改良脂质体复合物的稳定性和保存期的方法

专利名称：改良脂质体复合物的稳定性和保存期的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备稳定复合物的方法，所述复合物包含一种配体和一种包囊封装(encapsulating)有一种治疗剂或诊断剂的阳离子脂质体。
背景技术：
本文所引用的所有参考文献均以其全文并入参考。阳离子脂质体由正电荷的脂质双层组成，并且可以通过简单地混和脂质与DNA而与负电荷的裸DNA进行复合，由此所得复合物具有净正电荷。所述复合物可以结合培养细胞并被其以中等良好程度的转染效率摄取。阳离子脂质体已经被证实对于体内基因输送是安全而有效的。脂质体可通过对其加以修饰由此其将有效载荷(payload)选择性输送至肿瘤细胞而用于靶向肿瘤细胞。表面分子可用于将脂质体靶向于肿瘤细胞，因为肿瘤细胞外面的分子的类型和/或数目与正常细胞上的那些不同。例如，如果脂质体在其表面上具有叶酸或运铁蛋白(Tf)分子，则其将导 向叶酸或运铁蛋白受体的水平高于正常细胞水平的癌细胞。除了使用由肿瘤细胞上受体识别的配体之外，也可以将特异性抗体附于脂质体表面，使其靶向于特异性肿瘤表面抗原(包括但不限于受体)。这些“免疫脂质体”可将治疗药物输送至特异的细胞群。例如已经发现与脂质体缀合的抗-HER-2单克隆抗体(Mab)Fab片段可以特异性结合过表达HER-2的乳腺癌细胞系S-BR-3(Park，J.ff.，et al.PNAS92:1327-1331 (1995))。发现免疫脂质体是被有效内在化的，并且抗_HER_2Fab片段的锚定增强其抑制作用。组合阳离子脂质体基因转移和免疫脂质体技术似乎是一种有前途的靶向基因治疗系统。本领域描述了针对DNA基因治疗的配体靶向脂质体输送系统，其具有选择性肿瘤革巴向和高转染效率。见 Xu, L.，et al.Human Gene Therapy8:467-475(1997) ；Xu, L.，et al., Human Gene TherapylO:2941-2952(1999)及 Xu, L., et al., Tumor Targeting4:92-104(1999)所述。这个系统通过使用抗运铁蛋白受体单链(TfRscFv)抗体片段作为复合物中的靶向配体而得以改良(Xu，L.，et al.Molecule Medicine7:723-734(2001) ；Xu, L.,et al.Molecular Cancer Therapeuticsl:337-346 (2002))。TfRscFv 是由分别来自轻链和重链的VH和VL可变结构域与适当设计的接头肽连接而形成。所述接头连接第一个可变区的C末端和第二个可变区的N末端，顺序为VH-接头-VL或者VL-接头-VH。scFv的结合位点可以复制其亲代抗体结合位点的亲和性和特异性。癌症的常规治疗包括化疗和/或放疗。在这些常规癌症疗法中加入一种新的使肿瘤对化疗或放疗敏化的成分将具有很大的临床实用性，降低这两种类型抗癌疗法的有效剂量并相应地减轻通常与这些治疗相关的副作用。
如上述对脂质体复合物的最初研究示出所述复合物在将诊断或治疗剂输送至感兴趣的靶细胞中是有效的。在该复合物形成时立即将其给予患者是不切实际的。希望提供靶向脂质体复合物，其是冻干的并在2-8°C、-20°C或-80°c贮存仍保持稳定至少6个月并可以复原(reconstituted)而不显著丧失活性。先前的报道表明两种成分的复合物(脂质和DNA但无靶向配体或蛋白质)可以在存在单糖或双糖的情况下冻干并仍保留其生物学活性及适于基因治疗的颗粒大小(Li，B.，et al., Journal of Pharmaceutical Sciences89:355-364(2000)和 Molina, M.D.C.etal.Journal of Pharmaceutical Sciences90:1445-1455(2001) ；Allison, S.D., etal.Biochemical et Biophysical Actal468:127-138 (2000))。