一种从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮的方法，该方法包括以下主要步骤：(1)以粉碎的红凤菜新鲜茎叶为原料，用乙醇提取；(2)乙醇提取物用大孔树脂柱层析，乙醇-水梯度洗脱；(3)将步骤(2)得到的黄酮类部分用聚酰胺柱层析，乙醇-水梯度洗脱；(4)将步骤(3)析出的结晶滤出，母液合并，得到不同纯度的总黄酮提取物。经HPLC检测，结晶部分总黄酮含量＞90％，母液部分总黄酮含量＞80％。
【专利说明】一种从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从植物中提取分离有效成分的一种方法，具体是从红凤菜的新鲜茎叶中提取分离总黄酮。
【背景技术】
[0002]红凤菜(Gynura bicolor DC.)为菊科菊三七属植物,别名血皮菜、观音菜、观音苋、紫背天葵等，主要分布于我国南方各地，全草入药，味苷、辛，性凉，具有凉血止血、清热消肿的功效，治咳血、血崩、痛经、血气痛、支气管炎、盆腔炎、中暑、阿米巴痢疾，外用治创伤出血、溃疡久不收口、疗疮痛疖、甲沟炎。红凤菜还可作为蔬菜食用，近年来我国多个地区有栽培和销售。
[0003]红凤菜中含有黄酮类成分。卓敏等从红凤菜中分离得到6个黄酮类化合物:山柰酚、山柰酚-3_0-13-D-葡萄糖苷、高车前苷、山柰酚-3-0-13_D-吡喃葡萄糖基(6 — l)-a-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-0-β-D-吡喃葡萄糖基(6 — D-Q-L-鼠李糖苷、槲皮素-双-3-0- β -葡萄糖苷；吕寒等从红凤菜中分离得到5个黄酮类化合物:槲皮素、山柰酚、槲皮苷、异槲皮苷、芦丁；吕寒等采用高效液相与多级质谱联用法对红凤菜提取物中的黄酮类成分进行检测，确定提取物中含有5个黄酮类化合物:槲皮素-3-0-β -D-吡喃葡萄糖基(6 — I) - a -L-鼠李糖苷、山柰酚-3-0- β -D-吡喃葡萄糖基(6 — I) - a -L-鼠李糖苷、槲皮素-3-0- β -D-吡喃葡萄糖、槲皮素-3-0-鼠李糖苷、山柰酚。
[0004]可见，红凤菜的黄酮类化合物主要是槲皮素、山柰酚及其苷类成分，这些成分多具有保护心血管、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，从红凤菜中提取黄酮类化合物具有重要意义。
[0005]裴咏萍等研究了红凤菜总黄酮的提取工艺，以红凤菜的干燥叶片为原料，确定的最佳提取工艺是依次以12倍量、10倍量70%乙醇提取2次，2h/次。
[0006]卓敏等用红凤菜地上部分干样，分别用95^^75^^60%乙醇冷浸提取，浸膏混悬于水中，先后用石油醚、醋酸乙酯萃取，醋酸乙酯部分经过反复硅胶柱、C18柱、SephadexLH-20柱等层析，最终分离得到山柰酚等黄酮类单体化合物。吕寒等用红凤菜干品粉末，用70%乙醇热回流提取，减压浓缩挥去乙醇，冷却沉淀，取上清液用大孔树脂柱层析，依次用10%,20%,50%,95%乙醇洗脱，合并50%乙醇洗脱部分，反复硅胶柱层析,再结合聚酰胺柱层析和S^hadex LH-20柱层析，得到槲皮素等黄酮类单体化合物。以上两种红凤菜黄酮类物质的提取分离方法都采用干燥的地上部分为原料，提取物经过多次反复柱层析，采用氯仿、甲醇冼脱，步骤繁多，毒性较大。
[0007]吕寒等提供了一种红凤菜总黄酮提取物的制备方法(专利申请号:201010611189.X)，以干燥的红凤菜为原料，经过醇提、加水冷沉、大孔吸附树脂层析2次，以乙醇-水梯度洗脱，得到红凤菜总黄酮提取物。以芦丁为对照品，用0.1mol -L-1AlCl3.6Η20显色，比色法测定总黄酮含量，结果显示该提取物中的总黄酮含量可达50%以上。该方法也以干燥的红凤菜为原料，经过2次大孔吸附树脂层析，方法简便，但所得提取物中的总黄酮含量较低。
