一种抗菌肽水凝胶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种含有活性成分抗菌肽的医用水凝胶敷料及其制备方法。主要是由经过使用天然生物多糖高分子原位聚合包埋人源抗菌肽分子制备出一种具有较好的生物相容性和药物安全性的医用水凝胶敷料。该抗菌肽水凝胶敷料具有抗菌；良好的柔韧性，能与创面紧密贴合；能促进愈合，缩短伤口愈合时间并减少疤痕的生成，具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种抗菌肽水凝胶及其制备方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种医用水凝胶敷料，尤其涉及一种包埋抗菌肽分子的医用水凝胶敷料及其制备方法。
【背景技术】:
[0002]抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000~7000左右，由20~60个氨基酸残基组成。按抗菌肽来源分为:微生物抗菌肽，植物抗菌肽，动物抗菌肽及人源性抗菌等。近年来抗菌肽在创伤修复领域得到了广泛研究，文献报道人源抗菌肽(Host Defense Peptide)具有广谱抗菌,参与创面炎症调节,促创伤区血管生成，促创伤区上皮再生的功能。在人体创伤愈合这一复杂生理过程中，抗菌肽作为内生型免疫系统的关键信号分子之一，与各类细胞及各种生长因子相互作用，协调达到平衡状态，实现创伤修复。抗菌肽在机体中呈诱导性表达，正常生理状态时浓度仅为0.4-1 u mol/L0而受到外来细菌，炎症或创伤刺激时表达上调，在皮肤炎症处可检测到人源抗菌肽浓度高至 10 u mol/Lo
[0003]自上世纪70年代以来，欧美国家厂商开始研制非棉制新型医用敷料产品，以此取代传统纱布绷带类敷料。包括含银离子、硅酮类、藻酸类及活性炭类等新型材料和新型高分子复合材料等新产品陆续进入创伤护理医疗器械行业，并成为国际市场的主流品种。尤其一些被誉为“功能型卫生材料”的新产品如水凝胶敷料、泡沫敷料、透明敷料和水胶体等卫生材料新产品已大量应用于临床实践。利用无毒高分子材料研制的水凝胶医用敷料产品是一种高端的医用敷料产品，与传统敷料相比，水凝胶敷料有一定的水含量，良好的生物相容性，不影响生命体的代谢过程，而代谢产物又可通过水凝胶排出，这样在湿润的环境下，伤口不会结痂，且比在干燥环境下愈合更快。
【发明内容】
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[0004]本发明提出了将人源肽和水凝胶相结合的设计方案及生产方法，通过使用该方法制备出的抗菌肽水凝胶，具有较好的生物相容性和药物安全性。
[0005]以生物相容性好的天然生物多糖高分子材料为主要原料，采用现有技术中的原位交联反应制备新型水凝胶敷料基质，由多肽分子与生物多糖高分子材料共轭反应，进而通过原位聚合包埋多肽分子，同时参入热敏性生物材料从而混合制成水凝胶。制备过程中，多糖高分子材料和热敏性生物材料在所述水凝胶中的总含量为1^-49% (w/w)。生物多糖高分子与抗菌肽分子的配比为(10: I到200: I)，生物多糖高分子与热敏性生物材料的配比为(1:1 到 1: 10)。
[0006]天然生物多糖高分子材料包括但不限于以下材料:壳聚糖，葡聚糖，蔗糖，海藻酸，透明质酸，木糖，纤维素，糖胺聚糖。热敏性材料包括但不限于以下材料:聚丙乙烯聚乙烯共聚物，聚氧丙烯聚乙烯共聚物。人源抗菌肽包括但不限于以下种类:防御素(Defensins)家族，组织蛋白酶抑制素(Cathelicidins)家族,富含组氨酸蛋白(Histatins)家族，以及富含甘氨酸蛋白(Hglyrichin)家族。