另夕卜，通过 PEG 与 PE1-DNA聚合复合物(polyplex)连接的Tf在冷冻和解冻后仍保留一些生物学活性(Kursa, M.etal.,Bioconjugate Chemistryl4:222-231 (2003))。重要的是注意这种复合物不是冻干的，未给定可能的贮存长度和条件，如果包括糖(蔗糖)则在解冻后加入。这种聚合物复合物需要Tf通过PEG分子与所述聚合物连接。发明概述本发明提供了一种制备稳定复合物的方法，所述复合物包含一种配体和一种包囊封装有一种治疗剂或诊断剂或报道基因的阳离子脂质体，所述方法包括:组合一种复合物和一种溶液，所述复合物包含一种配体和包囊封装有一种诊断剂或治疗剂或报道基因的阳离子脂质体，所述溶液包含稳定量的蔗糖；及冻干所得的复合物和蔗糖的溶液以获得冻干的制品；其中在复原(reconstitution)时所述制品保留其至少约80%的冻干前活性。

在一个优选的实施方案中，所述制品保留其冻干前至少约85%的活性，更优选至少约90%的冻干前活性。附图简述

图1示出新鲜制备的和冻干的含有5%葡萄糖或5%蔗糖的复合物(Tf-LipA-Luc和 TfRscFv-LipA-Luc)的大小(nm)。图2A和2B示出新鲜制备的和冻干的含有5%葡萄糖或5%蔗糖的复合物(Tf-LipA-Luc和TfRscFv-LipA-Luc)在DU145人前列腺细胞中的体外转染效率，以相对发光单位(relative light units, RLU) / μ g 蛋白质表示。图3示出新鲜制备的和冻干的含有5%或10%蔗糖的TfRscFv-LipA-Luc复合物在DU145人前列腺癌细胞中的体外转染效率(RLU/μ g蛋白质)。图4A和4B分别示出冻干的配体-脂质体质粒DNA复合物对DU145前列腺和PANCI胰异种移植肿瘤的靶向。图5示出在人前列腺癌(DU145)异种移植小鼠模型中，实验室制备的具有10%蔗糖的TfRscFV-LipA-p53复合物在冻干并在2_8°C贮存直至6个月后仍保持肿瘤靶向能力。图6示出在DU145异种移植小鼠模型中冻干的、具有10 %蔗糖的TfRscFv-LipA-p53复合物的肿瘤靶向和转染效率在批次与批次之间的一致性。图7示出在DU145异种移植小鼠模型中5个不同批次的商业制备并冻干的具有10%蔗糖的TfRSCFv-LipA-p53的肿瘤靶向和转染效率。图8示出通过非变性凝胶电泳评估的在多个新鲜的和冻干的TfRscFv-LipA_p53复合物中未复合的TfRscFv的百分比。图9示出在MDA-MB-435乳腺癌细胞中冻干的与新鲜制备的TfRscFv-LipA-AS-HER-2复合物之间细胞生长抑制作用的体外对比。图10示出新鲜制备的或冻干的TfRscFv-LipA-AS HER-2复合物的PANC-1化学敏感性的体外对比。图11示出在MDA-MB-435人乳腺癌细胞中具有10%蔗糖的TtRscFv-LipA-ASHER-2在冻干并在2-8°C贮存直至6个月后体外下调HER-2的表达。发明详述根据本发明，冻干的配体与包囊封装有诊断剂或治疗剂的脂质体的复合物的稳定性可以通过在冻干之前将该组合物与稳定量的蔗糖水溶液组合而增加。所述蔗糖溶液可以是简单的蔗糖与水的溶液，或者可以是与缓冲液如PBS、HEPES, TRIS或TRIS/EDTA的溶液。典型地，将所述蔗糖溶液与所述复合物组合至终浓度为约I % -约80%蔗糖，典型地为约I % -约50 %蔗糖，如I % -约10 %、20 %、30 %或40 %蔗糖，优选约5 % -10 %蔗糖，最优选约10%蔗糖。该冻干制品在约2-8°C至约_80°C的范围内可以保持稳定性至少6个月而不明显丧失活性。优选地，所述制品可以稳定至少约6-12个月。在复原时，所述复合物保持其至少80%的冻干前活性，优选保持其至少约85%的冻干前活性，最优选保持其至少约90-95%的冻干前活性。先前的报道已经表明了脂质与DNA的复合物可以在存在单糖或二糖的情况下冻干并保持生物学活性(Li，B., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences89:355-364 (2000)及 Molina, M.D.C.et al.Journal of Pharmaceutical Sciences90:1445-1455 (2001) ；Allison, S.D., et al.Biochemical et Biophysical Actal468:127-138(2000))。