β-肾上腺素受体biased拮抗剂在制药中的用途
【专利摘要】本发明涉及中枢神经系统药物领域，具体涉及β-肾上腺素受体biased拮抗剂在制药中的用途。尤其涉及β-肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛：carvedilol和阿普洛尔：alprenolol在制备促进中枢神经系统学习记忆的药物中的用途。本发明经新物体辨别和条件性恐惧记忆的两种不同小鼠记忆模型试验，结果证实β-肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛或阿普洛尔能提高小鼠条件性恐惧记忆的再巩固并对新物体辨别记忆的再巩固无明显影响，而β-肾上腺素受体非biased拮抗剂如普奈洛尔和倍他洛儿，却抑制小鼠条件性恐惧记忆和物体辨别记忆的再巩固。本发明的β-肾上腺素受体biased拮抗剂可制备进神中枢神经系统学习记忆的药物。
【专利说明】卩-肾上腺素受体biased括抗剂在制药中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中枢神经系统药物领域，涉及3 _肾上腺素受体biased拮抗剂在制药 中的用途。尤其涉及￠-肾上腺素受体biased拮抗剂(例如卡维地洛：carvedilol和阿普 洛尔：alprenolol)在制备促进中枢神经系统学习记忆的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 目前对脑高级功能之一的记忆的研究是神经科学领域的前沿热点，也是当今自然 科学领域的25个重大难题之一，尤其对于负责学习记忆的神经系统是如何存储和管理外 界大量信息的研究一直是神经科学的一个重要挑战。因此，对于记忆各个层面的研究，对于 理解神经系统重大脑疾病如老年痴呆，创伤后应激综合症等的发病机制和临床治疗是尤为 重要的。
[0003] 研究显示，通常记忆大致分为如下阶段：记忆的获得（memory encoding)， 巩固（consolidation)，记忆信息的读取（也叫记忆的再激活retrieval),再巩固 (reconsolidation)。记忆的巩固理论最初由Muller和Pilzecker在1900年提出，近年 来Dudai提出较为具体和详细的巩固假说：当大脑获得外界信息即刻形成瞬时记忆或短时 记忆，此时的短时记忆不稳定易丢失，只有当短时程记忆转化为长时程记忆，信息才能被强 化、整合、重组，系统性存储于一些特定脑区，最后变得稳固。若记忆信息被读取后，记忆将 再次经历重新稳定的过程，称之为记忆再巩固。之前的研究认为记忆一旦被巩固下来后，其 强度不再变化，并且不易被破坏。然而有研究发现记忆被巩固后并非一直处于休眠状态或 者保持固定不变的强度。1968年Misanin等人认为已形成的记忆被再激活后，记忆将重新 进入不稳定状态。2000年Nader等人再次提出并证明对记忆再巩固的破坏将导致记忆的 丢失或记忆的过度强化。因此，业界认为，即使被巩固的记忆其强度和框架仍然会发生改 变。在相似经历的诱导下，巩固的记忆被再次激活，原先稳定的记忆变得脆弱易变，在此过 程中，记忆能被修改，擦除，或得到强化。因此，记忆再巩固并非是记忆的终点，而是记忆巩 固的延续，并且能及时对原先的记忆框架的进行修改，更新或增强。但是目前记忆再巩固的 研究处于假说提出和机制探索阶段，整个理论体系尚不完善，并且参与调控的神经环路及 分子基础十分不清楚。此外，大量研究表明早老性痴呆患者或转基因动物的长时程记忆有 明显损伤，包括了记忆再巩固过程；而创伤后应激综合征的患者表现为记忆再巩固的过度 强化。因此对于促进或干预记忆再巩固的药物研究具有重要临床意义和应用价值。
