0. 5-1. 5 ： 0. 5-2 ： 5
[0015] 式中，BioPM为所述的生物药指蛋白/多肽类药物：包括促红细胞生成素（ΕΡ0)、 重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、疫苗、干扰 素（INF)、生长激素（GH)、胰岛素（Insulin)、表皮生长因子（EGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF)、转化生长因子（TGF-B)、胰岛素样生长因子（IGF)、血管内皮细胞生长因子（VEGF)、 血小板生长因子（PDGF)、内皮生长因子（ECGF)、神经生长因子（NGF)、骨衍生性生长因子 (BDGF)、骨形成蛋白（BNIP)、组织多肽抗原（TPA)、抗体（antibody)、凝血因子VIII (VIII) 及IX遗传因子和用于治疗的蛋白质或多肽。
[0016] BioPM为所述的生物药指蛋白/多肽类以外的药物为：反义核苷酸（anti-RNA)、小 分子RNA(RNAi)、基因（DNA)、抗体、疫苗、或脂质体。
[0017] 所述的生物药可以是天然的、重组蛋白或同样具有天然功能的基因突变产物，当 然，也包括通过组织培养、有机合成的、蛋白质合成、细胞培养（天然、重组细胞活突变体） 方法得到的产品。
[0018] Polymer为所述的高分子聚合物，指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽键的聚氨基酸，其 中包括：聚乳酸、聚乳酸一聚羟基乙酸及其组合；还包括卡波母、透明质酸、硫酸软骨素、肝 素、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、、葡聚糖、烯丙基葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚乙 二醇、聚乙二醇一聚乳酸嵌合高分子、聚乙二醇一聚羟基乙酸嵌合高分子、聚羟基乙酸一聚 乙二醇一聚羟基乙酸嵌合高分子、聚乳酸一聚乙二醇一聚乳酸嵌合高分子、糖敏型凝胶和 酸敏型凝胶高分子、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯；以本发明优选的PEG、透明质酸、 肝素、硫酸软骨素、葡聚糖、纤维素；
[0019] PEG聚乙二醇分子可以是直链型或分支型，可以是单链、双链或多链。优选直链型 单链聚乙二醇分子。基本乙烯单位的20到2000,优选为500-1500之间的整数值，更优选为 700-1300之间的整数，聚乙二醇的分子量在lkDa、100kDa之间，优选为200-50kDa之间，更 优选为30-40kDa。以本发明优选的20-40KDa的mPEG ;
[0020] Ligand为所述的亲和配体，指具有结合目标生物药的分子基团，可以生物药的天 然配体、多肽配体、药物分子、有机小分子，以及以生物药为靶点设计合成的具有结合所述 生物药能力分子实体，包含乙二胺、三乙烯四胺、3-二乙基氨基丙胺、1，2_二氨基环己烷、 5-氨基-2, 2,4_三甲基环戊甲胺、庚胺、辛胺、任胺、葵胺、环戊胺、环庚胺、环辛胺、环任胺、 环葵胺、组胺、色胺、酪胺、苯胺、3-氨基苯酚、对-氨基苯酚、苯甲胺、3-氨基吡啶、2-胺甲 基吡咯、3, 5-二氨基苯甲酸、2-氨基苯并咪唑、5-氨基苯并咪唑、4,4' -二氨基二苯醚、3， 3'-二甲基联苯胺；
[0021] 本发明的另一个目的是提供一种带亲和配体的高分子聚合物制备方法。
[0022] 本发明专利所述携带亲和配体的高分子聚合物可以用常规化学方法制备步骤：
[1]多糖高分子-亲和配体合成步骤：准确称取多糖若干，根据除以单糖摩尔质量数（约 180)计算摩尔数。然后加入0. 1-1倍单糖摩尔数量的NaOH，1倍单糖摩尔数量的环氧氯丙 烷或其它二环氧基试剂，密闭后于60°C搅拌反应0.5-8小时。取出反应物，于通风橱中，用 去离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当，得环氧活化多糖聚 合物，测定环氧基密度；取环氧活化多糖聚合物若干，计算环氧基摩尔数；取1-2倍摩尔量 的配体分子，溶解在PH8以上的缓冲液中，与活性化多糖聚合物混合，密闭后于60°C搅拌反 应10-24小时。取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和 电导率与去离子水相当，得多糖聚合物-亲和配体物质；
[0023] [2] 1-3链mPEG-亲和配体合成步骤：准确称取1-3链PEG-活性基团（PEG分子量 2-50kd，活性基团为环氧基、琥珀酰亚胺脂、琥珀酰亚胺碳酸酯、醛基、三氟乙基磺酸酯、异 氰酸酯、肼、2-巯基噻唑啉、苯骈三氮唑、马来酰亚胺、二-2-吡啶基二硫化物、乙烯砜、邻二 硫吡啶、碘乙酰胺）若干，计算活性基团摩尔数；取2-10倍摩尔量的配体分子，溶解在反应 缓冲液中，与1-3链PEG-活性基团混合，密闭后于反应温度下搅拌反应10-24小时。取出 反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水 相当，得PEG-亲和配体物质；
[0024] [3]三氮嗪骨架亲和配体-多糖聚合物的合成
[0025] 取多糖若干溶解于1-10% NaOH中，加入环氧氯丙烷，混匀，密闭60°C下反应2小 时；取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方式换缓冲液，至pH值和电导率与去离子 水相当，得环氧活化-多糖聚合物，
[0026] 环氧活化多糖聚合物若干溶解于1-5 %氨水中，混匀，密闭60°C下反应过夜； 取出反应物，于通风橱中，用0. lNaHC03溶液以超滤方式换缓冲液，至pH值和电导率与 0. lNaHC03溶液相当，得氨基-多糖聚合物，分析氨基密度；取氨基-多糖聚合物若干溶解 在0. lNaHC03溶液，计算氨基摩尔数，取1-2倍摩尔量的三氯三氮嗪溶解在冷丙酮中，逐步 加入，并用饱和NaHC03将pH维持在7. 0-7. 5之间，反应温度维持在0-4°C继续搅拌2h-4h， 至白色消失停止反应。用去离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子 水相当，得三氮嗪活化-多糖聚合物；称取三氮嗪活化-多糖聚合物溶解用〇. lNaHC03溶 液，取1-5倍摩尔量的目标氨基化合物（R1)，将其溶解于一定量的蒸馏水中，加入混匀，密 闭与50°C反应24h，反应过程中，用饱和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在7-7. 5之间； 用0. lNaHC03溶液以超滤方式换缓冲液，至pH值和电导率与0. lNaHC03溶液相当；称取取 1-5倍摩尔量的目标氨基化合物（R2)，溶解，加入，95°C反应24-60h，反应过程中，用饱和 NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在7-7. 5之间；用去离子水以超滤方式换缓冲液，至pH值 和电导率与去离子水相当，干燥待用。这种方法合成的双基团三氮嗪骨架亲和配体-多糖 聚合物，按不同氨基化合物数字编号命名为"Cx"，"C"代表以三氮嗪为骨架，"X"为氨基数 字标号数字编号。
