一种猴头菌菌丝体提取物及其在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猴头菌菌丝体提取物在制备抗肝癌药物中的应用。该提取物是将猴头菌菌丝体经两次常温闪式提取后再减压浓缩，最后真空冷冻干燥而制备出来的。该提取物具有抗肝癌的作用，可用于制备抗肝癌药物。
【专利说明】一种猴头菌菌丝体提取物及其在制备抗肝癌药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药【技术领域】，具体涉及猴头菌菌丝体提取物及其在制备抗肝癌 药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 胃肠道癌如肝癌、胃癌、结、直肠癌是最常见的癌症之一，据美国癌症学会估计约 占所有癌症的25%。胃癌在世界上发病率在癌症中位于第四位，中国有很高的发生率和死亡 率（50%的死亡病例发生在中国)，胃肠道癌的治疗包括手术、化学药物治疗、放射治疗与免 疫疗法。化学治疗是最常用的方法虽然无法彻底治疗。过去的几十年里，分子生物学的发 展在胃癌的治疗上取得了一定的进展，但药物耐受和毒性依然限制了治疗方法的进步。因 此，急需寻找和发展高效低毒新抗胃癌的新药。
[0003] 药用真菌是指能治疗疾病，具有药用价值的一类真菌，即在菌丝体、子实体、菌核 或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖及糖蛋白、甙类、生物碱、留醇类、蒽醌 类、黄酮类等多类物质，对人体有保健作用，对疾病有预防抑制或治疗作用的真菌。真菌作 为药用在我国已有2000多年的历史，早在《神农本草经》中就记载了茯苓、猪苓等真菌药 物，《本草纲目》中也收载了 20多种生物药用菌，目前我国传统作为药用及试验证实具有药 效的真菌已超过400种，主要集中在担菌亚门和子囊菌亚门。然而日常广泛应用于临床的 却仅有20余种，《中国药典》2010年版明确收录了 7种，这说明对生物药用菌的研究还很不 完善，开发空间较大。现有的研究主要集中于灵芝、虫草等少数几个品种，并且主要针对真 菌多糖作为剂型的研究及开发应用。
[0004] 随着生物科学和技术的发展，真菌、粘菌、地衣等已能从植物界中分离出来，单独 成立菌物界。除目前久负盛名的灵芝、茯苓、虫草、槐耳种类外，该界入选中药的品种还较 少，但其中高等真菌有数千种，今后无疑将会出现更多此类菌物药，潜力巨大，将会大大丰 富中药宝库。此外，以药用真菌为主体的菌物药，除传统应用子实体外，现代已发展到采用 液体(深层）发酵(应用菌球与发酵液)、固体发酵(应用菌质）等生产工艺。固体发酵产生的 普通菌质其主要药用部位仍只是它所含的菌丝体及其次生物质，但值得注意的是药用菌子 实体除自身可入药外，还可用以进行中药生物工程研究，研制成新药。而发酵工程，尤其是 我国特有的固体发酵工程，它存在的时间已有 2〇〇〇多年历史，通过长时间的固体发酵，产 生了生物代谢产物包括生物酶类物质，其生成的药用菌质比液体发酵药效好。但固体发酵 存在缺陷，容易杂菌污染，现固体发酵技术研究是国内研究热点，主要研究的方向是无菌培 养、二次培养、杂菌抑制、中药材作为营养基实施双向固体发酵技术,突破固体发酵技术的 瓶颈，实现生物药用菌的大规模产业化。
[0005] 猴头菌是一种猴头菌科蘑菇(真菌)，在中药用于治疗胃肠道疾病已经超过2000年 的历史了，一系列小分子化合物如erinacines，被认为具有神经再生，并且可以透过血脑屏 障修复受损神经组织，猴头菌还有抗溃疡，抗炎，抗微生物，免疫调节，提高肝功能，抗衰老， 降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加心脏输出、和改善备注循环等作用，包含猴头菌的 医用制剂在中国广泛使用。
[0006] 猴头菌菌丝体中的活性物质最重要的是多糖及糖蛋白，目前国内外对猴头多糖的 研究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶 血素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖 备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。《湖 南省中药材标准》2009年版，122-123页记载了猴头菌培养物，本发明所述的猴头菌菌丝体 是该标准记载的猴头菌培养物。
[0007] 当前，从高等真菌及其培养物中进行筛选和发现活性成分，应用于抗肿瘤、抗病 毒、和治疗糖尿病等，不仅成为国家重点研究新药的发展方向，也是当今世界各国开发生物 医药的热点。但是，目前并未见将猴头菌菌丝体的提取物应用于抗肝癌的报道。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种猴头菌菌丝体提取物，该猴头菌菌丝 体提取物该猴头菌菌丝体提取物在体外能杀死人肝癌ftepG2和Huh-7细胞和在体内能抑制 HepG2和Huh-7肝癌移植瘤的生长，因此可应用于制备抗结肝癌药物。
[0009] 本发明所述的猴头菌菌丝体提取物的制备方法包括如下步骤：