[0004] 研究报道，G蛋白偶联受体被认为是一类最大的细胞膜表面受体超家族，例如 3 -肾上腺素受体，多巴胺能受体，代谢型谷氨酸受体等。这类受体通过偶联其下游的鸟 嘌呤核苷酸结合蛋白质（G蛋白），产生第二信使，如环磷酸腺苷（cAMP)、磷酸肌醇等，转导 了包括神经递质，激素，气味，痛觉，嗅觉等多种化学和物理的细胞外信号，产生多种生物 学效应。P -arrestin是G蛋白偶联受体下游的负性调控因子，当G蛋白偶联受体被激活 后，其下游的G蛋白偶联受体依赖的信号通路被激活，同时发生受体的磷酸化修饰，招募 3-arrestin，进而引起该受体与G蛋白的解偶联和0-arrestin介导的受体内吞，G蛋白 偶联受体依赖的信号通路被终止。然而最近研究发现当G蛋白偶联受体在一些配体刺激 下，能激活P-arrestin依赖的，S卩非G蛋白依赖的信号通路，而对于G蛋白依赖的信号通 路这一经典途径确无明显激活作用。该类受体的配体被称之为biased拮抗剂。如临床用 于治疗充血性心力衰竭￠-肾上腺素受体拮抗剂卡维地洛和用于治疗心绞痛的阿普洛尔， 能抑制该受体下游G蛋白依赖的cAMP信号通路的激活，并选择性激活下游P-arrestin 依赖的ERK信号通路的激活。然而大量的0-arrestin biased信号通路激活的生理功 能尚不清楚，尤其在神经系统内是否发挥作用则完全不清楚。鉴于我们的前期研究发现 3 -arrestin2通过对PKA活性进行严密的负性调控，参与调控条件性恐惧记忆巩固的形成 和杏仁核突触可塑性的长时程增强；而3 -arrestin2对学习记忆的调控和影响还远未清 楚；更为重要的是biased拮抗剂在学习和记忆中的作用尚未有研究；基于前期研究结果， 本申请的发明人拟提供3 _肾上腺素受体biased拮抗剂在制物中的新用途，从而进一步为 临床治疗老年痴呆和预防创伤后应激综合症提供药物靶点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是￠-肾上腺素受体biased拮抗剂在制药中的新用途，尤其 是￠-肾上腺素受体biased拮抗剂在制备促进中枢神经系统学习记忆的药物中的用 途。本发明中优选P _肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛：carvedilol或阿普洛尔： alprenolol〇
[0006] 本发明确立了 P _肾上腺素受体biased拮抗剂(如卡维地洛或阿普洛尔等）在促 进中枢神经系统学习记忆中的新用途。
[0007] 本发明中，选用新物体辨别和条件性恐惧记忆的两种不同小鼠记忆模型，采用 肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛和阿普洛尔进行侧脑室给药，分别进行陈述 性记忆和情感性记忆再巩固形成的测试，确定3 -肾上腺素受体及其下游3-arrestin 依赖的信号通路的激活在学习记忆中的作用，如卡维地洛（carvedilol)或阿普洛尔 (alprenolol)能提高小鼠条件性恐惧记忆的再巩固并对新物体辨别记忆的再巩固无明 显影响，而P -肾上腺素受体非biased拮抗剂如普奈洛尔（propranolol)和倍他洛儿 (betaxolol)，却能抑制小鼠条件性恐惧记忆和物体辨别记忆的再巩固。本发明的实验结果 表明，￠-肾上腺素受体biased拮抗剂具有促进学习记忆的功能，进一步为临床治疗老年 痴呆和预防创伤后应激综合症提供药物靶点。
[0008] 更具体的，本发明采用￠-肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛和阿普洛尔，进 行了动物水平的实验，以小鼠的条件性恐惧记忆和新物体辨别性记忆为动物模型，观察并 检测了 3 _肾上腺素受体biased拮抗剂侧脑室给药对学习记忆的影响，结果显示，在条件 性恐惧记忆再次激活后脑内给予3 _肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛或阿普洛尔能 显著增强小鼠对条件性恐惧记忆的再巩固，而3 _肾上腺素受体非biased拮抗剂普奈洛尔 和倍他洛尔却显著抑制小鼠恐惧记忆的再巩固；在新物体辨别实验中，卡维地洛或阿普洛 尔对小鼠物体辨别记忆的再巩固无明显影响，而普奈洛尔和倍他洛尔却显著抑制小鼠物体 辨别记忆的再巩固；结果证实了 ￠-肾上腺素受体biased拮抗剂具有明确促进记忆再巩固 的作用，为其作为一种新型￠-肾上腺素受体biased拮抗剂在中枢神经系统的功能研究及 其新临床应用提供了较完整的实验依据。