[0008]李法庆等提供了一种从新鲜红凤菜中提取紫色素及总黄酮的方法(专利申请号201110218685.3)，以新鲜红凤菜为原料，用乙醇温浸提取，提取液经过超滤系统超滤一纳滤系统浓缩一离子交换树脂层析一大孔吸附树脂层析等步骤，获得总黄酮结晶物，滤出干燥后得到总黄酮。该方法以新鲜红凤菜为原料，得到总黄酮结晶产物，但该法用到超滤系统和纳滤系统，设备条件要求高，操作步骤多。
[0009]本发明以红凤菜新鲜茎叶为原料，无需干燥加工，既节省劳力又降低能耗；本发明仅需2次柱层忻，工艺简单，操作方便；本发明可得到高含量的总黄酮提取物，采用高效液相(HPLC)技术检测，析出的结晶部分总黄酮含量达到90%以上，母液部分总黄酮含量达到80%以上；本发明层析分离所采用的填料为大孔树脂和聚酰胺，方便易得、价格便宜且可再生，洗脱液采用乙醇和水，生产成本低廉；本发明在总黄酮提取分离的整个流程中，涉及的溶剂仅有乙醇和水，操作安全，产品无残毒，对环境无污染。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种工艺简单、成本低廉、操作安全、能耗低、对环境无污染、可用于工厂化生产的方法，从红凤菜的新鲜茎叶中提取分离高纯度总黄酮。
[0011]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:以红凤菜的新鲜茎叶为原料，乙醇提取，依次经过大孔树脂柱层析和聚酰胺柱层析，最终得到红凤菜总黄酮提取物。经高效液相(HPLC)检测，洗脱液的总黄酮含量达到80%以上，洗脱液中析出的结晶物总黄酮含量达到90%以上。具体操作过程如下:
[0012](I)提取:以红凤 菜新鲜茎叶为原料，粉碎后用乙醇冷浸2-3次，所用乙醇的体积分数为70% -95%，料液比(W:V)为1:3-5，合并滤液，减压浓缩至原体积的1/3-1/5，得到浓缩液；
[0013](2)冷沉:将步骤(I)得到的浓缩液在冰箱中放置3-5天冷沉，去杂质，取上清液；
[0014](3)大孔树脂柱层析:将步骤(2)得到上清液用大孔树脂进行柱层析，大孔树脂为NKA、DlOU HPD-100, X_5、AB-8中的一种，上样量为50_100g/L柱床体积，样品浓度为0.02-0.05g/ml，水-乙醇梯度洗脱所用的乙醇体积分数依次为0，30 %，50 %，70 %，95 %，洗脱体积均为2倍柱床体积，收集50%乙醇洗脱部分，浓缩除去乙醇，得到浓缩液；
[0015](4)聚酰胺柱层析:将步骤(3)得到的浓缩液进行聚酰胺柱层析，所用聚酰胺为60-100目粉末，上样量为5-10g/L柱床体积，上样溶液的浓度为0.002-0.005g/ml，水-乙醇梯度洗脱所用的乙醇体积分数依次为0，30%，50%，70%，95%，洗脱体积均为2倍柱床体积。收集30% -70%乙醇洗脱部分，收集的每份体积为1/10柱床体积，浓缩到小体积，放置至析出结晶；
[0016](5)过滤、干燥:将步骤(4)中析出的结晶分别滤出，母液部分合并，结晶和母液分别干燥，得到
[0017]不同纯度的红凤菜总黄酮。
【具体实施方式】
[0018]实施例1:不同浓度乙醇对红凤菜总黄酮的提取效果[0019]称取红凤菜鲜叶20g共4份，分别加入体积分数为O、50 %、70 %、95 %的乙醇水溶液100ml，用电动搅拌机匀浆，超声波提取Ih (设定温度50°C，功率90% )，过滤，得到提取液。
[0020]采用比色法测定总黄酮含量。精密称取槲皮素对照品12.lmg，用80%乙醇溶解并定容到50mL，即配成浓度为0.242g. 1的溶液。精密吸取槲皮素对照品溶液0.0，1.0，
1.5,2.0,2.5,3.0,4.0mL至7只试管中，每浓度重复3次，分别加入0.3mL5% NaNO2，摇匀，6min后加入0.3mL10% Al (NO3) 3，摇匀，放置6min，加4% NaOH4.0mL,以水定容到10mL，放置10-15min，在510nm处测定吸光值(A51tl)，以加入的槲皮素含量(mg)为纵坐标，测得的A51tl为横坐标，计算线性相关方程。