然而未曾料到由如下成分组成的一种三成分复合物也可以冻干并在复原后保持其大小和生物学活性:1)蛋白质(例如运铁蛋白)，甚至包括是抗体或抗体片段(例如抗运铁蛋白受体单链抗体片段，TfRscFv)的蛋白；2)脂质体及3)治疗性核酸分子(例如质粒DNA、反义寡核苷酸分子或者甚至siRNA分子)。所述脂质体复合物典型地通过静脉内给予。对于静脉内注射,将50%葡萄糖溶液常规加入所述配体-脂质体复合物中，至终浓度为5%。现在令人惊奇地发现通过将新鲜制备的(即制备后不超过约1-约24小时的复合物)配体-脂质体复合物与蔗糖溶液而不是葡萄糖溶液组合，该三成分复合物(包括具有抗原靶向实体(entity)的那些复合物)的活性和保存期在冻干及复原后可以显著增加。所述三成分复合物在冻干之前可以简单地与蔗糖溶液混和。所述溶液典型地包含约50-约100%重量的蔗糖，优选包含约50%重量的蔗糖。冻干可以根据任何常规的方法将复合物的水分含量降低至约1.3%以下而进行。一个优选的方法包含将含有复合物的溶液在_50°C至_60°C、在20-50微米汞柱优选25微米汞柱的条件下、冻干12-60小时，优选20-48小时，然后在约2-8°C与约_80°C之间贮存该冻干制品。在另一个优选的方法中，将含有复合物溶液的小瓶在环境温度置于商购的冷冻干燥器中，然后将温度在I个小时内降低至-45°C ±3°C并在此温度保持3小时。然后将冷凝器设定在_80°C或更低温度，真空设定为50微米Hg。保存温度然后在I小时内升至_35±3°C，并在此温度保持约36-72小时，优选约48小时。然后在4小时内将保存温度升至20±3°C，并在此温度保持约6-约48小时，优选约12小时。在这个方法结束时，将室压用氮气恢复至大气压水平(通过适当的无菌微生物滞留滤膜)并将瓶子用塞子塞住。冻干的复合物可以通过加入与冻干前的溶液等体积的无菌、无内毒素的水而复原。轻轻摇动以迅速溶解所述干燥的复合物。没有由于冻干或贮存而发生可测量的复合物的大小或zeta电势改变。可与蔗糖溶液混和、冻干并复原的合适的复合物是能靶向细胞的、全身性输送用于治疗或诊断疾病的多种类型治疗或诊断分子的细胞靶向配体/脂质体/治疗性分子、报道分子或诊断分子复合物。靶细胞优选是癌细胞，但也可以是非癌细胞。优选的癌靶细胞包括前列腺、胰腺、乳腺、头颈、卵巢、肝和脑癌及黑素瘤。本领域技术人员熟知大多数类型的癌细胞，包括但不限于上述那些细胞，均过表达运铁蛋白和叶酸的受体，这些受体在癌细胞中也迅速 再循环(Li, H., and Qian,.Ζ.Μ., Medicinal research Reviews2 (3):225-250(2000) ；Qian, Z.M.，et al.，Pharmacological Reviews54(4):561-587(2002)；gosselin, M.A., and Lee, P.J., Biotechnology annual Reviews8:103-131(2002))。希望的是，所述治疗分子是基因、多核苷酸，如质粒DNA、DNA片段、寡核苷酸、寡脱氧核苷酸、反义寡核苷酸、嵌合的RNA/DNA寡核苷酸、RNA、siRNA、核酶、病毒颗粒、生长因子、细胞因子、免疫调节剂或其它蛋白质，包括其表达时呈递刺激或抑制免疫系统的抗原的蛋白质。优选的治疗剂是核酸分子，优选DNA或siRNA分子。优选的DNA分子是编码基因如野生型p53分子、Rb94分子、Apoptin分子、EGFG分子或反义分子的DNA分子。优选的HER-2反义寡核苷酸是针对HER-2基因并具有序列5' -TCC ATG GTG CTC ACT-3'。优选的siRNA分子是针对HER-2mRNA起作用的分子。其它优选的治疗性分子可以由本领域技术人员不用过多的实验而确定。如上所述，靶细胞或者可以是非癌细胞。