[0010] (1)取猴头菌菌丝体，进行第一次水常温闪式提取，提取15?25分钟，然后进行第 二次水常温闪式提取，提取10?20分钟，第一次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌 丝体重量的4?6倍，优选为5倍；第二次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体重 量的2?4倍，优选为3倍；
[0011] (2)将提取液离心后得到的上清液在55?60°C条件下减压浓缩至有沉淀析出；将 浓缩液在-60?_55°C条件下真空冷冻干燥，既得猴头菌菌丝体提取物。
[0012] 其中，所述水常温闪式提取的温度为20?50°C。步骤（2)中所述提取液离心条件 为：转速3500?4500转/分钟，离心8?15分钟。
[0013] 优选地，所述提取物的制备步骤还包括：将步骤（2)的浓缩液再用重量为该浓缩 液重量4?6倍的且体积百分比浓度为70?80%的乙醇溶解，将溶解部分在55?60°C减 压浓缩至无醇味，将所得浓缩物在-60?-55°C真空冷冻干燥。
[0014] 优选地，所述提取物的制备步骤还包括：将步骤（2)的浓缩液再用重量为该浓缩 液重量4?6倍的且体积百分比浓度为70?80%的乙醇溶解，将不溶解部分在-60?-55°C 真空冷冻干燥。
[0015] 本发明所述猴头菌菌丝体是《湖南省中药材标准》2009年版，122-123页记载的猴 头菌培养物，该猴头菌菌丝体为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum (BulLex Fr.) Pers.的菌丝体与其附生的固体培养基的干燥混合物。
[0016] 本发明常温闪式提取猴头菌菌丝体，在常温或者室温下（20-50?)，不加热，加水 动力打浆式水溶出有效成分，无温度破坏，既能溶解有效成分但又不破坏有效成分；60°C减 压浓缩，不会破坏有效成分，特别是活性酶类物质；为了不影响有关活性物质，本发明采用 了真空冷冻干燥手段。
[0017] 本发明对所得的猴头菌菌丝体提取物进行了抑制人肝癌HepG2和Huh-7细胞及动 物抗肝癌移植瘤的实验，从图1至图22和表1至表5的结果可知，该猴头菌菌丝体提取物 具有抗肝癌的作用，可用于制备抗肝癌药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1:HTJ#2对人肝癌HepG2细胞的抑制作用；浓度为〇· 3125 - 20毫克/毫升，72 小时药物处理，噻唑兰（MTT)方法测定细胞活性；
[0019]图2:HTJ#2A对人肝癌ftepG2细胞的抑制作用；浓度为0. 3125 - 20毫克/毫升，72 小时药物处理，噻唑兰（MTT)方法测定细胞活性；
[0020] 图3:HTJ#5对人肝癌HepG2细胞的抑制作用；浓度为〇· 3丨25 - 20毫克/毫升，72 小时药物处理，噻唑兰（MTT)方法测定细胞活性；
[0021] 图4:HTJ#5A对人肝癌HepG2细胞的抑制作用；浓度为〇.3125 - 20毫克/毫升，72 小时药物处理，噻唑兰（MTT)方法测定细胞活性；
[0022] 图5:HTJ#2对人肝癌Huh-7细胞的抑制作用；浓度为〇· 3丨25 - 20毫克/毫升，72 小时药物处理，噻唑兰（MTT)方法测定细胞活性；
[0023] 图6:HTJ#2A对人肝癌Huh-7细胞的抑制作用；浓度为0.3125 - 20毫克/毫升，72 小时药物处理，噻唑兰（MTT)方法测定细胞活性；
[0024] 图7:HTJ#5对人肝癌Huh-7细胞的抑制作用；浓度为〇· 3125 - 20毫克/毫升，72 小时药物处理，噻唑兰（MTT)方法测定细胞活性；
[0025] 图8:HTJ#5A对人肝癌Huh-7细胞的抑制作用；浓度为〇·3125_ 2〇毫克/毫升，72 小时药物处理，噻唑兰（ΜΤΤ)方法测定细胞活性；
[0026] 图9:图9Α为HTJ#2和五氟尿嘧啶体内对人肝癌ItepG2移植瘤的疗效分析，图9Β 为HTJ#2和五氟尿嘧啶体内对人肝癌Η印G2移植瘤的动物毒性分析；对照组，五氟尿嘧 啶（30毫克/公斤/天，5天腹腔注射），HTJ#2 (200毫克/公斤/天，5天腹腔注射），和 HTJ#2 (500毫克/公斤/天，5天口服），对荷人肝癌Η印G2移植瘤的SCID小鼠的抗瘤作用 和毒副反应。每组3只动物；
[0027] 图10: HTJ#2和五氟尿嘧啶对人肝癌Η印G2移植瘤的个体疗效；对照组，五氟尿嘧 啶（30毫克/公斤/天，腹腔注射），HTJ#2 (200毫克/公斤/天，腹腔注射），和HTJ#2 (500 毫克/公斤/天，口服），通过连续5天给药；其中，图10A为对照组，图10B为五氟尿嘧啶 (3〇毫克/公斤/天，腹腔注射），图10C为，HTJ#2 (200毫克/公斤/天，腹腔注射），图 10D为HTJ#2(500毫克/公斤/天，口服）；图中横坐标为时间(天)，纵坐标为肿瘤重量(毫 克）；