[0021]精密吸取不同浓度乙醇的提取液3ml，代替槲皮素对照品，以相同方法测定样品的A51tl，同时分别取不同浓度乙醇的提取液3ml，用70%乙醇定容到10ml，作为不同提取液的空白。根据标准曲线计算样品中的总黄酮含量。每样品重复2次。
[0022]测得槲皮素与吸光值(A51tl)的线性相关方程为:y = 2.2157x-0.2511，r =
0.9991 (η = 3)，x为吸光值，y为槲皮素的质量(mg)。根据线性相关方程，计算不同浓度乙醇对红凤菜新鲜茎叶的总黄酮提取效果，结果如表1所示:
[0023]表1不同浓度乙醇对红凤菜新鲜茎叶中总黄酮的提取效果:
【权利要求】
1.一种红凤菜总黄酮的提取分离方法，以红凤菜的新鲜茎叶为原料，乙醇提取，经过2次柱层析，获得红凤菜总黄酮。
2.根据权利要求1所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，所述的2次柱层析依次为大孔树脂柱层析和聚酰胺柱层析。
3.根据权利要求1所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征包括以下步骤: (1)提取:以红凤菜的新鲜茎叶为原料，用乙醇冷浸提取2-3次，合并滤液，减压浓缩至原体积的1/3-1/5，得到浓缩液； (2)冷沉:将步骤(I)得到的浓缩液在冰箱中放置3-5天冷沉，取上清液； (3)大孔树脂柱层析:将步骤(2)得到上清液用大孔树脂进行柱层析，水-乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩除去乙醇，得到浓缩液； (4)聚酰胺柱层析:将步骤(3)得到的浓缩液用聚酰胺柱层析，水-乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩到小体积，放置，忻出结晶； (5)过滤、干燥:将步骤(4)析出的结晶滤出，母液合并，结晶与母液分别干燥，得到不同纯度的红凤菜总黄酮提取物，用高效液相(HPLC)方法检测，其中结晶部分总黄酮含量达90%以上，母液部分总黄酮含量达80%以上。
4.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征为步骤(I)用乙醇提取，所用乙醇的体积分数为70% -95%，料液比(W:V)为1:3-5。
5.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征为步骤(3)大孔树脂柱层析所用的大孔树脂为NKA、AB-8、HPD-100, X_5、DlOl中的一种，上样量为50_100g/L柱床体积,样品浓度为0.02-0.05g/ml，水-乙醇梯度洗脱所用的乙醇体积分数依次为0，30%,50%,70%,95%,洗脱体积均为2倍柱床体积。
6.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征为步骤(3)大孔树脂柱层析所收集的洗脱液为50%乙醇洗脱部分。
7.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征在于步骤(4)聚酰胺柱层析所用的聚酰胺为60-100目粉末，上样量为5-10g/L柱床体积，样品浓度为0.002-0.005g/ml，水-乙醇梯度洗脱所用的乙醇体积分数依次为O，30 %，50 %，70 %，95 %，洗脱体积均为2倍柱床体积。
8.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征在于步骤(4)聚酰胺柱层析,收集洗脱液为收集30-50%乙醇洗脱部分，收集的每份体积为1/10柱床体积。
【文档编号】A61K135/00GK103463159SQ201310423000
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】任冰如, 李维林, 陈剑, 吕寒, 梁呈元, 吴菊兰, 赵磊 申请人:江苏省中国科学院植物研究所