优选的非癌靶细胞包括树突细胞、血管内皮细胞、肺细胞、乳腺细胞、骨髓细胞和肝细胞。可以靶向非希望的但良性的细胞，如良性的前列腺增生细胞、过度活性的甲状腺细胞、脂瘤细胞，及与自身免疫疾病相关的细胞，如产生参与关节炎、狼疮、重症肌无力、鳞状上皮化生(squamous metaplasia)、发育异常等的抗体的B细胞。或者，所述制剂可以是在给予后能在体内检测的诊断剂。诊断剂例如包括电子致密材料(electron dense material)、磁共振显象剂和放射性制剂。用于显象的放射性核素包括铜、镓、铟、铼、和锝的放射性同位素，包括64CU、67CU、mIn、99mTc、67Ga*68Ga。由在此并入参考的Low等的美国专利5，688，488所揭示的成象剂用于本发明所述的脂质体复合物中。配体可以是其受体在靶细胞上差异表达的任何配体。例如包括运铁蛋白、叶酸、其它维生素、EGF、胰岛素、Heregulin, RGD肽或与整联蛋白受体反应的其它多肽、抗体或其片段。优选的抗体片段是抗体的单链Fv片段。所述抗体或抗体片段是结合靶细胞表面上受体的抗体或抗体片段，优选结合在靶细胞上差异表达的受体。一种优选的抗体是抗TfR单克隆抗体，优选的抗体片段是基于抗TfR单克隆抗体的scFv。另一优选的抗体抗HER-2单克隆抗体，另一优选的抗体片段是基于抗HER-2单克隆抗体的scFv。配体与脂质体在室温混和，配体与脂质体的比率在约1: 0.001至I: 500(μ g: nmole)的范围，优选约1: 10至约1: 50 ( μ g: nmole)。将治疗剂与阳离子脂质体在室温混和，制剂:脂质比率在约1: 0.1至1: 50(yg: nmole)的范围，优选约1: 10至约1: 24(yg: nmole)。例如在其中配体是运铁蛋白和治疗剂是质粒DNA的复合物中，治疗剂与脂质体与配体的有用比率典型地在约1μ g: 0.l-50nmole: 0.1-100 μ g的范围内，优选 lug: 5-24nmole: 6-36 μ g,最优选约 I μ g:1Onmole: 12.5yg。如果配体是TfRscFv，则配体与脂质体的有用比率典型地在约1: 5-1: 40(μ g: μ g)的范围内，优选1: 30(yg: μ g)的范围内，质粒DNA与脂质体的比率典型地在约1:6-1: 20(yg: yg)的范围内，优选1: 14(yg: μ g)的范围内。如果治疗剂是寡核苷酸(ODN)而不是质粒DNA，配体、脂质体和ODN的典型比率为0.lnmole-36nmole (0DN:脂质体)及0.1 μ g-100 μ g(配体:脂质体),优选0.5nmole-20nmole(0DN:脂质体)及
0.5 μ g-50 μ g (配体:脂质体)，最优选 lnmole-15nmole (0DN:脂质体)及 I μ g_30 μ g (配体:脂质体)。如果治疗剂是siRNA，则成分的有用比率可以是0.1yg: 30nmole (siRNA:脂质体)及 0.1yg: 100 μ g (TfRscFv:脂质体)，优选 Iyg: 7nmole (siRNA:脂质体)及 Iyg: 30 μ g (TfRscFv:脂质体)。有许多阳离子脂质体用于制备所述复合物。在此并入参考的公布的PCT申请W099/25320描述了一些阳离子脂质体的制备。希望的脂质体例如包括包含二油酰基三甲基磷酸铵(DOTAP)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或胆固醇(chol)的混合物或者包含二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和DOPE和/或胆固醇的混合物的那些脂质体。脂质的比率可以加以变化以优化特异性靶细胞类型对治疗性分子的摄取。所述脂质体可以包含一或多种阳离子脂质及一或多种中性或辅助脂质的混合物。阳离子脂质与中性或辅助脂质的希望比率是约1: (0.5-3)，优选1: (1-2)(摩尔比率)。在一个实施方案中，用于形成复合物的脂质体是一种空间稳定的脂质体。