[0027] 所述的常规化学方法，是指C. R. Lowe在《亲和色谱导论》（洛（C. R. Lowe)著；刘 毓秀译.科学出版社，1983以"年5月第1版，第61-84页）中提到的聚合物活化与功能化 方法，如多糖基及含羟基的聚合物，可用卤化氰、三嗪（均二氯三嗪或三氯三嗪）、高碘酸氧 化，环氧乙烷（1，4-二羟基正丁烷双缩水甘油醚），环氧氯丙醇，环氧溴丙醇，双氮丙啶，二 乙烯砜，苯醌类化合物如醌，溴乙酰溴进行活化和功能化；配体合成方法还可以参考文献亲 和配体的设计合成及其吸附蛋白质的构效关系[J. S印.Sci. 2011，34, 3145-3150]。从而在 聚合物上连接需要的亲和配体，或原位合成亲和配体。
[0028] 本发明的再一个目的，提供了该药物组合物制备方法
[0029] 本发明专利所述非共价结合物的制备步骤：将2倍浓度原料药（BioPM)的注射剂 缓冲液与2倍浓度聚合物-配体（Ligand - Polymer)注射剂缓冲液，加赋形剂溶解、非离 子表面活性剂，在无菌容器中混合均匀后，静置2小时，过滤除菌，温度优选4-KTC，摩尔比 为 BioPM : Ligand - Polymer = 1 : 1. 1 ?1 : 5，BioPM 原料药与聚合物结合率> 95%。 制备条件的选择和制备方法在实例中详细说明。
[0030] 本发明的又一个目的是提供了制备该药物组合物的辅料。
[0031] 本发明专利所述赋形剂可以是任何多元醇，与制剂的其它组分一起产生稳定的生 物药-高分子聚合物非共价结合物制剂。多元醇的例子有甘露醇、山梨醇、海藻糖醇、麦芽 糖醇，木糖醇和麦芽糖醇。优选的多元醇赋形剂是甘露醇。
[0032] 根据本发明的另一个目的，本发明提供了制备该药物组合物的非离子表面活性 剂。
[0033] 按照本发明所述非离子表面活性剂。非离子表面活性剂包括多元醇衍生物、丙二 醇二乙酸酯、聚氧乙烯酯和醚、壬基苯基醚、聚乙烯醇、泊洛沙姆（泊洛沙姆188)、链烷醇酰 胺。非离子表面活性剂可优选泊洛沙姆，特别优选泊洛沙姆188。
[0034] 能维持该药物组合物稳定的任何缓冲液均可使用，包括但不限于醋酸钠缓冲液或 PBS溶液，优选醋酸钠缓冲液。在本发明一个优选实施例中，PEG-ligand，干扰素-γ、表面 活性剂、赋形剂和缓冲液的液体药物组合物，其中所述所述缓冲液是醋酸钠缓冲液，赋形剂 是海藻糖醇，所述表面活性剂是泊洛沙姆188。
[0035] PBS溶液配制：准确称取氯化钠8g、氯化钾0. 2g、磷酸氢二钠1. 44g、磷酸二氢钾 0. 24g，用去离子水配成1000mL溶液，分装，121°C高压灭菌15min。

【具体实施方式】
[0036] 以下实施例用于详细说明本发明及其效果，但是本发明并不仅仅局限于这些实施 例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员可以对本发明作各种改 动或修改，但所作的类似的改动或修改同样落在本申请权利要求书所限定的范围之内。
[0037] 实施例 1 mPEG-TEQA 合成
[0038] 准确称取 mPEG-环氧基团（mPEG-Epoxide，分子量 20KD)10g 溶解于 500ml 0.01M NaOH，量取三乙烯四胺5ml加入混合，放入1L玻璃瓶，密封盖严后防御60°C摇床反应过夜。 取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离 子水相当，得PEG-TEQA ;
[0039] 实施例 2 diPEG-DaCH 合成
[0040] 准确称取双链PEG-琥珀酰亚胺脂（diPEG-su，分子量40KD) 10g溶解于500ml 0. 1M乙酸-乙酸钠缓冲液，pH4. 5,量取1，2-二氨基环己烷5ml加入混合，调pH4. 5,放入1L 玻璃瓶，密封盖严后防御50°C摇床反应过夜。取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤 方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当，得diPEG-DaCH ;
[0041] 实施例 3 diPEG-APn 合成
[0042] 准确称取双链PEG-琥珀酰亚胺碳酸脂（diPEG-su，分子量60KD) lOg溶解于500ml 0. 1M乙酸-乙酸钠缓冲液，pH4. 5,量取氨基环戊烷5ml加入混合，调pH4. 5,放入1L玻璃 瓶，密封盖严后防御50°C摇床反应过夜。取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方式 换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当，得diPEG-APn ;
[0043] 实施例 4 diPEG-ABZMZ 合成
[0044] 准确称取双链PEG-三氟乙基磺酸酯（diPEG-TrS，分子量50KD) 10g溶解于500ml 0. 1M碳酸氢钠缓冲液，pH8. 0,称取5-氨基苯并咪唑5g加入混合，调pH4. 5,放入1L玻璃 瓶，密封盖严后防御50°C摇床反应过夜。取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方式 换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当，得diPEG-ABZMZ ;
[0045] 实施例 5 diPEG-ABZMZ 合成
[0046] 准确称取双链PEG-三氟乙基磺酸酯（diPEG-TrS，分子量10KD) 10g溶解于500ml 0. 1M碳酸氢钠缓冲液，pH8. 0,称取5-氨基苯并咪唑5g加入混合，调pH4. 5,放入1L玻璃 瓶，密封盖严后防御50°C摇床反应过夜。取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方式 换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当，得diPEG-ABZMZ ;
