以银杏落叶为原料的银杏叶精制提取物及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种以银杏落叶为原料的银杏叶精制提取物及其制备方法，本发明以银杏落叶为原料，加入乙醇回流提取，合并提取液，滤过，浓缩，加水溶散，过滤，滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用90%~95%乙醇解吸，收集90%~95%乙醇洗脱液，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用70%~75%甲醇解吸，收集70%~75%甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得含有30%~45%总黄酮和7%~15%总内酯的精制提取物。本发明以废弃的银杏落叶为提取原料，变废为宝，通过优选工艺制得含有总黄酮和总内酯活性成分高的精制提取物，具有很好的抗氧化，抗血小板聚集及其神经元细胞保护作用，且不良反应低，可作为防治心脑血管疾病的药物与保健食品的主要原料，具有重要的经济效应和环境保护作用。
【专利说明】以银杏落叶为原料的银杏叶精制提取物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种药用植物废弃组织的开发利用，具体涉及一种银杏落叶的精制提取物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]银杏叶为银杏科植物银杏GinkgobilobaL.的干燥叶。银杏叶主要含有黄酮类和银杏内酯类活性物质，其提取物及其制剂在临床上广泛用于治疗冠心病、高血压、脑梗死、痴呆、哮喘、乙型肝炎、糖尿病等疾病。我国银杏资源十分丰富，其有效成分既是贵重的医药原料，又可用于生产保健食品。银杏叶精制提取物主要来源于4~7年树龄的银杏叶，其它树龄的银杏尤其是果用银杏的叶，由于银杏黄酮与内酯类成分含量偏低而不被采集利用，每到11月成为落叶而成为废弃物。据初略统计，全国每年约有7500吨的银杏落叶被废弃，造成了极大的资源浪费和环境污染。国内报道有四项项关于银杏落叶的专利，中国专利CN1066595公开了应用银杏落叶提取药用冠心酮，经临床短期使用，对高血压脑血栓等一些慢性病疗效可观；中国专利CN102876721A公开了一种快速高效破坏银杏落叶纤维结构的方法，该发明得到的反应终产物即银杏落叶去纤维结构可用于细胞扩大培养或作为工业发酵的底物，解决了现有工艺处置反应条件要求高，转化率低等技术问题；另外两项分别使用银杏落叶制成有机生物肥以及食用菌培养料。CN102030590A以植物废弃物(银杏落叶等)为原料，发酵后制成有机生物肥料，药肥合一，防治病菌；CN102265753A将银杏落叶等与营养物质和水混合，制成食用菌培养料，合理解决了当前园林绿化的废弃物处理问题。但是均未报道同时提取出总黄酮和总内酯含量高，白果酸等毒副成分含量少，药理活性强并接近银杏标准提取物及其制备技术与方法。
[0003]因此，为了充分利用好银杏落叶资源，减少环境污染，很有必要以银杏落叶为原料设计研发一种总黄酮和总内 酯含量高，杂质少，不良反应低，药理活性强的银杏叶精制提取物。
【发明内容】
[0004]发明目的:本发明的目的是解决现有技术的不足，经过大量实验筛选，充分利用银杏落叶资源，以银杏落叶为原料，采用现代提取分离方法，精制得到总黄酮和总内酯含量高，杂质少，不良反应低，药理活性强的银杏叶精制提取物，本发明另一个目的在于提供银杏叶精制提取物的制备方法和其应用，对资源综合利用和环境保护具有重要的意义。
[0005]技术方案:为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为:
[0006]一种银杏叶精制提取物，它通过以下方法制备得到:
[0007]取银杏落叶，粉碎，加入7至10倍量浓度为70%至85%的乙醇回流提取2至3次，每次2至3小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用浓度为90%~95%乙醇解吸，收集90%~95%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用浓度为70%~75%甲醇解吸，收集70%~75%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到含有30%~35%重量百分比的总黄酮和7%~8%重量百分比的总内酯。
[0008]作为优选方案，以上所述的银杏叶精制提取物，它通过以下方法制备得到:
[0009]取银杏落叶，粉碎，加入7倍量浓度为70%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用浓度为95%乙醇解吸，收集95%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用浓度为70%甲醇解吸，收集70%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到含有30%~35%重量百分比的总黄酮和7%~8%重量百分比的总内酯；
[0010]所述的总黄酮包括槲皮素、山奈酚和异鼠李素；所述的总内酯包括银杏内酯、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B。
[0011]本发明根据银杏落叶中的化学成分及其理化性质，通过大量实验优选提取制备方法和精制工艺(筛选了提取溶剂及其浓度，树脂柱类型及其树脂连用方式)，实验结果表明，本发明采用70%乙醇提取一AB-8大孔树脂柱吸附一聚酰胺柱吸附，并采用优选的浓度的乙醇洗脱液洗脱，制备得到的总黄酮重量百分比可达30%~45%，总内酯重量百分比可达7%~15%;并且未检测到白果酸等毒副性成分，药理实验结果表明，活性强且广泛，取得了很好的技术效果。
[0012]本发明提供的银杏叶精制提取物的制备方法，包括以下步骤:
[0013](I)取银杏落叶，粉碎，加入7至10倍量浓度为70%至85%的乙醇回流提取2至3次，每次2至3小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，得滤液；
[0014](2)取步骤(I)制备得到的滤液上AB-8大孔树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用浓度为90%~95%乙醇解吸，收集90%~95%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用浓度为70%~75%甲醇解吸，收集70%~75%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到含有30%~35%重量百分比的总黄酮和7%~8%重量百分比的总内酯。本发明根据银杏落叶中的化学成分及其理化性质，通过大量实验优选提取制备方法和精制工艺。