[0009] 本发明通过下述方法和步骤进行了动物水平的实验，
[0010] (1)建立小鼠条件性恐惧记忆的动物模型；
[0011] (2)小鼠条件性恐惧记忆的视频分析；
[0012] ( 3)建立小鼠新物体辨别记忆的动物模型；
[0013] (4)小鼠新物体辨别记忆的视频分析；
[0014] ( 5 )小鼠侧脑室埋管手术；
[0015] (6)小鼠侧脑室显微注射。
[0016] 对于卡维地洛和阿普洛尔对学习记忆的作用，通过建立条件性恐惧记忆和新物体 辨别记忆的两种不同小鼠记忆模型，得到以下结果：
[0017] I. P -肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛能显著增强小鼠条件性恐惧记忆的 再巩固。
[0018] 2. P -肾上腺素受体biased拮抗剂阿普洛尔能显著增强小鼠条件性恐惧记忆的 再巩固。
[0019] 3. P -肾上腺素受体拮抗剂普奈洛尔能显著抑制小鼠条件性恐惧记忆的再巩固。
[0020] 4.选择性P 1-肾上腺素受体拮抗剂倍他洛尔能显著抑制小鼠条件性恐惧记忆的 再巩固。
[0021] 5. P -肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛和阿普洛尔对小鼠物体辨别记忆的 再巩固无明显影响，而普奈洛尔和倍他洛尔能抑制小鼠的物体辨别记忆的再巩固。
[0022] 本发明的P _肾上腺素受体biased拮抗剂可进一步制备促进中枢神经系统学习 记忆的药物；所述的3 _肾上腺素受体biased拮抗剂可选子卡维地洛：carvedilol和阿普 洛尔：alprenolol。
[0023] 本发明中，所述药物可以粉剂形式使用。
[0024] 本发明中，所述药物可以无菌注射剂或滴注液形式使用。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 卡维地洛和阿普洛尔已经成为临床第三代P _肾上腺素受体拮抗剂用药，副作用 较小，安全系数较高，主要用于心血管和呼吸系统疾病的治疗。本发明经实验证实该类药物 有明确的促进记忆的功能，能对中枢神经系统产生保护作用；而第一代￠-肾上腺素受体 拮抗剂普奈洛尔和第二代选择性3 1-肾上腺素受体拮抗剂倍他洛尔对记忆有显著的抑制 作用，在临床治疗时能产生神经系统副作用；而卡维地洛和阿普洛尔不仅能替代成为新一 代心血管药物并减少神经系统副作用，还能独立用于制成治疗由于血管性因素、神经退行 性变和精神障碍造成的记忆损伤和痴呆的药物制剂。
【专利附图】
【附图说明】：
[0027] 图1 :记忆再提取后给予生理盐水对条件性恐惧记忆再巩固的影响，
[0028] 其中，实验小组为生理盐水处理的对照组；每只小鼠处理前后自身对照比较。
[0029] 图2 :记忆再提取后给予卡维地洛对条件性恐惧记忆再巩固的影响，
[0030] 其中，小鼠僵直不动时间所占百分比越高，表明环境线索诱导的恐惧记忆力强，卡 维地洛侧脑室注射（10 U g/只)后24小时的僵住时间显著高于该小鼠给药前的环境线索诱 导的僵住时间，*P〈〇. 05。
[0031] 图3 :记忆再提取后给予阿普洛尔对条件性恐惧记忆再巩固的影响，
[0032] 其中，阿普洛尔侧脑室注射（IOii g/只）后24小时的僵住时间显著高于该小鼠给 药前的环境线索诱导的僵住时间，*P〈〇. 05。
[0033] 图4 :记忆再提取后给予普奈洛尔对条件性恐惧记忆再巩固的影响，
[0034] 其中，小鼠僵住不动时间所占百分比越低，表明环境线索诱导的恐惧记忆力弱，普 奈洛尔腹腔注射（l〇mg/kg)后24小时的僵住时间显低于该小鼠给药前的环境线索诱导的 僵住时间，*P〈〇. 05。