[0047] 实施例6 HA-Lig的合成
[0048] 称取透明质酸（Hyaluronan、hyaluronic acid) 15g 溶解于 4% NaOH 中，加入环氧 氯丙烷5ml，混匀，密闭60°C下反应2小时；取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方 式换缓冲液，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥得环氧活化-透明质酸14g。称取环氧 活化-透明质酸9g溶解于5%氨水中，混匀，密闭60°C下反应过夜；取出反应物，于通风橱 中，，用去离子水以超滤方式换缓冲液，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥得氨基-透 明质酸8g ;取氨基-透明质酸5g溶解在0. lNaHC03溶液，取3g三氯三氮嗪溶解在冷丙酮 中，逐步加入，并用饱和NaHC03将pH维持在6. 8-7. 2之间，在4°C搅拌反应4h。取出用去离 子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥得三氮嗪活化-透 明质酸5g ;称取三氮嗪活化一透明质酸4. 5g用0. lNaHC03溶液200ml溶解，取lg的环庚 胺（R1)加入混匀，密闭与50°C反应18h，反应过程中，用饱和NaHCOjP 1M醋酸使溶液pH保 持在6. 8-7. 2之间；取出用去离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子 水相当，干燥得环庚胺基-氯三氮嗪-透明质酸4. 7g ;称取环庚胺基-氯三氮嗪-透明质酸 4g用0. lNaHC03溶液250ml溶解，取3,5_二氨基苯甲酸（R2)1.2g加入溶解混匀，95°C反 应24h，反应过程中，用饱和似!10) 3和1M醋酸使溶液pH保持在7-8之间；用去离子水以超 滤方式换缓冲液，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥待用，得环庚胺基-3-氨基-5-羧 基苯氨基三氮嗪-透明质酸4. 2g。
[0049] 实施例7 HP-Lig的合成
[0050] 称取肝素（h印arin)50g溶解于3% NaOH中，加入环氧氯丙烷10ml，混匀，密闭 65°C下反应1. 5小时；取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方式换缓冲液，至pH值 和电导率与去离子水相当，干燥得环氧活化-肝素48g。称取环氧活化-肝素45g溶解于 4%氨水中，混匀，密闭60°C下反应过夜；取出反应物，于通风橱中，，用去离子水以超滤方 式换缓冲液，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥得氨基-肝素44g ;取氨基-肝素35g 溶解在0. lNaHC03溶液，取10g三氯三氮嗪溶解在冷丙酮中，逐步加入，并用饱和NaHC03将 pH维持在6. 5-7. 5之间，在2°C搅拌反应6h。取出用去离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至 pH值和电导率与去离子水相当，干燥得三氮嗪活化-肝素35g ;称取三氮嗪活化-肝素30g 用0. lNaHC03溶液200ml溶解，取10g的1，2-二氨基环己烷（R1)加入混匀，密闭与55°C 反应20h，反应过程中，用饱和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在6. 5-7. 0之间；取出用去 离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥得2-氨基环己氨 基-氯三氮嗪-肝素27g ;称取2-氨基环己氨基-氯三氮嗪-肝素25g用0. lNaHC03溶液 250ml溶解，取4,4' -二氨基二苯醚（R2) 13g加入溶解混匀，90°C反应48h，反应过程中，用 饱和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在7-8之间；用去离子水以超滤方式换缓冲液，至pH 值和电导率与去离子水相当，干燥待用，得2-氨基环己氨基-4-(4'_氨基苯醚）苯胺基-三 氮嗪-肝素25g。
[0051] 实施例8 CS-Lig的合成
[0052] 称取硫酸软骨素 （Chondroitin sulfate)80g溶解于3% Na0H600ml中，加入环氧 氯丙烷60ml，混匀，密闭55°C下反应6小时；取出反应物，于通风橱中，用去离子水以超滤方 式换缓冲液，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥得环氧活化-硫酸软骨素78g。称取环 氧活化-硫酸软骨素75g溶解于2%氨水中，混匀，密闭60°C下反应30小时；取出反应物， 于通风橱中，，用去离子水以超滤方式换缓冲液，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥得 氨基-硫酸软骨素74g ;取氨基-硫酸软骨素70g溶解在0. 2NaHC03溶液，取20g三氯三氮 嗪溶解在200ml冷丙酮中，逐步加入，并用饱和NaHC0 3将pH维持在6. 5-7. 0之间，在7°C搅 拌反应4h。取出用去离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当， 干燥得三氮嗪活化-硫酸软骨素74g ;称取三氮嗪活化-硫酸软骨素60g用0. lNaHC03溶 液300ml溶解，取30g的5-氨基-2, 2,4-三甲基环戊甲胺（R1)加入混匀，密闭与48°C反应 30h，反应过程中，用饱和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在6. 5-7. 0之间；取出用去离子水 以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥得5-氨基-2, 2,4-三甲 基环戊甲胺-氯三氮嗪-硫酸软骨素65g ;称取5-氨基-2, 2,4-三甲基环戊甲胺基-氯三 氮嗪-硫酸软骨素55g用0. lNaHC03溶液550ml溶解，取2-氨基苯并咪唑（R2) 24g加入溶 解混匀，95°C反应36h，反应过程中，用饱和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在7-8之间；用 去离子水以超滤方式换缓冲液，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥待用，得5-氨基-2， 2,4-三甲基环戊甲胺基-苯并咪唑-2-氨基三氮嗪-硫酸软骨素57g。