[0028] 图11:图11A为HTJ#2A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌HepG2移植瘤的疗效分析，图 11B为HTJ#2A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌HepG2移植瘤的动物毒性分析；对照组,五氟尿 嘧啶（30毫克/公斤/天，5天腹腔注射），HTJ#2A (200毫克/公斤/天，5天腹腔注射）， 和HTJ#2A (500毫克/公斤/天，5天口服），对荷人肝癌Η印G2移植瘤的SCID小鼠的抗瘤 作用和毒副反应。每组3-4只动物；
[0029] 图12:HTJ#2A和五氟尿嘧啶对人肝癌Η印G2移植瘤的个体疗效；对照组，五氟 尿嘧啶（3〇毫克/公斤/天，腹腔注射），HTJ#2A(200毫克/公斤/天，腹腔注射），和 HTJ#2A(500毫克/公斤/天，口服），通过连续5天给药；其中，图12A为对照组，图12B为 五氟尿嘧啶（30毫克/公斤/天，腹腔注射），图12C为HTJ#2A (200毫克/公斤/天，腹 腔注射），图12D为HTJ#2A(500毫克/公斤/天，口服）；图中横坐标为时间（天)，纵坐标 为肿瘤重量(毫克）；
[0030] 图13:图13A为HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌HepG2移植瘤的疗效分析； 图13B为HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌HepG2移植瘤的动物毒性；对照组，五氟尿嘧 啶（30毫克/公斤/天，5天腹腔注射），HTJ#5A (500毫克/公斤/天，5天腹腔注射），和 HTJ#5A (500毫克/公斤/天，5天口服），对荷人肝癌HepG2移植瘤的SCID小鼠的抗瘤作 用和毒副反应。每组3只动物；
[0031] 图14:HTJ#5A和五氟尿嘧啶对人肝癌HepG2移植瘤的个体疗效；对照组，五氟 尿嘧啶（30毫克/公斤/天，腹腔注射），HTJ#5A (500毫克/公斤/天，腹腔注射），和 HTJ#5A(500毫克/公斤/天，口服），通过连续5天给药；其中，图14A为对照组，图14B为 五氟尿嘧啶（30毫克/公斤/天，腹腔注射），图14C为HTJ#5A (500毫克/公斤/天，腹 腔注射），图14D为HTJ#5A(500毫克/公斤/天，口服）；图中横坐标为时间(天)，纵坐标 为肿瘤重量(毫克）；
[0032] 图15:图15A为HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌HepG2移植瘤的疗效 分析，图15B为HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌ffepG2移植瘤的动物毒性；对照 组，五氟尿嘧啶（30毫克/公斤/天，5天腹腔注射），HTJ#5 (500毫克/公斤/天，5天口 服），和HTJ#5A(500毫克/公斤/天，5天口服），对荷人肝癌HepG2移植瘤的SCID小鼠 的抗瘤作用和毒副反应。每组5只动物；
[0033] 图16:HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶对人肝癌HepG2移植瘤的个体疗效；对照组， 五氟尿嘧啶（30毫克/公斤/天，腹腔注射），HTJ#5(500毫克/公斤/天，口服），和 HTJ#5A(500毫克/公斤/天，口服），通过连续5天给药；其中，图16A为对照组，图16B为 五氟尿嘧啶（30毫克/公斤/天，腹腔注射），图16C为HTJ#5 (500毫克/公斤/天，口 服），图16D为HTJ#5A(500毫克/公斤/天，口服）；图中横坐标为时间（天)，纵坐标为肿 瘤重量(毫克）；
[0034] 图17 :图17A为HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌Η印G2移植瘤的疗效 分析，图17Β为HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌HepG2移植瘤的动物毒性分析； 对照组，五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天，5天腹腔注射），HTJ#5 (1000毫克/公斤/天，5 天口服），和HTJ#5A(1000毫克/公斤/天，5天口服），对荷人肝癌ifepG2移植瘤的SCID 小鼠的抗瘤作用和毒副反应。每组5只动物；
[0035] 图18:HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶对人肝癌ftepG2移植瘤的个体疗效；对照组， 五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天，腹腔注射），HTJ#5(1000毫克/公斤/天，口服），和 HTJ#5A(1000毫克/公斤/天，口服），通过连续5天给药；其中，图18A为对照组，图18B 为五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天，腹腔注射），图18C为HTJ#5 (1000毫克/公斤/天， 口服），图18DHTJ#5A(1000毫克/公斤/天，口服）；图中横坐标为时间（天)，纵坐标为肿 瘤重量(毫克）；