[0015]本发明通过对不同极性和不同型号树脂进行吸附和纯化能力的筛选，确定型号为AB-8型的大孔吸附树脂吸附和纯化效果最佳，同时本发明对50%至95%不同浓度乙醇的洗脱能力进行了优选，以总黄酮和总内酯含量作为指标，确定浓度为90%至95%的乙醇的洗脱物中总黄酮和总内酯有效成分含量高，且杂质少，因此确定浓度90%至95%的乙醇为梯度洗脱溶剂；作为进一步的优选方案，通过AB-8型的大孔吸附树脂吸附纯化后，本发明又优选聚酰胺柱与AB-8型的大孔吸附树脂连用，再次进行纯化精制，本发明筛选了浓度为50%~90%甲醇，乙醇等洗脱液，以总黄酮和总内酯含量作为指标，确定浓度为70%~75%甲醇作为洗脱液，活性成分含量高，杂质少，活性最强。因此，本发明收集浓度70%至75%的甲醇洗脱液。
[0016]本发明所述的银杏叶精制提取物，所述的总黄酮测定的色谱条件为:
[0017]本发明根据银杏叶精制提取物的化学成分及其理化性质，通过大量实验筛选总黄酮检测控制方法，Waters2695高效液相色谱仪:四元泵，在线脱气，柱温箱，自动进样器，Waters2998DAD检测器，色谱柱:反相C18柱(优选KromasilC18coIumn,200mm X 4.6mm, 5 μ m);流动相:体积比为50:50的甲醇和浓度0.4%磷酸溶液，检测波长:360nm;流速:1.0mL ;柱温:30°C;进样量:10 μ I。能够同时检测到槲皮苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素、木犀草素、芹菜素等黄酮成分。通过该方法可以快速准确的检测银杏叶精制提取物中的黄酮类成分，对控制银杏叶精制提取物的质量具有重要意义。
[0018]本发明所述的银杏叶精制提取物，所述的总内酯测定的色谱条件为:
[0019]本发明根据银杏叶精制提取物的化学成分及其理化性质，通过大量实验筛选总内酯检测控制方法，WatersACQUITYUPLC系统:四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器；XevoTQ检测器，银杏内酯质谱条件离子源:ES1-源；扫描方式:多反应监测方式；毛细管电压:3.0kV ;离子源温度:150°C ;脱溶剂气温度:550°C ;脱溶剂气流量:1000L ;锥孔气流量:50L.h-1 ;碰撞气流量:0.15mL.min—1 ;取样锥孔电压18伏至35伏，碰撞能量14eV至25eV0
[0020]其中银杏内酯C、白果内酯、银杏内酯A和银杏内酯B的主要质谱检测参数如表1所示:
[0021]表1 4种萜内酯成分的主要质谱检测参数
【权利要求】
1.一种银杏叶精制提取物，其特征在于，它通过以下方法制备得到: 取银杏落叶，粉碎，加入7至10倍量浓度为70%至85%的乙醇回流提取2至3次，每次2至3小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用浓度为90%~95%乙醇解吸，收集90%~95%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用浓度为70%~75%甲醇解吸，收集70%~75%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到含有30%~45%重量百分比的总黄酮和7%~15%重量百分比的总内酯。
2.根据权利要求1所述的银杏叶精制提取物，其特征在于，它通过以下方法制备得到: 取银杏落叶，粉碎，加入7倍量浓度为70%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用浓度为95%乙醇解吸，收集95%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用浓度为70%甲醇解吸，收集70%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到含有30%~45%重量百分比的总黄酮和7%~15%重量百分比的总内酯； 所述的总黄酮包括槲皮素、山奈酚和异鼠李素；所述的总内酯包括银杏内酯、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B。
3.权利要求1所述的银杏叶精制提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取银杏落叶，粉碎，加入7至10倍量浓度为70%至85%的乙醇回流提取2至3次，每次2至3小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，得滤液； (2)取步骤(I)制备得到的滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用浓度为90%~95%乙醇解吸，收集90%~95%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用浓度为70%~75%甲醇解吸 ，收集70%~75%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到含有30%~45%重量百分比的总黄酮和7%~15%重量百分比的总内酯。
4.权利要求2所述的银杏叶精制提取物，其特征在于，所述的总黄酮测定的色谱条件为: Waters2695高效液相色谱仪:四元泵，在线脱气，柱温箱，自动进样器，Waters2998DAD检测器，色谱柱:反相C18柱；流动相:体积比为50:50的甲醇和浓度0.4%磷酸溶液，检测波长:360nm ;流速:1.0mL ;柱温:30°C ;进样量:10μ I。
5.权利要求2所述的银杏叶精制提取物，其特征在于，所述的总内酯测定的色谱条件为: WatersACQUITYUPLC系统:四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器；Xev0TQ检测器，银杏内酯质谱条件离子源=ES1-源；扫描方式:多反应监测方式；毛细管电压:3.0kV ；离子源温度:150°C ;脱溶剂气温度:550°C ;脱溶剂气流量:1000L.IT1 ;锥孔气流量:50L.h—1 ;碰撞气流量:0.15mL.mirT1 ;取样锥孔电压18伏至35伏，碰撞能量14eV至25eV。
6.权利要求1至2所述的银杏叶精制提取物在制备抗血栓性疾病药物中的应用。
7.权利要求1至2所述的银杏叶精制提取物在制备抗氧化、抗衰老药物或保健品中的应用。
8.权利要求1至2所述的银杏叶精制提取物在制备神经系统保护药物中的应用。
【文档编号】A61K127/00GK103463145SQ201310336439
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月5日 优先权日:2013年8月5日
【发明者】唐于平, 姚鑫, 段金廒, 钱大玮, 宿树兰 申请人:南京中医药大学