[0053] 实施例9 TiPEG-Lig的合成
[0054] 称取4链PEG胺（TiPEG，60kD) 10g溶解在(λ lNaHC03溶液200ml，取5g三氯三氮 嗪溶解在l〇〇ml冷丙酮中，逐步加入，并用饱和NaHC0 3将pH维持在6. 5-7. 0之间，在4°C搅 拌反应5h。取出用去离子水以超滤方式换缓冲液洗涤，至pH值和电导率与去离子水相当， 干燥得三氮嗪活化-4链PEG胺（Amino-TiPEG) 9g ;称取Amin〇-TiPEG8g用0· lNaHC03溶液 100ml溶解，取20g的3-氨基-1，5-苯二羧酸（R1)加入混匀，密闭先于50°C反应30h，反 应过程中，用饱和NaHC0 3和1M醋酸使溶液pH保持在6. 5-7. 0之间；再升温至95°C，再反应 24h,反应过程中，用饱和似!10)3和1M醋酸使溶液pH保持在7-8之间；用去离子水以超滤 方式换缓冲液，至pH值和电导率与去离子水相当，干燥待用，得二（3, 5-二羧甲基苯胺基） 三氮嗪-4 链 PEG (TiPEG-Lig) 8g。
[0055] 实施例10重组胰岛素的HA-Lig制剂
[0056] 胰岛素 HA-Lig溶液配置：用0. 01mol/l pH7. 4磷酸盐缓冲液配制lU/ml的重组 人胰岛素，用0. 〇lmol/l pH7. 4磷酸盐缓冲液配制2U/ml的重组人胰岛素和20mg/ml的实 施例6制备的HA-Lig溶液混合制成lU/ml的重组人胰岛素-10mg/mlHA-Lig的重组人胰岛 素-HA-Lig溶液。
[0057] 小鼠皮下注射给药降血糖试验：取18只健康雄性小鼠，随机分为3组。实验前禁 食12h，可自由饮水。称重，按照0. 5U/kg胰岛素量皮下分别注射lU/ml的重组人胰岛素溶 液和 lU/ml 的重组人胰岛素-HA-Lig 的溶液，于 0,15, 30,60,90,120,180, 240, 300, 360， 48〇11^11时自尾静脉取血2(^1加入18(^10.129111〇1/1枸橼酸钠抗凝剂溶液中，立即混匀， 3000rpm离心20min，精密量取20μ 1上清，按葡萄糖氧化酶法（G0D-PAP)测定血糖值。结 果，胰岛素给药后30min左右血糖降至低谷，为初始值的25%左右；给药后3h，血糖回复到 初始值的90%以上。重组人胰岛素-HA-Lig给药后280min左右血糖降至低谷，为初始值 的65%左右；给药后10h,血糖回复到初始值的90%以上。用梯形法计算曲线上面积（area above curve，AAC)，以胰岛素的面积为基准，计算重组人胰岛素-HA-Lig相对天然胰岛素的 生物活性百分比。相对重组胰岛素组，重组人胰岛素-HA-Lig的生物活性百分比87%。
[0058] 大鼠尾静脉注射给药降血糖试验：取12只健康雄性SD大鼠，随机分为3组。 实验前禁食12h，可自由饮水。称重，尾静脉分别注射（0. 5U/kg)胰岛素和重组人胰岛 素-HA-Lig 溶液，于 0,15,30,45,60,90,120,180,240,300,360,480min 时自尾静脉取血 20μ 1加入180μ 1 0. 129mol/l枸橼酸钠抗凝剂溶液中，立即混匀，3000rpm离心20min，精 密量取20μ 1上清，按葡萄糖氧化酶法（G0D-PAP)测定血糖值。重组胰岛素给药后20min 左右血糖值降至低谷，为初始值的50%左右，90min左右血糖回复到初始水平。重组人胰岛 素-HA-Lig给药后lOOmin左右血糖降至低谷，为初始值的55%左右；给药后6h，血糖回复 到初始值的95 %左右。相对重组胰岛素组，重组人胰岛素-HA-Lig的生物活性百分比91 %。
[0059] 实施例11重组胰岛素的diPEG-DaCH制剂
[0060] 胰岛素 DiPEG-DaCH溶液配置：用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸盐缓冲液配制lU/ml的重 组人胰岛素，用0. 〇lmol/l pH7. 4磷酸盐缓冲液配制2U/ml的重组人胰岛素和20mg/ml的 实施例2制备的DiPEG-DaCH溶液混合制成lU/ml的重组人胰岛素-10mg/mlDiPEG-DaCH的 重组人胰岛素-DiPEG-DaCH溶液。
[0061] 小鼠皮下注射给药降血糖试验：取18只健康雄性小鼠，随机分为3组。实验前禁食 12h，可自由饮水。称重，按照0.5U/kg胰岛素量皮下分别注射lU/ml的重组人胰岛素溶液 和 lU/ml 的重组人胰岛素-DiPEG-DaCH 的溶液，于 0,15, 30,60,90,120,180, 240, 300, 360， 480min时自尾静脉取血20μ 1加入180μ 10. 129mol/l枸橼酸钠抗凝剂溶液中，立即混匀， 3000rpm离心20min，精密量取20μ 1上清，按葡萄糖氧化酶法（G0D-PAP)测定血糖值。结 果，胰岛素给药后30min左右血糖降至低谷，为初始值的25%左右；给药后3h，血糖回复到 初始值的90%以上。重组人胰岛素-DiPEG-DaCH给药后260min左右血糖降至低谷，为初 始值的65%左右；给药后10h，血糖回复到初始值的90%以上。用梯形法计算曲线上面积 (area above curve，AAC)，以胰岛素的面积为基准，计算重组人胰岛素-DiPEG-DaCH相对天 然胰岛素的生物活性百分比。相对重组胰岛素组，重组胰岛-diPEG-DaCH的生物活性百分 比 82%。
[0062] 大鼠尾静脉注射给药降血糖试验：取12只健康雄性SD大鼠，随机分为3组。 实验前禁食12h，可自由饮水。称重，尾静脉分别注射（0. 5U/kg)胰岛素和重组人胰岛 素-DiPEG-DaCH 溶液，于 0,15, 30,45,60,90,120,180, 240, 300, 360,480min 时自尾静脉 取血200μ 1加入180μ 1 0. 129mol/l枸橼酸钠抗凝剂溶液中，立即混匀，3000rpm离心 201^11，精密量取20(^1上清，按葡萄糖氧化酶法（600^^?)测定血糖值。重组胰岛素给药 后20min左右血糖值降至低谷，为初始值的50%左右，90min左右血糖回复到初始水平。重 组人胰岛素-DiPEG-DaCH给药后130min左右血糖降至低谷，为初始值的60%左右；给药后 6h，血糖回复到初始值的90 %左右。相对重组胰岛素组，重组人胰岛素-DiPEG-DaCH的生物 活性百分比83%。