[0036] 图19:图19A为HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌Huh-7移植瘤的疗效 分析，图19B为HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌Huh-7移植瘤的动物毒性分析； 对照组，五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天，5天腹腔注射），HTJ#5 (1000毫克/公斤/天，5 天口服），和HTJ#5A(1000毫克/公斤/天，5天口服），对荷人肝癌Huh-7移植瘤的SCID 小鼠的抗瘤作用和毒副反应。每组5只动物；
[0037] 图20:HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶对人肝癌Huh-7移植瘤的个体疗效；对照组， 五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天，腹腔注射），HTJ#5 (1000毫克/公斤/天，口服），和 HTJ#5A(1000毫克/公斤/天，口服），通过连续5天给药；其中，图20A为对照组，图20B 为五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天，腹腔注射），图20C为HTJ#5 (1000毫克/公斤/天， 口服），图20DHTJ#5A(1000毫克/公斤/天，口服）；图中横坐标为时间（天)，纵坐标为肿 瘤重量(毫克）；
[0038] 图21:图21A为HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌Huh-7移植瘤的疗效 分析，图21B为HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶体内对人肝癌Huh-7移植瘤的动物毒性分析； 对照组，五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天，5天腹腔注射），HTJ#5 (1000毫克/公斤/天，5 天口服），和HTJ#5A(1000毫克/公斤/天，5天口服），对荷人肝癌Huh-7移植瘤的SCID 小鼠的抗瘤作用和毒副反应。每组5只动物；
[0039] 图22:HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶对人肝癌Huh-7移植瘤的个体疗效；对照组， 五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天，腹腔注射），HTJ#5(1000毫克/公斤/天，口服），和 HTJ#5A (1000毫克/公斤/天，口服），通过连续5天给药；其中，图22A为对照组，图22B 为五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天，腹腔注射），图22C为HTJ#5 (1000毫克/公斤/天， 口服），图22DHTJ#5A(1000毫克/公斤/天，口服）；图中横坐标为时间(天)，纵坐标为肿 瘤重量(晕克)。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
[0041] 实施例1
[0042] 一种猴头菌菌丝体提取物，其制备方法包括如下步骤：
[0043] (1)取猴头菌菌丝体，进行第一次水常温闪式提取，提取20分钟，然后进行第二次 水常温闪式提取，提取15分钟；第一次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体重量 的5倍；第二次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体重量的3倍；
[0044] (2)将上述两次提取后获得的提取液离心后得到的上清液在60°C条件下减压浓缩 至有沉淀析出得到浓缩液；将浓缩液在_60°C条件下真空冷冻干燥，即得猴头菌菌丝体提 取物。
[0045] 其中，所述水常温闪式提取的温度为30°C。步骤（2)中所述提取液离心条件为：转 速4000转/分钟，离心10分钟。
[0046] 实施例2
[0047] -种猴头菌菌丝体提取物，其制备方法包括如下步骤：
[0048] (1)取猴头菌菌丝体，进行第一次水常温闪式提取，提取20分钟，然后进行第二次 水常温闪式提取，提取15分钟；第一次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体重量 的5倍；第二次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体重量的3倍；
[0049] (2)将上述两次提取后获得的提取液离心后得到的上清液在60°C条件下减压浓缩 至有沉淀析出得到浓缩液；