空间稳定的脂质体是其中已经整合进亲水性聚合物如PEG、聚(2-乙基丙烯酸)或者聚(η-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)的脂质体。这种修饰的脂质体当与治疗剂或诊断剂复合时可以是特别有用的，因为它们典型地不被网状内皮系统以如同清除未如此修饰的相应脂质体那样快地从血流中清除。在第二个实施方案中，用于形成所述复合物的脂质体也与由组氨酸和赖氨酸(分支的或线性的)组成 的肽结合，其中所述肽的长度为至少约10个氨基酸，典型地为约10-1000个氨基酸之间，并且是由5-100%的组氨酸和0-95%的非组氨酸氨基酸组成，优选至少10%的非组氨酸氨基酸是赖氨酸。最优选地，所述肽的长度为约31个氨基酸，约20%的氨基酸是组氨酸，约80%的氨基酸是非组氨酸，至少75%是赖氨酸及至少一个是末端半胱氨酸。优选的肽具有结构5' -K[K (H) -Κ-Κ-Κ]5-K (H) -K-K-C-3/，并且可以通过末端半胱氨酸和脂质体中的一个马来酰亚胺基团而与所述脂质体共价缀合。在这种复合物中，成分的比率典型地可以如下:配体与HK-脂质体(μ g: yg)比率为1: 5-1: 40，优选I: 30，及 DNA 与 HK-脂质体(μ g: nmole)比率为 1: 1-1: 20，优选 1: 14。所述复合物可以通过将配体-脂质体与治疗剂或诊断剂混和在一起、将所得溶液缓慢上下颠倒一定时间或者以在溶液中恰好形成涡流的速度搅动该溶液约10秒至约10分钟，优选15秒至约2分钟而制备。所述复合物可以与另外的治疗剂组合给予，如与放射物或化疗剂组合。所述治疗剂或治疗剂的组合可以在给予所述复合物之前或随后给予，例如在约12小时至约7天内给予。化疗剂包括但不限于例如阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、顺钼(cisplatin，CDDP)、紫杉特尔(docetaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、紫杉醇(paclitaxel)、长春花碱、表鬼曰毒素P比喃葡糖苷(VP-16)、喜树碱(camptothecia)、放线菌素-D、米托蒽醌(mitoxantrone)和丝裂霉素C。放射疗法包括Y射线、X-线、UV放射、微波、电子发射等。本发明通过如下实施例得以进一步例证，所述实施例只是例证本发明而无限制之
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实施例实施例1:新鲜的和冻干的具有碳水化合物的复合物的制备及活性和大小的体外评估进行最初的实验以测试用碳水化合物制备的配体-脂质体核酸复合物在冻干前后的大小及体外转染效率。测试两个单独的配体，Tf和TfRscFv。所述复合物使用美国专利申请09/601，444和公布的美国专利申请09/914，046和10/113，927所述的方法制备[也见于 Xu, L., et al.Human Gene TherapylO:2941-2952 (1999) ；Xu, L., et al., HumanGene Therapy13:469-481(2002);和 Xu, L., et al., Molecular Cancer Therapeuticsl:337-346(2002)所述]。在每个复合物中，脂质体是1:1比率的DOTAP: D0PE，在此称为脂质体A(LipA)。使用的DNA是携带编码的萤火虫萤光素酶基因的质粒。在所有情况中，碳水化合物溶液均在复合物制备的最后步骤中加入。制备一系列8个复合物。4个含有Tf作为配体(DNA: LipA: Tf比率为lyg: IOnmole: 12.5μ g) ;4 个含有 TfRscFv 作为配体(DNA: LipA: TfrscFv 比率为Iyg: Hnmole: 0.34 μ g)。将含有配体-脂质体的溶液与DNA混和在一起，缓慢倒转10次，将所得溶液在室温保持15分钟，之后加入葡萄糖或蔗糖于水中的水溶液至终浓度为5%。将每个所得混合物倒转10次，然后在室温保持15分钟，之后冻干或转染。