[0035] 图5 :记忆再提取后给予倍他洛尔对条件性恐惧记忆再巩固的影响，
[0036] 其中，倍他洛尔腹腔注射（lmg/kg)后24小时的僵住时间显低于该小鼠给药前的 环境线索诱导的僵住时间，*P〈〇. 05。
[0037] 图6 : P -肾上腺素受体biased拮抗剂对条件性恐惧记忆再巩固的影响，
[0038] 其中，卡维地洛和阿普洛尔能增加小鼠环境诱导的僵住时间，而普奈洛尔和倍他 洛尔的作用与之相反，*P〈〇. 05。
[0039] 图7 : P -肾上腺素受体biased拮抗剂对物体辨别记忆再巩固的影响，
[0040] 其中，卡维地洛和阿普洛尔在记忆再提取后侧脑室注射（ioy g/只)，两者对给药 处理24小时后小鼠对新物体探求时间的增加无明显影响；普奈洛尔（10mg/kg)和倍他洛尔 (lmg/kg)在记忆再提取后腹腔注射能明显抑制24小时后小鼠对新物体的探求，同时能抑 制卡维地洛或阿普洛尔组小鼠对新物体的探求，*P〈〇. 05。
【具体实施方式】
[0041] 实施例1
[0042] 1、实验材料和方法
[0043] I. 1实验动物与分组
[0044] 清洁级成年雄性C57/BL6鼠（由中科院动物中心提供)，8-10周龄，25-28g，术前动 物在本实验室动物房饲养2?3天，自由饮食，室温20-22°C，湿度55±5%，12小时昼夜颠 倒，动物适应环境一周后开始实验。将小鼠随机分为对照组、卡维地洛组（l〇y g/只，侧脑 室给药)、阿普洛尔组（10 U g/只，侧脑室给药)，普奈洛尔（l〇mg/kg，腹腔注射）和倍他洛尔 (lmg/kg，腹腔注射)，每组11-18只行记忆能力测评。
[0045] 1. 2模型制备
[0046] 物体辨别行为学模型：物体辨别行为是建立在小鼠对新物体存在自发和内在的探 求性和好奇心这一特点而设计的；。对新物体探求的偏好则反映了小鼠对旧物体已经存在 较为牢固的记忆；将小鼠每次对每个物体的探求时间记录下来，计算小鼠对物体的偏爱指 数，公式分别为训练阶段：TB/ (TA+TB)，测试阶段：TC/ (TA+TC);训练后24小时再次暴露 于旧物体，作为一次记忆的再激活，分别于记忆再激活后不同时间点进行新物体辨别的测 试，观察小鼠在记忆再激活后短时程记忆和长时程记忆的形成；小鼠在开始训练程序前，须 清理操作箱和物体，排除上一只小鼠实验中残留的气味和排泄物的影响；
[0047] 条件性恐惧记忆模型：美国MedAssociates公司生产的操作箱和操作分析软件， 操作箱型号为MED-0FA-MS，四壁和顶部为透明有机玻璃板所制；前壁为红外摄像头拍摄小 鼠的活动情况，底部为32根电栅栏，间隔0. 85厘米，于电刺激器相连，扬声器置于操作箱内 进行声音刺激，电刺激器、扬声器和摄像头连接电脑，刺激强度和声音强度均有电脑控制， 在训练之前一天先将小鼠放入操作相适应5分钟，训练当天将小鼠放入操作箱内2分钟后 给予一个2800Hz/85dB的噪声，历时30秒，作为条件刺激（CS);在声音刺激的最后1秒钟给 予一个I. OmA的足底电击，历时1秒，作为非条件刺激（US)，CS+US为一次联合性学习记忆 的训练，分别在1天后将小鼠放入一个和电击环境一样的操作箱，3分钟，而不给足底电击， 观察在此3分钟内小鼠僵住不动的时间，并作为一次记忆的再提取；之后立刻药物处理，24 小时后再次暴露于该电击环境，观察药物对条件性恐惧记忆再巩固的影响，实验要求小鼠 在开始训练程序前，须清理操作箱，排除上一只小鼠实验中残留的气味和排泄物的影响；
[0048] 1. 3小鼠脑立体定位：水合氯醛（10%)腹腔注射，麻醉后的小鼠用小鼠适配器固 定于脑立体定位仪（Stolting)，根据图谱分别确定侧脑室的位置，并埋入外套管（26GA， PlasticOne, Inc)，术后恢复2周后进行行为学测试和其他实验。；
[0049] 1. 4侧脑室定量纤维注射系统：药物以I iil/min的速度，由给药泵（BAS，Inc)匀 速推注入小鼠侧脑室，留针5分钟后拔针；
[0050] 1. 5数据处理及统计分析