[0050] (3)将步骤（2)的浓缩液再用重量为该浓缩液重量5倍的且体积百分比浓度为80% 的乙醇溶解，将溶解部分在60°C减压浓缩至无醇味，将所得浓缩物在-60°C真空冷冻干燥， 得进一步提取的猴头菌菌丝体提取物。
[0051] 其中，所述水常温闪式提取的温度为30°C。步骤（2)中所述提取液离心条件为：转 速4000转/分钟，离心10分钟。
[0052] 实施例3
[0053] 一种猴头菌菌丝体提取物，其制备方法包括如下步骤：
[0054] (1)取猴头菌菌丝体，进行第一次水常温闪式提取，提取20分钟，然后进行第二次 水常温闪式提取，提取15分钟；第一次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体重量 的5倍；第二次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体重量的3倍；
[0055] (2)将上述两次提取后获得的提取液离心后得到的上清液在60°C条件下减压浓缩 至有沉淀析出得到浓缩液；
[0056] (3)将步骤（2)的浓缩液再用重量为该浓缩液重量5倍的且体积百分比浓度为80% 的乙醇溶解，将不溶部分在-60?真空冷冻干燥，得进一步提取的猴头菌菌丝体提取物。 [0057] 其中，所述水常温闪式提取的温度为30°C。步骤（2)中所述提取液离心条件为：转 速4000转/分钟，离心10分钟。
[0058] 实施例4
[0059] 猴头菌菌丝体提取物功能鉴定试验-对人肝癌HepG2和Huh-7细胞的抑制作用
[0060] 一、材料与方法
[0061] 1、细胞和培养：人肝癌HepG2和Huh-7细胞来自美国模式培养物研究所 (American Type Culture Collection, ATCC;Manassas，VA，UAS)〇HepG2 和 Huh-7 细胞饲养 于 DMEM 培养液，含 10% 小牛血清（Atlanta Biological, Lawrenceville，GA, USA), 100 单 位/毫升的青霉素，和〇· 1微克/毫升的链霉素（Invitrogen, Grand Island, NY,USA)。细 胞于37°C、5%C02培养箱中培养。
[0062] 2、药物：由实施例1制备方法最终获得的猴头菌菌丝体提取物分成两组，分别命 名为HTJ#2和HTJ#2A，由实施例2制备方法最终获得的猴头菌菌丝体提取物命名为HTJ#5， 由实施例3制备方法最终获得的猴头菌菌丝体提取物命名为HTJ#5A，将前述猴头菌菌丝体 提取物分别溶于含〇· 1%DMS0的DMEM培养液中。
[0063] 3、药物浓度与方案：HTJ#2, HTJ#2A, HTJ#5,和 HTJ#5A 药物浓度在 〇. 3125 - 20 毫 克/毫升，连续72小时药物处理。
[0064] 4.抑制人肝癌HepG2和Huh-7细胞生长活性：72小时药物处理，细胞然后用噻唑 兰（MTT)方法测定细胞活性。
[0065] 二、实验结果
[0066] L HTJ#2, HTJ#2A，HTJ#5和HTJ#5A对人肝癌IfepG2细胞的生长抑制作用。
[0067]我们首先用十三种不同的 HTJs (#2, #2A，#2B，#4, #5, #5A，#5B, #6, #7, #8, #9, #9-1 ，和#9-2)处理体外培养的人肝癌HepG2细胞72小时后观察对肝癌细胞的体外生长抑制 作用。实验结果表明所有HTJs都能有效的抑制人肝癌ItepG2细胞的生长，其抑制作用量 效曲线(数据没有显示)。其中HTJ#2, HTJ#2A，HTJ#5和HTJ#5A的抑制作用较强（图1-4和 表1),所以我们用来作体内动物实验。图1和图2数据表明HTJ#2和HTJ#2A对人肝癌 HepG2细胞的抑制作用非常强，其半数杀伤浓度（IC5。）分别为0· 40±0. 04和0. 35±0. 02毫 克/毫升（表1)，在0. 625毫克/毫升能杀伤大于80%的HepG2细胞。HTJ#5和HTJ#5A对 HepG2细胞的抑制作用较HTJ#2和HTJ#2A弱，对ifePG2细胞的半数杀伤浓度（IC 5。）分别 为2. 50 ±0. 25和2· 00 ±0. 25毫克/毫升（表1)，HTJ#5在5. 0毫克/毫升能杀伤大于70% 的HepG2细胞，HTJ#5A在5. 0毫克/毫升能杀伤大于85%的itepG2细胞（图3和图4)。 [0068] 2. HTJ#2HTJ#2A，HTJ#5和HTJ#5A对人肝癌Huh-7细胞的生长抑制作用。