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准备冻干的溶液使用Virtis Benchtop3L冷冻干燥器在25微米萊柱在_55°C冻干24小时，然后在_80°C贮存过夜之后复原。在用与冻干前溶液体积相等的水复原之后，将装有每种溶液的容器缓慢倒转10次并在室温保持60分钟。之后复原的复合物可以在2-8°C保持直至24小时。冻干前后复合物的大小使用Malvern ZetasizerfOOOH通过动态激光光散身寸(dynamic laser light scattering)而测定。测定大小的结果(平均数)示于图1。当Tf是配体时，在存在5%葡萄糖的情况中冻干后大小增加近10倍。而具有5%蔗糖的新鲜复合物的大小略大于具有5%葡萄糖的复合物，在存在蔗糖的情况中冻干前后基本无变化。当TfRscFv用作配体时观测到相似的模式。在这里使用5%蔗糖提供更好的冻干后结果。对新鲜的和冻干的复合物还评估了其在人前列腺肿瘤细胞系DU145中的转染效率。对比在复原时的冻干复合物(具有Tf和TtRscFv)与相应的新鲜制备的相同复合物的溶液的转染效率。冻干前后的转染效率结果示于图2A和2B。当配体是Tf时，含有5%葡萄糖的制品在冻干后效率下降至新鲜制备的复合物的约60%，而含有5%蔗糖的冻干制品保持其初始活性的约80%。模式与TfRscFv作为配体时相似。含有5%葡萄糖的冻干复合物的活性下降至新鲜制品活性的约50%，而当使用5%蔗糖时保留约90%活性(图2B)。因此，蔗糖是比葡萄糖更有效的稳定剂。糖/复合物比率被进一步优化以改良稳定性并保持颗粒大小。对比具有5%和10%蔗糖的复合物。并将质粒DNA的量也增加至20 μ g，在体内研究中通常用于单次注射的量在下文论述。在如上述冻干后，含有10%蔗糖的复合物的转染效率是用5%葡萄糖溶液常规制备的新鲜复合物的 95%。图3示出了用5%和10%蔗糖制备的复合物之间的转染效率的对比。使用含有10%蔗糖的冻干复合物的体外转染效率最佳。发现这不依赖于是否是蛋白质还是抗体片段用作靶向配体。对含有10%蔗糖的复合物在使用上述条件冻干前后的大小也进行了评估。与用5%葡萄糖制备的常规新鲜复合物相对比，用10%蔗糖制备的复合物的大小在冻干前后无显著差异。本发明还发现这种情况也不依赖于靶向配体。因此，与含有5%葡萄糖或5%蔗糖的相应复原制品相比，复原的脂质体复合物制品中存在10%的蔗糖更好的维持了生物学活性和大小。实施例2:冻干的复合物在2-8 °C贮存一周后在体内对人前列腺肿瘤的靶向在复合物中使用增强的绿色荧光蛋白(EGFP)作为报道基因，测试具有10%蔗糖的脂质体复合物(新鲜制备的或冻干的并在2-8°C贮存I周)的体内肿瘤靶向。所述复合物是TfRscFv-脂质体A-pEGFP，其中脂质体A是DOTAP: DOPE (I: I)。三种成分的比率是0.3yg: 14nmole: I μ g(TfRscFv:脂质体:DNA)。所述复合物如实施例1所述制备并冻干。在冻干后，将复合物在2-8°C冷却贮存I周。样品通过加入无内毒素水而复原为冻干前的体积，如实施例1所述进行。给携带至少50mm3的DU145异种移植肿瘤的小鼠在24小时内静脉内注射3次不同复合物(具有5%葡萄糖的新鲜制品、具有10%蔗糖的新鲜制品及复原的具有10%蔗糖的冻干制品，其在复原前在2-8°C已经冷却贮存I周，所有制品均用TfRscFv作为靶向配体)。48小时后，将动物处死，切下肿瘤和肝脏，分离蛋白质并使用抗EGFPAb (C0VANCE)进行Western分析。如图4A所示，具有10%蔗糖的冻干和复原的复合物与任一新鲜制备的复合物相对比均具有相似的基因表达水平。更显著地，在肿瘤中显然存在高水平的外源基因表达，在小鼠的肝脏中几乎没有EGFP表达，这表明了复合物的肿瘤特异性性质，并且这种肿瘤靶向特异性在冻干后、在2-8°C贮存至少I周及复原后仍保留。实施例3:冻干的复合物在_80°C贮存I个月之后的体内人胰腺肿瘤靶向对在-80°C贮存I个月后的冻干复合物的稳定性通过其靶向胰腺癌异种移植肿瘤也加以测试。所述复合物如实施例1所述用10%蔗糖制备并冻干(与实施例2所述相同的复合物及比率)。