[0051] 利用SPSS16. 0统计软件分析处理数据，以均数土标准误（表示。单因数 方差分析（one way AN0VA)比较各组之间的差异，两两比较用Tukey法，P〈0. 05为显著性 界值；
[0052] 2、结果显示
[0053] P -肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛和阿普洛尔能促进小鼠条件性恐惧记 忆的再巩固，
[0054] 由图1所示，记忆再提取后给予生理盐水对条件性恐惧记忆的再巩固无明显影 响；电击环境在暴露后给予卡维地洛（l〇y g/只)，24小时后再次暴露于该环境，小鼠的僵 住时间显著高于该小鼠给药前的环境线索诱导的僵住时间（图2, P〈0. 05);同样，记忆再提 取后给予阿普洛尔（10 U g/只)后24小时的僵住时间显著高于该小鼠给药前的环境线索诱 导的僵住时间（图3, P〈0. 05);和对照组相比，两种药物对环境线索诱导的僵住时间均显著 高于生理盐水处理小鼠（图6, P〈0. 05);
[0055] P _肾上腺素受体拮抗剂普奈洛尔和倍他洛尔能抑制小鼠条件性恐惧记忆的再巩 固，
[0056] 由图4所不，电击环境再暴露后给予普奈洛尔，24小时后的僵住时间显低于该 小鼠给药前的环境线索诱导的僵住时间（图4, P〈0. 05);同样，记忆再提取后给予选择性 3 1-肾上腺素受体拮抗剂倍他洛尔，24小时后的僵住时间显低于该小鼠给药前的环境线 索诱导的僵住时间（图5, P〈0. 05);和对照组相比，两种药物对环境线索诱导的僵住时间均 显著低于生理盐水处理小鼠（图6, P〈0. 05);
[0057] P _肾上腺素受体biased拮抗剂不影响物体辨别记忆的再巩固，
[0058] 卡维地洛和阿普洛尔在记忆再提取后侧脑室注射（10y g/只），两者对给药处理 24小时后小鼠对新物体探求时间的增加无明显影响；而普奈洛尔（10mg/kg)和倍他洛尔 (lmg/kg)在记忆再提取后腹腔注射能明显抑制24小时后小鼠对新物体的探求，同时还能 抑制卡维地洛或阿普洛尔组小鼠对新物体的探求，*P〈〇. 05 ;
[0059] 结果证实，P -肾上腺素受体biased拮抗剂卡维地洛和阿普洛尔干预可以有效促 进学习记忆能力，尤其是情感性记忆的再巩固，并且对陈述性记忆无明显抑制。
【权利要求】
1. 3 -肾上腺素受体biased拮抗剂在制备促进中枢神经系统学习记忆的药物中的用 途。
2. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的￠-肾上腺素受体biased拮抗剂选 自卡维地洛或阿普洛尔。
3. 按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的￠-肾上腺素受体biased拮抗 剂通过建立条件性恐惧记忆和新物体辨别记忆的两种不同小鼠记忆模型获得促进中枢神 经系统学习记忆的用途。
4. 按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的￠-肾上腺素受体biased拮抗剂卡 维地洛增强小鼠条件性恐惧记忆的再巩固。
5. 按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的￠-肾上腺素受体biased拮抗剂阿 普洛尔增强小鼠条件性恐惧记忆的再巩固。
6. 按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的￠-肾上腺素受体biased拮抗剂卡 维地洛或阿普洛尔对小鼠物体辨别记忆的再巩固无影响。
【文档编号】A61P25/00GK104415334SQ201310377252
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月26日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】马兰, 刘星, 黄冰, 陶冶铮 申请人:复旦大学