一种用于治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物及其制备方法。本发明的用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，对肝脏和血液中的乙型肝炎病毒的DNA和抗原具有非常显著的抑制作用，特异性好，对肝脏、血液及其他组织的副作用小；本发明的制备方法简便易行，除可以应用在本发明的组合物的制备外，还能用于其他核酸类组合物的制备，应用范围广泛。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于乙肝药物领域，具体涉及一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组 合物及其制备方法。 -种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物及其制备 方法
【背景技术】
[0002] 据估计，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV)感染的人口约高达20亿人-世 界人口的三分之一，超过350万人会转为慢性感染。据报道，15?40%的HBV感染的患者 会发展为肝硬化，肝衰竭或肝癌（HCC)，每年有50万至120万人死于HBV感染。HBV在美国 的患病率估计为约〇. 4%。然而，自愿抽检数据表明在某些外国出生的少数族裔群体患病率 超过15%。在20世纪90年代，乙肝病毒相关的诊断门诊和住院治疗人数增加好几倍。同 样，住院总费用估计已经从1990年的3. 57亿美元增加至2003年的15亿美元，然后保持在 13亿美兀。
[0003] 中国有大约1. 2亿乙肝病毒携带者，严重困扰着人们的生活、工作和身心健康，每 年约30万人因乙肝病毒感染导致肝衰竭、肝硬化、肝癌而死亡。目前市场上的主要药物是 干扰素和核苷(酸）类药物，其共同特征是，治疗不彻底、毒性大，病毒对其易产生耐药性，对 耐药病株还没有方法可治。迫切需要一种全新的治疗方法。"爱格威"研发的成功将不但具 有巨大的经济价值，更具有巨大的科学和社会价值。
[0004] 治疗HBV的最终目标是抑制或消除HBV，缓和或停止HBV感染引起的肝损伤，防止 肝功能衰竭和肝癌的发展。最重要短期和中期治疗目标是最大限度地提高HBV DNA抑制率。 但是，彻底根除B型肝炎病毒是困难的，因为它整合到宿主基因组中，产生继续作为潜在复 发倾向的cccDNA。聚乙二醇干扰素 a -2a (PEG - IFN-α )和干扰素 a -2a (IFN-α )，核 苷类药物(拉米夫定，恩替卡韦和替比夫定）和核苷酸类似物(阿德福韦和替诺福韦）是FDA 批准的抗HBV药物市场上常用的药物。干扰素治疗的主要缺点是其显著的副作用，限制其 长期使用。它对失代偿期肝硬化与转氨酶正常患者往往是无效的。此外，只有三分之一的 患者对PEG-IFN- α抗病毒有效。虽然核苷(酸）类似物抑制HBV复制并能使肝脏坏死性炎 症减少，但不能完全根除病毒。此外，停药后，多数患者观察到病毒血症的反弹。此外，长期 治疗产生耐药HBV病毒株，导致治疗失败。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA 干扰组合物。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的 制备方法。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] -种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，其特征在于：包括下列siRNA序 列组中的一组或混合：
[0009]第一 siRNA 序列组：
[0010] 正义链一条，序列为：
[0011] 5 ' -GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdTUAUAGGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdT-3，
[0012] 反义链两条，序列均为：5' -UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3' ；
[0013] 第二 siRNA 序列组：
[0014] 正义链两条，序列均为：5' -GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdT-3'
[0015] 反义链一条，序列为：
[0016] 5, -UUGUCAACAAGAAAAACCCCGUAUAUUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3,；
[0017] 第三siRNA序列组：
[0018] 正义链一条，序列为：
[0019] 5 ' -CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdTUAUACCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3 '
[0020] 反义链两条，序列均为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3' ；
[0021] 第四siRNA序列组：
[0022] 正义链两条，序列均为：5' -CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3'
[0023] 反义链一条，序列为：
[0024] 5, -UGAAGCGAAGUGCACACGGUCUAUAUGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3,；
[0025] 第五siRNA序列组：
[0026] 正义链一条，序列为：
[0027] 5 ' -mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdTUAUUmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3，
[0028] 反义链两条，序列均为：5' -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3' ；
[0029] 第六siRNA序列组：
[0030] 正义链两条，序列均为：5' -mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3，
[0031] 反义链一条，序列为：
[0032] 5, -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUCuauaUGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3,；
[0033] 第七siRNA序列组：
[0034] 正义链一条，序列为：
[0035] 5 ' -mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdTUAUUmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3，
[0036] 反义链两条，序列均为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3' ；
[0037] 第八siRNA序列组：
[0038] 正义链两条，序列均为：5' -CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3'
[0039] 反义链一条，序列为：
[0040] 5, -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUCuauaUGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3,；
[0041] 第九siRNA序列组：
[0042] 正义链一条，序列为：
[0043] 5 ' -mGGGUUUUUCUUGUUGAmCAAdTdTUAUAmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3，
[0044] 反义链两条，序列均为：5' -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3' ；
[0045] 第十siRNA序列组：
[0046] 正义链的序列为：5' -mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3'
[0047] 反义链的序列为：5' -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3' ；
[0048] 第^-一 siRNA 序列组：
[0049] 正义链一条，序列为：
[0050] 5 ' -GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdTUAUACCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3，
[0051] 反义链两条，序列分别为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3' 和 -UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3,；
[0052] 第十二siRNA序列组：
[0053] 正义链的序列为：5' -CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3'
[0054] 反义链的序列为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3' ；
[0055] 第十三siRNA序列组：
[0056] 正义链一条，序列为：
[0057] 5 ' -mGGGUUUUUCUUGUUGAmCAAdTdTUAUAmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3，