[0063] 实施例12 α干扰素的diPEG-ABZMZ制剂
[0064] α干扰素的diPEG-ABZMZ溶液配置：用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸盐缓冲液配制 80yg/ml的α干扰素，用〇. 〇lmol/l ρΗ7. 4磷酸盐缓冲液配制1.0mg/ml的α干扰素和 160 μ g/ml的实施例4制备的diPEG-ABZMZ溶液混合制成80 μ g/ml的α干扰素-15mg/ mldiPEG-ABZMZ 的 α 干扰素-DiPEG-ABZMZ 溶液。
[0065] 试验设三个剂量组：S卩α干扰素-DiPEG-ABZMZ低、中和高三个剂量组，10 μ g/ kg(2 早/2 ? )，40yg/kg(3 早/3 ? )和80yg/kg(2 早/2 ? )，于颈背部皮下注射（s.c·)， 给药体积均为〇.2mL/kg。食蟹猴皮下注射α干扰素-DiPEG-ABZMZ注射液后，分别于不同 时间从猴前肢隐静脉采血约1. OmL，具体采血时间点为：Oh (药前），4,8,16, 24,48, 72,96， 120和144h (药后）；采全血后立即用9ml 0. 129mol/l枸橼酸钠抗凝剂溶液稀释混匀抗凝， 3000rpm离心20min，收集血清样品，-70°C保存直至测定。
[0066] 采用细胞病变效应法（CPE)测定α干扰素-DiPEG-ABZMZ在食蟹猴体内的抗病毒 活性，即干扰素保护Wish细胞免受VSV病毒攻击的能力。具体操作方法为：
[0067] (1)将干扰素标准品用测定培养液稀释至1000IU/mL，再用测定培养液4倍系列稀 释（1 : 1，1 : 4，1 : 16，1 : 64，1 : 256，1 : 1024，1 : 4096，1 : 16384)，其终浓度分别 为 1000、250、62·5、15·625、3· 906、0· 977、0· 244 和 0· 061IU/mL ;
[0068] (2)取各剂量组各时间点血清样品用测定培养液按一定稀释倍数稀释，加入96孔 细胞板中；
[0069] (3)细胞培养与接种，将Wish细胞在完全培养液中培养呈单层，贴壁生长，每周3 次，1 : 3消化传代，于完全培养液中生长。取生长良好的Wish细胞，弃培养液后，PBS洗涤 2次，消化和收集细胞后，用完全培养液调细胞悬浮液调至3. OX 105/mL，接种于96孔细胞 板中，每孔 1〇〇μ L，37°C，5% C02 培养 5h ;
[0070] (4)加标准品或血清样品于细胞板中，100μ L/孔，37°C，5% C02培养24h ;
[0071] (5)攻毒，弃培养板上清液，用攻毒培养液稀释VSV病毒至100TCID50,100 μ L/孔， 37°C，5% C02培养过夜至阳性对照孔中的细胞死亡为止；
[0072] (6)染色和脱色，弃培养板上清液，加入染色液50 μ L/孔，室温放置30min,冲洗去 染色液，吸干水分，加入脱色液100 μ L/孔，室温放置3-5min ;
[0073] (7)在酶标仪上测定570nm处的吸光度（0D)，参考波长为630nm ;
[0074] (8)结果统计：每个样品重复测定3次取其平均值，每细胞微孔板制备一条标准曲 线，同时设细胞对照和VSV对照。血清中干扰素活性单位被定义为保护半数Wish细胞免受 VSV病毒攻击的滴度。采用四参数回归计算，清除率（CL)、消除半衰期（tl/2i3);达峰时间 (Tmax)和峰浓度（Cmax)采用实测值。
[0075] 结果显示，药后体内抗病毒活性逐渐升高，到达最高抗病毒活性时间Tmax为16h， 其后随时间延长而逐渐降低，即低、中和高剂量在16h的最高生物活性（Cmax)分别为 35000,72000和150000叨/11^，逐渐下降至14411的1500,4000和9000叨/11^，药时曲线下面 积 AUC(0-144h)分别为 1. 2χ106,3· 5xl06 和 7. 3xl06IU/mL.h ;平均清除率 CL 为 17mL/h/kg， 平均消除半衰期（tl/2)约为43h，平均滞留时间（MRT)为76h。
[0076] 实施例13重组人白介素-15的CS-Lig制剂
[0077] 重组人白介素-15的CS-Lig溶液配置：用0. 01mol/l pH7. 4磷酸盐缓冲液配制 10 μ g/ml的1125标记重组人白介素-15,用0. 01mol/l pH7. 4磷酸盐缓冲液配制20 μ g/ml 的白介素-15和10mg/ml的实施例4制备的CS-Lig溶液混合制成10 μ g/ml的重组人白介 素-15-5mg/mlCS-Lig的重组人白介素-15-CS-Lig溶液。
[0078] 药代动力学比较测定：大鼠12只，雌雄各半，分为2组，分别单次给予1125标 记的10 μ g/kg的重组人白介素-15和含10 μ g/kg的重组人白介素-15的重组人白介 素-15-CS-Lig溶液，采用重组人白介素-15放射免疫（R1A)试剂盒测定皮下注射重组人白 介素-15和重组人白介素-15-CS-Lig后的血药浓度；在时间点为Omin，30min，lhr、2h、4h， 811、1211、1611时自尾静脉取血20(^1加入18(^10.129111〇1/1枸橼酸钠抗凝剂溶液中，立即 混匀，3000rpm离心20min，精密量取200μ 1上清，-20°C保存用于血药浓度的测定。测定数 据表明重组人白介素-15的药代符合一级消除动力学二房室模型，平均达峰时间T PMk (实测 值）为8. l±1.7min，平均消除半衰期（t1/2e)为21.2 士 1.3min;重组人白介素-15-CS-Lig 组平均达峰时间Tpeak(实测值）为12. 3±2. 7h，平均消除半衰期（t1/2e)为35. 3±3. 5h，t匕 重组人白介素-15的半衰期延长大近100倍。