[0069]同样，我们也使用了十三种不同的 HTJs(#2，#2A, #2B，#4, #5, #5A，#5B, #6, #7, #8, # 9, #9-1，和#9-2)处理体外培养的另一种人肝癌细胞Huh-7,72小时后观察对肝癌细胞的体 外生长抑制作用。实验结果表明所有HTJs也能有效的抑制人肝癌Huh-7细胞的生长，其抑 制作用量效曲线(数据没有显示)。图5至图8和表1表明HTJ#2, HTJ#2A，HTJ#5和HTJ#5A 对Huh-7细胞的抑制作用。图1和图2数据表明HTJ#2和HTJ#2A对人肝癌Huh-7细胞的抑 制作用也非常强，其半数杀伤浓度（IC 5。）分别为0.50±0.03和0·20±0·01毫克/毫升(表 1 )，HTJ#2在1· 25毫克/毫升能杀伤大于90%的Huh-7细胞。HTJ#2A在0· 625毫克/毫升 能杀伤大于80%的HepG2细胞。同样，HTJ#5和HTJ#5A对Huh-7细胞的抑制作用较HTJ#2 和HTJ#2A弱，但比对HepG2细胞的抑制作用强，对Huh-7细胞的半数杀伤浓度（IC 5Q)分别 为0· 80±0_ 08和L 5±0· 28毫克/毫升(表1)，HTJ#5在1. 25毫克/毫升能杀伤大于70% 的Huh-7细胞，HTJ#5A在5. 0毫克/毫升能杀伤大于70%的Huh-7细胞（图7和图8)。 [0070] 实施例5
[0071] 猴头菌菌丝体提取物功能鉴定试验
[0072] 一、材料与方法
[0073] 1·动物：8 ?12 周的 SCID 雌鼠（重量 18 ~ 22g)，来自 Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, NY)并按规定饲养。
[0074] 2·药物：由实施例1或2制备方法最终获得的猴头菌菌丝体提取物，命名为 HTJ#2, HTJ#2A，HTJ#5和HTJ#5A溶于含10%DMS0的无菌生理盐水中，五氟尿嘧啶（5-FU : 5〇mg/ml)购于 Hoffmann-La Roche，Inc(Nutley，NJ)以无菌生理盐水稀释。
[0075] 3·肿瘤细胞：HepG2和Huh-7肝癌细胞。移植瘤的建立首先注射约loooooo个培 养细胞并经过数代移植。
[0076] 4·药物剂量与方案：HTJ#2 口服或注射200-500毫克/公斤/天，HTJ#2A 口服或 注射200-500毫克/公斤/天，HTJ#5 口服或注射500-1000毫克/公斤/天，HTJ#5A 口服 500-1000毫克/公斤/天，五氟尿嘧啶25-30毫克/公斤/天，腹腔注射给药，一天一次， 疗程5天。对照组口服或注射10%DMS0溶液，小鼠每 2〇g体重给予200-400 μ 1 (与实验组 相同）。每组3-5只小鼠，部分实验中，同一只鼠荷两种不同的移植瘤。
[0077] 5·用游标卡尺测量肿瘤的轴线（L表示长轴，W表示短轴)肿瘤重量按下式计算：肿 瘤重量=1/2(L X W2) (mm). (lmg=lmm3)，每天同一时间进行肿瘤测量，每周3-4次。
[0078] 6·最大耐受剂量（MTD)和毒性评价：最大耐受剂量定义为给药导致小鼠体重减轻 在20%左右，不会导致药物引起小鼠死亡的剂量。接受药物治疗后的前十天，每天测量肿瘤 和小鼠体重，然后是每两天测量一次。
[0079] 7·抗肿瘤活性：抗肿瘤活性评价指标，最大肿瘤生长抑制，以治疗组的平均肿瘤 重量和对照组的肿瘤平均重量来计算；肿瘤体积倍增时间，为肿瘤重量增长到最初重量的 两倍所需的平均时间；肿瘤部分反应（PR),当肿瘤大小减少一半(至最初的50%或以上)时； 肿瘤完全反应（CR)，当无法检测到肿瘤(肿瘤完全消失）时；治愈定义为药物治疗后至少60 天内检测不到肿瘤(达到肿瘤完全反应保持至少60天，此时一般肿瘤不会复发，动物不再 保留）。二、实验结果
[0080] 1· HTJ#2, HTJ#2A，HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶对荷HepG2人肝癌移植瘤的SCID 小鼠的抗瘤活性和动物毒性
[0081] 我们首先研究了 HTJ#2, HTJ#2A，HTJ#5A和五氟尿嘧啶对荷人肝癌移植瘤的SCID 小鼠的抗瘤效果和动物毒性。图9-14和表2的试验数据显示溶媒对照组，五氟尿嘧啶剂量 为30毫克/公斤/天(腹腔注射)，HTJ#2和HTJ#2A剂量为200毫克/公斤/天(腹腔注射)，和 500毫克/公斤/天（口服)，HTJ#5A剂量为500毫克/公斤/天(腹腔注射或口服)，每天一 次，连续5天的对荷HepG2肝癌的SCID小鼠的抗肿瘤活性和毒性。剂量的使用是根据己前 抗直结肠癌和抗头颈部癌实验剂量。试验结果表明HepG2肝癌移植瘤生长平均倍增时间为 7· 6± 1· 0天。比SW620直结肠癌和FaDu头颈部癌移植瘤生长缓慢。五氟尿嘧啶有温和的抑 制肿瘤活性，肿瘤生长抑制率为52. 7±6. 7%,肿瘤倍增时间延长至11. 3±0. 7天，并导致小 鼠平均体重下降Π %。腹腔注射HTJ#2200毫克/公斤/天，肿瘤生长抑制率为71. 1 ±2. 4%， 肿瘤倍增时间延长至18. 9 ±0. 7天，导致小鼠平均体重下降10. 3%。口服500毫克/公斤/ 天HTJ#2,与腹腔注射2〇〇毫克/公斤/天HTJ#2具有相同的抑瘤活性，肿瘤生长抑制率为 68. 6±5· 6%，肿瘤倍增时间延长至16. 8± 1.4天，导致小鼠平均体重下降10. 2%(图.9-10 和表2)。HTJ#2A的抗IfepG2瘤活性比HTJ#2差，与五氟尿嘧啶相似，数据见图11-12和表2。 结果表明腹腔注射HTJ# 2A200毫克/公斤/天，肿瘤生长抑制率为46. 2±9. 8%,肿瘤倍增时 间为12.3±0·6天，导致小鼠平均体重下降12. 4%。口服HTJ#2A500毫克/公斤/天，肿瘤 生长抑制率为52. 7±2· 1%，肿瘤倍增时间为13. 2±0. 8天，导致小鼠平均体重下降8. 3%(图 11-12和表2)。HTJ#5A的抑制肿瘤活性与HTJ#2相似，腹腔注射HTJ#5A500毫克/公斤/ 天，肿瘤生长抑制率为72. 1 ±2.0%，肿瘤倍增时间延长至16. 9±0. 4天，小鼠平均体重下降 5. 7%。口服500毫克/公斤/天HTJ#5A，与腹腔注射200毫克/公斤/天HTJ#2具有相同 的抑瘤活性，肿瘤生长抑制率为69. 3± 11. 1%，肿瘤倍增时间延长至18. 6± 1.7天，小鼠平 均体重下降8. 3% (图.13-14和表2)。