[0058] 反义链两条，序列分别为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACG⑶C-3' 和 -UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3,；
[0059] 上述前面带有m的碱基表示2'-0-甲基化修饰的RNA碱基，dT为胸腺嘧啶脱氧核 苷，其他为RNA碱基。
[0060] 在本发明的一个优选实施方案中，还包括如下重量比的组分：
[0061] 阳离子脂质 0.5-3重量份 B1C1化合物 1-10重量份 磷脂 0-5重量份 胆固醇 0-5重量份 脂质-聚乙二醇2-24重量份；
[0062] 其中所述B1C1化合物的结构式如下：
[0063]
【权利要求】
1. 一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，其特征在于：包括下列siRNA序 列组中的一组或混合： 第一 siRNA序列组： 正义链一条，序列为： 5 ' -GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdTUAUAGGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdT-3， 反义链两条，序列均为：5' -UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3' ； 第二siRNA序列组： 正义链两条，序列均为：5' -GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdT-3' 反义链一条，序列为： 5, -UUGUCAACAAGAAAAACCCCGUAUAUUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3,； 第三siRNA序列组： 正义链一条，序列为： 5 ' -CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdTUAUACCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3， 反义链两条，序列均为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3' ； 第四siRNA序列组： 正义链两条，序列均为：5' -CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3' 反义链一条，序列为： 5, -UGAAGCGAAGUGCACACGGUCUAUAUGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3,； 第五siRNA序列组： 正义链一条，序列为： 5 ' -mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdTUAUUmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3， 反义链两条，序列均为：5' -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3' ； 第六siRNA序列组： 正义链两条，序列均为：5' -mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3' 反义链一条，序列为： 5' -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUCuauaUGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3' ； 第七siRNA序列组： 正义链一条，序列为： 5 ' -mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdTUAUUmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3， 反义链两条，序列均为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3' ； 第八siRNA序列组： 正义链两条，序列均为：5' -CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3' 反义链一条，序列为： 5' -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUCuauaUGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3' ； 第九siRNA序列组： 正义链一条，序列为： 5 ' -mGGGUUUUUCUUGUUGAmCAAdTdTUAUAmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3， 反义链两条，序列均为：5' -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3' ； 第十siRNA序列组： 正义链的序列为：5' -mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3' 反义链的序列为：5' -UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3' ； 第i^一 siRNA序列组： 正义链一条，序列为： 5 ' -GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdTUAUACCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3， 反义链两条，序列分别为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACG⑶C-3' 和 -UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3,； 第十二siRNA序列组： 正义链的序列为：5' -CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3' 反义链的序列为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3' ； 第十三siRNA序列组： 正义链一条，序列为： 5 ' -mGGGUUUUUCUUGUUGAmCAAdTdTUAUAmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3， 反义链两条，序列分别为：5' -UGAAGCGAAGUGCACACG⑶C-3' 和 -UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3,； 上述前面带有m的碱基表示2' -0-甲基化修饰的RNA碱基，dT为胸腺嘧啶脱氧核苷， 其他为RNA碱基。
2. 如权利要去1所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，其特征在于： 还包括如下重量比的组分： 阳离子脂质 0.5-3重量份 B1C1化合物 1-10重量份 磷脂 0-5重量份 胆固醇 0-5重量份 脂质-聚乙二醇2-24重量份； 其中所述B1C1化合物的结构式如下：
上述组分的重量的和与所述siRNA序列组中的一组或混合的重量比为2-10:1。
3. 如权利要求2所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，其特征在于： 所述阳离子脂质为DOTMA，所述磷脂为磷脂酰乙醇胺，所述脂质-聚乙二醇为胆固醇聚乙二 醇。
4. 一种权利要去1所述的用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法，其 特征在于：包括如下步骤： (1) 将所述siRNA序列组中的一组或混合溶解于水或含有9%蔗糖的水中，得溶液一； (2) 按重量份称取如下组分，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二： 阳离子脂质 0.5-3重量份 B1C1化合物 1-10重量份 磷脂 0-5重量份 胆固醇 0-5重量份 脂质-聚乙二醇2-24重量份 其中所述B1C1化合物的结构式如下：
(3) 将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸 发； (4) 待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液； (5) 将上述悬浮液冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组 合物。
5. 如权利要求4所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法， 其特征在于：所述阳离子脂质为D0TMA，所述磷脂为磷脂酰乙醇胺，所述脂质-聚乙二醇为 胆固醇聚乙二醇。
6. 如权利要求5所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法， 其特征在于：所述步骤（2)中的组分的重量的和与所述siRNA序列组中的一组或混合的重 量比为2-10:1，所述溶液一与溶液二的体积比为1:1-0. 2。
7. 如权利要求4所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法， 其特征在于：所述步骤（4)中，均质后的悬浮液中的颗粒大小为5-250nm。
【文档编号】A61K47/18GK104107437SQ201310231730
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】梁东, 崔坤元 申请人:厦门成坤生物技术有限公司