[0079] 对荷瘤Balb/c小鼠 NK细胞活性的影响：取60只Balb/c小鼠，分别在右侧皮下接 种lxlO6个SP2/0细胞，约10d后形成皮下实体瘤，再随机分为成6组，每组10只，分别为空 白模型组（腹腔注射等体积的生理盐水）、重组人白介素-15组（腹腔注射0. 1 μ g/次）、 重组人白介素-15-CS-Lig组（腹腔注射0. 5 μ g/次）。给药方式为：重组人白介素-15组 1次/天，每周连续5天停药2天，连续给药5周；重组人白介素-15-CS-Lig组，每周给药一 次，连续给药5周。给药后第21、28、35、40天进行疆细胞杀伤活性检测。生长24-4811的 YAC-1细胞离心洗两次，计数后以10 %的FCS-1640 (完全1640)调整浓度为2xl05/mL作为 靶细胞；取小鼠血液用Tris-NH4C1稀释，带红细胞溶解后，离心-洗涤3次，计数，用10%的 FCS-1640调整至8xl06/mL，作为效应细胞；取效应细胞100 μ 1分别加入细胞板各孔，每份 实验样品7Κ孔，其中的3孔中再各加100 μ 1祀细胞为实验孔，另外3孔再各加完全1640液 100 μ 1效应细胞对照孔。37°C、5% C02孵箱培养2h后加 ΜΤΤ，再培养2h加助溶剂，培养过 夜后，用酶标仪测定吸光度Α57_值。用公式[1-(实验孔Α 57_-效应细胞对照孔、7(|11111)/靶 细胞对照孔A57(IJ Χ100%计算ΝΚ细胞活性用杀伤％表示。数据表明模型对照组ΝΚ细胞活 性平均为21 ±3. 7%，重组人白介素-15组治疗后NK细胞活性提高至40% ±3. 3,第五周开 始快速下降，第六周结束时，与模型对照都相近为25±3. 3% ;重组人白介素-15-CS-Lig组 组治疗后NK细胞活性提高并维持稳定37% ±3. 1，第45天给药结束后第10天，NK细胞仍 然维持较高活性性33% ±3. 5。
[0080] 实施例14重组人白介素-6的HP-Lig制剂
[0081] 重组人白介素_6的HP-Lig溶液配置：用0. 01mol/l pH7. 4磷酸盐缓冲液配制 40 μ g/ml的重组人白介素 -6,用0. Olmol/1 pH7. 4磷酸盐缓冲液配制80 μ g g/ml的重组 人白介素 -6和10mg/ml的实施例7制备的HP-Lig溶液混合制成40 μ g/ml的重组人白介 素 -6-5mg/mlCS-Lig的重组人白介素 -6-HP-Lig溶液。
[0082] 三氯乙酸（TCA)沉淀法测定血浆药物浓度：取抗凝血将上清10 μ 1两份各加入 Eppendorf离心管中，用190μl蒸馏水稀释摇匀，静置10分钟，再加入200μl20%TCA，摇 匀静置10分钟，5000rpm离心30min，弃上清，使用FT-2008 γ放射性计数仪测定沉淀部分 的放射性（cpm)，双管数值平均。根据每次样品的放射性比活性、放射性衰变、放射测量时间 和仪器计数效率校正，计算成血浆中 1251_重组人白介素-6的浓度（ng/ml)。几种剂量的曲 线走势基本一致，符合线性过程，重组人白介素-6-HP-Lig半衰期。
[0083] 静脉注射（iV)给药测定：SD大鼠20只，随机分为4组，每组3雄2雌，分别给予 1 125标记的重组人白介素-6组20μ g/kg和1125标记的重组人白介素-6-HP-Lig高（40μ g/ kg)、中（20 μ g/kg)、低（3 μ g/kg)剂量组。通过颈静脉插管注射给药，注射体积为0· 4ml/ 只。将注射器针头插入留在大鼠体外的PE管的管腔内，以注射器轻推将药物缓缓注入大 鼠颈静脉，再注入少量生理盐水将PE管腔内药物全部推入大鼠体内。注射后2, 5,10, 20， 40min，l，2,4,6,8,24,48h剪尾，流出的血液迅速滴入肝素化的Eppendorf离心管中，收集 约1〇〇μ1，然后离心8000rpm，5min，吸取上清，保存4°C。样品收集完毕后立即检测。测 定数据表明重组人白介素-6的药代符合一级消除模型，平均消除半衰期（t 1/2e)为5. 2 士 1. 7min ;重组人白介素-6-HP-Lig组平均消除半衰期（t1/2e)为50. 3±2. 3min，比白介素-6 的半衰期延长大近9倍。
[0084] 皮下注射（sc)给药测定：SD大鼠20只，随机分为4组，每组3雄2雌，分别给予1125 标记的重组人白介素-6组20μ g/kg和1125标记的重组人白介素-6-HP-Lig高（40μ g/kg)、 中（20 μ g/kg)、低（3 μ g/kg)剂量通过背部皮下注射给药，注射体积为0. 4ml/只。注射后 2, 5,10, 20,40min，l，2,4,6,8, 24,48, 72h剪尾，流出的血液迅速滴入肝素化的Eppendorf 离心管中，收集约100 μ 1，然后离心8000rpm，5min，吸取上清，保存4°C。样品收集完毕后立 即检测。测定数据表明重组人白介素-6-15的药代符合一级消除动力学二房室模型，平均 达峰时间T peak(实测值）为9. 2±1. 5min，平均消除半衰期（t1/2e)为23. 5 士 1. 7min ;重组 人白介素-6-HP-Lig组平均达峰时间Tpeak(实测值）为15. 7±2. 3h，平均消除半衰期（t1/2e) 为37. 3±2. 5h，比重组人白介素-6的半衰期延长大近95倍。
[0085] 实施例15重组人生长激素的diPEG-APn制剂
[0086] 重组人生长激素（rhGH)的diPEG-APn溶液配置：用0. 01mol/l pH7. 4磷酸盐缓冲 液配制0. 5mg/ml的重组人生长激素，用0. 01mol/l pH7. 4磷酸盐缓冲液配制1. 0mg/ml的重 组人生长激素和20mg/ml的实施例3制备的diPEG-APn混合制成0. 5mg/ml的rhGH-10mg/ ml diPEG-APn 的 rhGH-diPEG-APn 溶液。
[0087] 测量rhGH和rhGH-diPEG-APn活性：取无血清、无 hGH培养基100 μ 1分别加入96 孔平底微量滴定板各孔中；再分别取〇. 5mg/ml的rhGH和rhGH-diPEG-APn溶液样品100 μ 1 加入96孔平底微量滴定板第一排孔中，每种样品3孔，用排枪将第一排孔中样品混匀，吸 取100 μ 1加入第二排孔，混匀再吸取100 μ 1加入第三排孔，依次稀释到最后一排孔，混匀 再吸取100 μ 1弃去。取ΝΒ2-11细胞2xl05/mL的细胞悬浮液用无血清，无 hGH的培养基洗 涤两次，重新悬浮后取50 μ 1 (含104个细胞）分别加入96孔平底微量滴定板孔中，温育48 小时再加入细胞增殖试剂WST-1，再温育2. 5小时。在酶标仪中测定各孔光密度，作为浓度 的函数制图确定NB2-11增殖50%的rhGH和rhGH-diPEG-APn浓度值（EC50)。结果显示 rhGH-diPEG-APn相对于rhGH的体外生物活性性65%。
[0088] 体内半衰期测定：Wistar大鼠（200_250g) 10只，随机分为2组，每组3雄2雌，每 只大鼠分别静脉注射 〇· 25mg hGH 或 0· 25mg rhGH-diPEG-APn，在 0· 5、3、24、48、72 和 96 小 时舌下采集血1〇〇 U 1加入肝素化的Eppendorf离心管中，然后离心8000rpm，5min，吸取上 清，保存_8〇°C，用hGH ELISA试剂盒（DSL)测定各样品rhGH浓度。对时间绘制的曲线计 算，rhGH 半衰期 22min，rhGH-diPEG-APn 半衰期 llh，是 rhGH 的 30 倍。