[0082] 然后，我们重复了抗肝癌HepG2移植瘤试验-溶媒对照组，五氟尿嘧啶剂量30毫 克/公斤/天(腹腔注射)，和HTJ#55〇0毫克/公斤/天（口服）并增加 HTJ#5A500毫克/ 公斤/天（口服），因为前面的试验已经知道HTJ#2，HTJ#2A和HTJ#5A的口服与注射给药途 径的抗肿瘤的效果相同，所以我们仅仅进行了 HTJ#5和HTJ#5A 口服治疗的试验。HepG2移 植瘤生长慢于上次试验，肿瘤倍增时间约10. 5±0· 9 (上次试验为7. 6±1. 0)天。五氟尿嘧 啶的抗瘤活性比上次强，肿瘤生长抑制率为71. 4±2. 2%，肿瘤倍增时间延长至17. 6±4.0 天，动物毒性也所有增加导致小鼠平均体重下降19. 6%，并且达到60%的部分反应(PR)。 HTJ#5 口服剂量500晕克/公斤/天，肿瘤抑制率为约70. 0± 23. 3%但肿瘤倍增时间比五 氟尿嘧啶长达到了约21· 0±7. 2天，并且有40%的部分反应（PR)和20%的完全反应（CR,治 愈），小鼠平均体重下降只有9. 7%。HTJ#5A 口服剂量5〇Omg/kg/天时，肿瘤抑制率更强为 77. 6± 15· 5%肿瘤倍增时间达到19. 0土6. 1天,并且有80%的部分反应（PR)，小鼠平均体重 下降只有8. 9%%(图· 15-16和表3)。
[0083] 我们还进行了第三次抗肝癌itepG2移植瘤的试验，将五氟尿嘧啶的剂量从30毫克 /公斤/天p低至25毫克/公斤/天，而将HTJ#5和HTJ#5A剂量从500毫克/公斤/天增加 到了 1〇〇〇毫克/公斤/天，以观察能否进一部增加抗肿瘤活性。数据见图17_18和表4。数据 可见，肿瘤生长快于第二次的试验而与第一次的试验相同，倍增时间为 7. 5 土 〇. 4天，25毫 克/公斤剂量的五氟尿嘧啶比30毫克/公斤剂量的抗瘤活性低，肿瘤抑制率 49. 〇土5. 7%， 肿瘤倍增时间约8· 6±0. 4天，没有取得完全反应（CR)或部分反应（PR)，同时毒性也有所降 低，小鼠平均体重降低15. 1 ±4· 5%。HTJ#5抗瘤活性比五氟尿嘧啶活性好，肿瘤抑制率为 66j 土 13· 0%，倍增时间约14· 2 ±1· 8,取得20%的部分反应（PR)，体重降低为8. 2 ±2. 6%。 提高HTJ#5的剂量（从500到1〇〇〇毫克/公斤/天）并没有提高抗瘤活性和毒性。HTj #5A 的抗瘤活性优于HTJ#5,肿瘤抑制率达70. 4± 12. 6%，肿瘤倍增时间为16. 3± 1. 6天，取得 20%的部分反应（PR)，小鼠平均体重降低为6_ 4土4. 5%。同样，HTJ#5A剂量为1〇〇〇毫克/公 斤/天时并没有比剂量为500毫克/公斤/天时有更好的抗瘤活性和毒性（图.17-18和 表4)。
[0084] 2· HTJ#5，HTJ#5A和五氟尿嘧啶对荷Huh-7人肝癌移植瘤的SCID小鼠的抗瘤活性 和动物毒性。
[0085]我们还研究了 HTJ#5 (1000毫克/公斤/天)，HTJ#5A (1000毫克/公斤/天)，和 五氟尿嘧啶（25毫克/公斤/天)对另一种肝癌移植瘤Huh-7的SCID小鼠的效果。数据见 图19-20和表5。数据表明Huh-7移植瘤倍增时间为7. 6±0. 3天，其生长速度与IfepG2移 植瘤相似或略快。虽然五氟尿嘧啶在2δ毫克/公斤/天剂量时，最初抗Huh-7瘤活性的明 显，生长抑制率为72· 1 ±3· 9 (对HepG2为49%)，但终止治疗后，肿瘤迅速生长。故没有观察 到明显的肿瘤生长延迟现象。肿瘤倍增时间为7. 8 ± 0· 4天，没有取得完全反应（CR)或部分 反应（PR),同时毒性也比3〇毫克/公斤/天低，小鼠平均体重降低15. 1±4. 5%。口服HTJ#5 和HTJ#5A在1000毫克/公斤/天时比注射五氟尿嘧啶25毫克/公斤/天，其抗Huh-7肿 瘤活性更强，生长抑制率分别为 8〇· 4±1· 9和87· 6±5· 0,特别是肿瘤生长倍增时间分别达 到14. 2±1_6和15. 2±1.5天（P<0.01)。并分别取得40%和60%的部分反应（PR)，小鼠平 均体重降低分别为8· 2 ±2. 6%和6. 4±4. 5%。与HepG2移植瘤比较，Huh-7肝癌移植瘤对五 氟尿嘧啶，HTJ#5,和HTJ#5A的初始反应更明显但疗效难以持久。