冻干后，将样品在-80°C贮存I个月，然后如实施例1所述用无内毒素水复原。如图4B所示，来自在24小时内经静脉内注射3次小鼠(如实施例2所述)的肿瘤示出甚至比用新鲜制备的复合物注射后发现的EGFP基因表达水平更高的水平。同样，在肝中仅观测到非常弱的表达或无表达。实施例4:通过大小和体外转染效率评估在2_8°C贮存的冻干复合物的长期稳定性为增加Tf RscFv-脂质体-DNA复合物作为可行的临床治疗剂的潜力，揭示了一种增加其稳定性的手段，由此保持其肿瘤靶向能力和贮存期。我们的一些研究表明具有10%蔗糖作为赋形剂的冻 干的复合物可以在_20°C、-80°C或2-8°C成功贮存。为便于临床应用，优选的贮存方法是在2-8°C。为确定冻干的复合物可以在2-8°C贮存而不丧失生物学活性的时间长度，对冻干的并在2-8°C贮存1、4和6个月的复合物的体外转染效率进行评估。所述复合物为TfRscFv-脂质体A-p53，其中脂质体A是DOTAP: DOPE (I: I)。三种成分的比率是0.3 μ g: 14nmole: lug (TfRscFv:脂质体A: DNA),这等于
0.34yg: IOyg: Iygo 10%蔗糖用作赋形剂。复合物中的DNA是含有编码人野生型P53的 1.7Kb cDNA序列的质粒载体。如实施例1所述制备、冻干，并在2_8°C贮存后适当的时间复原所述复合物。大小(数字参数)和Zeta电势使用Malvern 3000H Zetasizer确定。功能活性使用萤光素酶共转染分析评定。将人前列腺癌DU145细胞用BP100质粒DNA和所述复合物共转染。BP100质粒携带在wtp53诱导型启动子控制下的萤光素酶基因。由此，功能性P53在转染细胞中的水平通过萤光素酶活性水平反映。在转染24小时后，将细胞裂解并使用Promega萤光素酶试剂根据厂商指导分析萤光素酶活性。如表I所示，萤光素酶活性、所述复合物的大小和zeta电势在新鲜制备的复合物及冻干的并在2_8°C贮存直至6个月的复合物之间是一致的。表1:冻干复合物和新鲜制备复合物的比较
权利要求
1.冻干复合物在制备用于靶向细胞的药物中的用途，所述冻干复合物基本由复合物以及增加所述复合物稳定性的量的鹿糖组成，所述复合物包含配体与包囊封装有治疗剂或报道基因或诊断剂的阳离子脂质体，所述配体是运铁蛋白、叶酸、抗体或抗体片段，所述阳离子脂质体是至少一种阳离子脂质和至少一种中性或辅助脂质的混合物，其中所述制品在-80°c至8°C的温度范围内保持稳定至少6个月，同时保留至少80%活性，且 其中所述制剂是从基本上由所述复合物与稳定量的蔗糖和水、稳定量的蔗糖和PBS缓冲液、稳定量的蔗糖和HEPES缓冲液、稳定量的蔗糖和TRIS缓冲液、或稳定量的蔗糖和TRIS/EDTA缓冲液组成的溶液冻干的。
2.权利要求I的用途，其中所述蔗糖以1%-50%的量存在。
3.权利要求I的用途，其中所述蔗糖以1%-20%的量存在。
4.权利要求I的用途，其中所述蔗糖以10%蔗糖的量存在。
5.权利要求I的用途，其中所述抗体片段是抗体的单链Fv片段。
6.权利要求I的用途，其中所述治疗剂选自化学治疗剂、基因、质粒DNA、蛋白质、小分子、寡核苷酸、寡脱氧核苷酸、反义寡核苷酸、miRNA、siRNA或任何小RNA分子。
7.权利要求I的用途，其中所述脂质体是至少一种阳离子脂质和至少一种中性脂质的混合物。
8.权利要求I的方法，其中所述诊断剂选自电子致密材料，磁共振显象剂或放射性制剂。
9.权利要求I的用途，其中所述靶细胞是癌细胞。
10.权利要求I的用途，其中所述靶细胞是非癌细胞。
全文摘要
一种制备稳定的细胞靶向复合物的方法，所述复合物包含一种配体及一种包囊封装有一种治疗剂或诊断剂的阳离子脂质体，所述方法包括(a)将所述复合物与一种包含稳定量的蔗糖的溶液组合及(b)冻干所得溶液以获得冻干的制品；其中在复原时所述制品保留其至少约80％的冻干前活性。
文档编号A61K9/19GK103251562SQ20131018576
公开日2013年8月21日 申请日期2004年6月4日 优先权日2003年6月4日
发明者埃斯特·H.·章, 凯瑟琳·F.·皮罗洛 申请人:乔治敦大学