[0089] 实施例16胸腺5肽的TiPEG-Lig制剂
[0090] 胸腺5肽（TP5)的TiPEG-Lig溶液配置：用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸盐缓冲液配制 100 μ g/ml的胸腺5肽（ΤΡ5)，用0. Olmol/1 ρΗ7. 4磷酸盐缓冲液配制1. Omg/ml的胸腺5 肽（TP5)和200 μ g/ml的实施例9制备的TiPEG-Lig混合制成100 μ g/ml的TP5-10mg/ml TiPEG-Lig 的 TP5-TiPEG-Lig 溶液。
[0091] 将BALB/c小鼠随机分为3组：TP5-TiPEG-Lig样品组，TP5标准品组及空白对照 组。腹腔注射小鼠，每只〇. 6ml (60 μ g)，同时每只腹腔注射0. 5ml羊红细胞（SRBC)。空 白对照组，每只腹腔注射0.6ml羊红细胞及0.6ml PBS。4d后杀鼠取脾测溶血空斑活性， 淋巴细胞转化活性，和免疫小鼠脾细胞分泌IL-2活性按照文献[金伯泉.医学基础免疫 学实验指导.第1版.北京：世界图书出版社，1990]操作。结果，分别计算实验组和对照 组每百万脾细胞内含空斑生成细胞数的平均值。经组间t检验，TP5组及TP5-TiPEG-Lig 样品组比较，差异均有显著意义（t = 5. 1，5. 3和7. 3, P < 0.01)，空白对照组，TP5组及 TP5-TiPEG-Lig 样品组溶血空斑活性分别为 30±8,78±15,352±37PFC/106Splenocytes， 与TP5相比，TP5-TiPEG-Lig活性高出近4倍；淋巴细胞转化活性测定结果表明，TP5 组及TP5-TiPEG-Lig样品组提高了小鼠的淋巴细胞转化率。经组间检验，TP5组及 TP5-TiPEG-Lig样品组与空白对照组比较差异均有显著意义（t = 5. 5、4. 2, P < 0. 01)，空 白对照组，TP5组及TP5-TiPEG-Lig组小鼠淋巴细胞转化率分别为1. 05±0. 3,1. 7±0. 8， 7. 5±0. 7，TP5-TiPEG-Lig淋巴细胞转化活性是TP5的4. 4倍；取淋巴细胞转化试验中的各 组小鼠脾细胞以适当浓度加入24孔培养板，培养8h，取其上清5倍稀释作为待测样品，检 测其分泌IL-2活性，数据表明，空白对照组，TP5组及TP5-TiPEG-Lig样品组分泌IL-2的 活性分别为 〇· 25±0· 07,1. 6±0· 8,3. 7±L 2IL-2IU/ml，与 TP5 相比，TP5-TiPEG-Lig 分泌 IL-2活性高出近1. 3倍；
[0092] E-玫瑰花环测定：ABLB/c小鼠（体重22 ± 2)，雌雄各半，随机法分组，1组免疫功 能低下小鼠，1组TP5对照小鼠，1组TP5-TiPEG-Lig实验组小鼠，每组8只小鼠。
[0093] 免疫功能低下小鼠的制备：给小鼠皮下注射氢化可的松，每日剂量为20mg/kg， 连续用药6天。给药方法：第7天，阴性对照组小鼠每日予0。1%CMC-Na溶液灌胃；阳 性对照组每日腹腔注射TP5,每日剂量为3. Omg/kg，连续给药7天；实验组注射21mg/kg TP5-TiPEG-Lig溶液一次；4兔红细胞悬液制备：无菌条件下，于耳缘动脉抽取兔血lml，以 肝素钠溶液抗凝，加 D-Hanks液5ml洗涤，离心（5000rpm，5分钟），弃上清液，同法再洗涤 两次，最后将红细胞悬于D-Hanks液中，最后得到浓度为1 %的兔红细胞悬液。小鼠淋巴细 胞悬液制备：通过摘小鼠眼球取血约3ml，肝素钠溶液作为抗凝，加入3ml D-Hanks液。在 玻璃离心管中加入淋巴细胞分离液，将小鼠血沿离心管壁缓慢加至分离液上，用水平离心 机以2000rpm离心20分钟。小心吸取分离液与红细胞中间乳白色单个核细胞层，移入另 一离心管中，用5ml D-Hanks液洗涤3次，每次1500rpm离心10分钟。将淋巴细胞重新悬 于D-Hanks液，先用血细胞计数板计数，用D-Hanks液调淋巴细胞浓度调整至2xl0 8个/ml。 E-玫瑰花环实验：取兔红细胞悬液和小鼠淋巴细胞悬液各0. lml，混合均匀。放入37°C孵 育10分钟，500rpm离心6分钟后，放入4°C冰箱保存2-4小时。从冰箱取出后先吸去部分 上清液，加〇. lm 0. 8%戊二醛溶液，4°C固定20分钟后，轻轻吹吸混匀沉淀细胞。然后取细 胞悬液涂片，自然干燥，95%乙醇固定，水洗后用苏木素-伊红染液染色，镜检计数。T细胞 吸附三个以上兔红细胞的为E花环形成淋巴细胞，通过计数200个淋巴细胞来计算E-玫瑰 花环形成率。
[0094] E-玫瑰花环形成率（％ )= E-玫瑰花环数/计数淋巴细胞总数X 100%
[0095] 数据表明免疫功能低下组6. 5±1.3, TP5组12±3, TP5-TiPEG-Lig组30±5,与 TP5 组相比，TP5-TiPEG-Lig 组提高了 1. 5 倍；
[0096] 实施例17 L-天冬氨酸酶的TiPEG-Lig制剂
[0097] 欧文氏菌（Erwinia)L-天冬氨酰胺酶（Laps)溶液配置：用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸 盐缓冲液配制100 μ g/ml的Laps ;用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸盐缓冲液配制1. Omg/ml的Laps 和 200 μ g/ml 的实施例 9 制备的 TiPEG-Lig混合制成 100 μ g/ml 的 TP5-10mg/ml TiPEG-Lig 的 Laps-TiPEG-Lig 溶液。
[0098] 体外酶促活性测定：用奈氏比色法来测定L-天冬酰胺酶催化L 一天冬酰胺所释 放的氨量测定L-天冬酰胺酶的氨基水解酶活性。将50 μ L酶溶液与50mM硼酸纳缓冲液 (pH8. 6)中的20mML-天冬酰胺混合并在37°C下温育lOmin。加入200 μ L的Nessler试剂 终止反应。然后测量吸光度Α45_，从硫酸铵浓度标准曲线计算所述活性。结果Laps比活性 650U/mg蛋白，Laps-TiPEG-Lig比活性623U/mg蛋白，为L-天冬氨酰胺酶（Laps)比活性的 95.8% ;可以认为基本没有活性损失。
[0099] 体内酶促活性测定：酶将L 一天冬氨酰-β-异羟异羟肟酸（AHA)底物水解为 L-ASP和羟胺，再用8-羟基喹啉缩合氧化为indooxine，测定吸光度A710nm定量，计算酶活 力（Analytical Biochem. 309(2002) :117-126)。