[0086]然后，我们重复了抗肝癌Huh-7移植瘤试验-溶媒对照组，保持HTJ#5和HTJ#5A剂 量在1000毫克/公斤/天（口服），并增加五氟尿嘧啶剂量至3〇毫克/公斤/天(腹腔注 射)。试验结果数据见图21-22和表6。结果表明Huh-7移植瘤生长快于上次试验，肿瘤倍增 时间约6· 4±0· 3(上次试验为7. 6±0· 3)天。五氟尿嘧啶在3〇毫克/公斤/天的抗Huh-7 移植瘤活性与25毫克/公斤/天相似，个体差异大，肿瘤生长抑制率为67. 6 ±20. 5%，肿 瘤倍增时间延比25毫克/公斤/天长，至8· 9±0. 6天，但没有取得完全反应（CR)或部分 反应（PR)，动物毒性也所有增加，小鼠平均体重下降19. 6±2· 7%。HTJ#5和HTJ#5A的抗瘤 疗效与上次试验相似，肿瘤抑制率分别为79. 3± Π . 0%和75· 2±6. 2%，肿瘤倍增时间分别 为14. 6±0· 9和14. 2±0· 7天，并且分别取得60%和40%的部分反应（PR)，小鼠平均体重 下降只有 5. 9±5· 2% 和 5. 5±2. 8%(图.21-22 和表 6)。
[0087] 结论
[0088] 1. HTJ#2, HTJ#2A, HTJ#5和HTJ#5A在体外对人肝癌HepG2细胞有明显的抑制作 用。
[0089] 2. HTJ#2, HTJ#2A，HTJ#5和HTJ#5A在体外对人肝癌Huh-7细胞有明显的抑制作 用。
[0090] 3· · HTJ#2, HTJ#2A，HTJ#5, HTJ#5A和五氟尿嘧啶在体内对人癌肝HepG2移植瘤有 一定的抗瘤疗效,HTJ#2, HTJ#5,和HTJ#5A比五氟尿嘧啶的抗瘤活性更强，HTJ#2A的抗瘤活 性比HTJ#2, HTJ#5,和HTJ#5A差，与五氟尿嘧啶的抗瘤活性相似。
[0091] 4.五氟尿嘧啶在30毫克/公斤/天比25毫克/公斤/天对癌肝HepG2移植瘤的 抗瘤活性好。
[0092] 5. 口服 HTJ#2, HTJ#2A 和 HTJ#5A 与腹腔注射 HTJ#2, HTJ#2A 和 HTJ#A5 对人癌肝 HepG2移植瘤具有相同的抗瘤活性。
[0093] 6. 口服500毫克/公斤/天HTJ#5和HTJ#5A与口服1000毫克/公斤/天对癌肝 IfepG2移植瘤具有相同的抗瘤活性。
[0094] 7.虽然五氟尿嘧啶在25-30毫克/公斤/天，最初抗Huh-7瘤活性的明显，生长抑 制率大于为70%，但终止治疗后，肿瘤迅速生长，故没有观察到明显的肿瘤生长延迟现象。 [0095] 8. HTJ#5和HTJ#5A的抗Huh-7肿瘤移植瘤的疗效比五氟尿嘧啶好，肿瘤生长明显 延迟。
[0096] 表1:总结HTJ#2, HTJ#2A，HTJ#5和HTJ#5A对Η印G2和Huh-7人肝癌细胞的半数 杀伤浓度（IC50)
[0097]
【权利要求】
1. 一种猴头菌菌丝体提取物在制备抗肝癌药物中的应用；所述猴头菌菌丝体提取物 的制备包括如下步骤： (1) 取猴头菌菌丝体，进行第一次水常温闪式提取，提取15?25分钟，然后进行第二次 水常温闪式提取，提取10?20分钟；第一次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体 重量的4?6倍；第二次水常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体重量的2?4倍； (2) 将上述两次提取后获得的提取液离心后得到的上清液在55?60°C条件下减压浓 缩至有沉淀析出得到浓缩液；将浓缩液在-60?_55°C条件下真空冷冻干燥，即得猴头菌菌 丝体提取物。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，猴头菌菌丝体提取物制备方法中第一次水 常温闪式提取中，水的重量为猴头菌菌丝体重量的5倍；第二次水常温闪式提取中，水的重 量为猴头菌菌丝体重量的3倍。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，猴头菌菌丝体提取物制备方法中水常温闪 式提取的温度为20?50°C。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，猴头菌菌丝体提取物制备方法的步骤（2)中 所述提取液离心条件为：转速3500?4500转/分钟，离心8?15分钟。
5. 如权利要求1至4之一所述的应用，其特征在于，猴头菌菌丝体提取物制备方法 的步骤还包括：将步骤（2)的浓缩液再用重量为该浓缩液重量4?6倍的且体积百分比 浓度为70?80%的乙醇溶解，将溶解部分在55?60°C减压浓缩至无醇味，将所得浓缩物 在-60?-55 °C真空冷冻干燥。
6. 如权利要求1至4之一所述的应用，其特征在于，猴头菌菌丝体提取物制备方法的步 骤还包括：将步骤（2)的浓缩液再用重量为该浓缩液重量4?6倍的且体积百分比浓度为 70?80%的乙醇溶解，将不溶解部分在-60?-55°C真空冷冻干燥。
【文档编号】A61P35/00GK104248647SQ201310257032
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月25日 优先权日:2013年6月25日
【发明者】何述金, 常耀台, 曹寿松 申请人:湖南新汇制药股份有限公司