[0100] 药代动力学性质：小鼠（B6D2F1)(雌性具免疫活性），每组8只动物，按照5, 25 或50U/kg Laps-TiPEG-Lig和250U/kg的Laps单次静脉注射给药，在给药前lh和给药后 90min、2h、4h、6h、8h、24h、48h、96h、144h、192h、240h 和 288h，分别从眼框收集血浆样品，测 定血浆残留酶活性和L 一天冬酰胺水平；通过甲醇沉淀去除样品血浆蛋白，上清液用异硫 氰酸苯酯衍生其中自由氨基酸，再用RP-HPLC进行走量。计算半衰期时间=-In (2*时间）/ In (所述时间点血浆酶活力/初始血浆酶活力）；曲线下面积（AUC)表示血浆残留酶活性的 时间积分，表示总效应。结果L-天冬氨酰胺酶（250U/kg)最高血浆浓度出现在6h为75U/ L，AUC1200,酶活力最长持续时间18h，在48h内可维持血浆中L 一天冬酰胺水平低于5μΜ 浓度；Laps-TiPEG-Lig (50U/kg)最高血浆浓度出现在7h为230U/L，AUC35374,酶活力最长 持续时间288h，在144h内可维持血浆中L 一天冬酰胺水平低于5 μ Μ浓度。
【权利要求】
1. 一种药物-高分子聚合物的非共价聚合物，其特征在于： (1) 高分子聚合物分子上含共价连接的亲和配体； (2) 高分子聚合物与药物混匀后形成。
2. 根据权利要求1所述的药物-高分子聚合物的非共价聚合物，其特征是，所述的药物 包括但不限于重组生物药、提取生物药和合成生物药。
3. 根据权利要求2所述的重组生物药包括但不限于促红细胞生成素（EPO)、人粒细胞 集落刺激因子（G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、疫苗、干扰素（INF)、白 介素（IL)、生长激素（GH)、胰岛素（Insulin)、表皮生长因子（EGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF)、转化生长因子（TGF-B)、胰岛素样生长因子（IGF)、血管内皮细胞生长因子（VEGF)、 血小板生长因子（PDGF)、内皮生长因子（ECGF)、神经生长因子（NGF)、骨衍生性生长因子 (BDGF)、骨形成蛋白（BNIP)、组织多肽抗原（TPA)、抗体（antibody)、凝血因子VIII (VIII) 及IX、遗传因子、链激酶、和用于治疗的蛋白质或多肽、疫苗含重组乙型肝炎疫苗。
4. 根据权利要求2所述的合成生物药包括但不限于反义核苷酸（anti-RNA)、小分子 RNA(RNAi)、基因（DNA)、杆菌肽、五肽胃泌素、丙胺瑞林、缩宫素、降钙素、奥曲肽、胸腺肽、生 长抑素、谷胱甘肽、心房肽、抑氨肽酶B、抑胃蛋白酶肽、去氨加压素、乌苯美司、氨肽素。
5. 根据权利要求2所述的提取生物药指血液制品包括但不限于白蛋白、免疫球蛋白、 凝血因子、纤维蛋白原、凝血酶、抗胰蛋白酶Alpha-Ι。
6. 根据权利要求2所述的提取生物药指动物脏器提取品包括但不限于胰激肽原酶、蚓 激酶、凝乳酶、胰酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、玻璃酸酶、玻璃糖醛酸酶、弹性酶、抑肽酶、门冬酰 胺酶I、门冬酰胺酶I，细胞色素 C、尿激酶、乌司他丁、激肽原酶、尿促性素、HMg，绒促性素、 菠萝蛋白酶、菠萝酶、超氧化物歧化酶（SOD)、舍雷肽酶、溶菌酶、降纤酶、蕲蛇酶、转移因子。
7. 根据权利要求1所述的药物-高分子聚合物的非共价聚合物，其特征是，所述的药物 包括但不限于人源、动物源包括猪、牛、羊、马、鸡、鸭、鸽、鱼。
8. 根据权利要求1所述的药物-高分子聚合物的非共价聚合物，其特征是所述的高分 子聚合物包括但不限于聚酯、聚酸酐、或骨架非肽键的聚氨基酸，其中包括：聚乳酸、聚乳酸 一聚羟基乙酸及其组合；还包括卡波母、透明质酸、硫酸软骨素、肝素、明胶、胶原蛋白、纤维 蛋白原、纤维蛋白、、葡聚糖、烯丙基葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚乙二醇、聚乙二醇一聚乳酸 嵌合高分子、聚乙二醇一聚羟基乙酸嵌合高分子、聚羟基乙酸一聚乙二醇一聚羟基乙酸嵌 合高分子、聚乳酸一聚乙二醇一聚乳酸嵌合高分子、糖敏型凝胶和酸敏型凝胶高分子、聚氰 基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯。
9. 根据权利要求1所述的药物-高分子聚合物的非共价聚合物，其特征是所述的亲和 配体包括但不限于由化学基团乙二胺、三乙烯四胺、3-二乙基氨基丙胺、1，2_二氨基环己 烷、5-氨基-2, 2,4_三甲基环戊甲胺、庚胺、辛胺、任胺、葵胺、环戊胺、环庚胺、环辛胺、环任 胺、环葵胺、组胺、色胺、酪胺、苯胺、3-氨基苯酚、对-氨基苯酚、苯甲胺、3-氨基批陡、2-胺 甲基吡咯、3, 5-二氨基苯甲酸、2-氨基苯并咪唑、5-氨基苯并咪唑、4,4'-二氨基二苯醚、3， 3' -二甲基联苯胺及其组合。
10. 根据权利要求9所述的亲和配体，其特征是用常规化学方法在聚合物分子上直接 共价连接单个配基分子。
11. 根据权利要求9所述的亲和配体，其特征是在聚合物上通过多活性基团骨架分步 组合固定多种化合物合成复杂结构配体。
12. 根据权利要求11所述的亲和配体组合的合成方法，其特征是多活性基团骨架包括 但不限于三氯三氮嗪、多肽固相合成。
13. 药物组合物，包含根据权利要求1所述的药物-高分子聚合物的非共价聚合物体内 注射后在血浆中的治疗有效水平维持至少2小时以上。
14. 根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于可以添加赋形剂与制剂的其它组 分一起产生稳权利1所述物药-高分子聚合物非共价结合物制剂。
15. 根据权利要求13所述的赋形剂，其特征在于包括但不限于多元醇含甘露醇、山梨 醇、海藻糖醇、麦芽糖醇，木糖醇和麦芽糖醇。优选的多元醇赋形剂是甘露醇。
16. 根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于可以添加表面活性剂与制剂的其 它组分一起产生稳权利1所述物药-高分子聚合物非共价结合物制剂。
17. 根据权利要求15所述的表面活性剂，其特征在于包括但不限于多元醇衍生物、丙 二醇二乙酸酯、聚氧乙烯酯和醚、壬基苯基醚、聚乙烯醇、泊洛沙姆（泊洛沙姆188)、链烷醇 酰胺。
【文档编号】A61K38/48GK104147596SQ201310178008
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月14日 优先权日:2013年5月14日
【发明者】李荣秀, 刘玥 申请人:李荣秀