[0007]本发明涉及到人源肽的生产过程，生产工艺为:是采用现有技术中化学合成或者采用基因工程的方法使用生物反应器将含有人源肽基因的载体在细胞中表达出人源肽，分离纯化可得。反相高效液相色谱(rHPLC)具有分离效果好、分辨率高、回收率高的特点，经化学合成制备多肽也可采用已高效液相色谱进行分离纯化。
[0008]本发明通过优化水凝胶配方，引入热敏感性强的材料(如聚丙乙烯聚乙烯共聚物和/或聚氧丙烯聚乙烯共聚物)，使水凝胶在10°c以下的物理状态几乎接近液体。当将低温储藏的针剂注射到创伤表面，液态水凝胶迅速流淌至创伤任何微小表面，在体表37°c停留10分钟内，其物理性质转换成接近固相，形成凝胶，覆盖伤口。
[0009]本发明涉及的抗菌肽水凝胶产品，集抗菌肽与水凝胶对创伤修复的优越性于一身。生物相容性好，能够长期贴合创面；具有高稳定性，在长期覆盖创面中可调节炎症反应，改善创面的微环境抑制细菌的生长；具有良好的柔韧性，能与创面紧密贴合；促进新生血管发生及上皮再生等,使创伤快速修复；能促进愈合,缩短伤口愈合时间并减少疤痕的生成。实验结果也显示在细胞水平上，人源抗菌肽和生长因子具有可比性，人源肽水凝胶与含有生长因子的多功能新型水凝胶产品相比，成本大幅降低，具有在临床创伤护理领域应用的前景。
[0010]图例说明:
[0011]为了加深对本发明的理解，下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。但并非是对本发明的进一步限定，根据本发明的上述内容作出其他形式的变更、替换等均属于本发明的范围。其中:
[0012]图1: (A)反相高效液相色谱(rHPLC)对LL-37人源抗菌肽的色谱分离图⑶冻干收集得到白色粉末产品。
[0013]图2:透明质酸醛基 衍生化后与多肽分子键合的两步反应。
[0014]图3:键合有LL-37的透明质酸醛基衍生物与透明质酸酰肼化衍生物共价交联制备水凝胶。(A) HA的酰肼化衍生物(HA-ADH)与键合LL-37的醛基化衍生物(HA-ALD)在PBS缓冲溶液中，在4°C进行交联反应6小时。(B)在反应过程中，加入热敏辅料聚丙乙烯聚乙烯，反应结束后，在室温下形成水凝胶。
【具体实施方式】:
[0015]一、人源肽的分离提纯:
[0016]1、提纯实验步骤
[0017]采用固相化学合成方法合成出组织蛋白酶抑制素(cathelicidins)家族中的LL-37,氨基酸序列LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，将合成多肽粗品用含乙腈水溶液溶解后，离心，保留上清液，弃去沉淀。反相液相色谱系统为，SCL210AVP液相色谱仪(日本岛津公司)，包括系统控制器、LC210ATVP色谱泵、进样阀、STO2M10AVP 二极管阵列检测器，CLASS2VP5.33色谱工作站。色谱柱为200 X 4mm 1.D.的不锈钢管，用匀浆法装填德国进口 NucleOsil400027C18反相色谱填料。取一定浓度的多肽样品溶液进样至已用流动相A液[水+0.1% TFA(VPVP% )]平衡过的反相高效液相色谱(rHPLC)上，然后进行线性梯度洗脱直至达到要求的B液浓度[乙腈+0.1% TFA(VPVP% )]，如图1(A)所示rHPLC对LL-37人源抗菌肽的色谱分离图。分离纯化得到的LL-37纯度大于95%，经过冻干收集得到如图1(B)所示的白色粉末。
[0018]2、抗菌活性评价
[0019]分别测试纯化后LL-37抗菌肽对革兰阳性和革兰阴性菌的活性，包括耐氨苄青霉素和链霉素的大肠杆菌和多药耐药金黄色葡萄菌如表1所示。检测结果表明，对革兰阳性细菌(鲍氏不动杆菌、炭疽杆菌和金黄色葡萄菌)和革兰阴性菌(大肠杆菌)具有抗菌活性。而溶血性试验结果表明，LL-37具有低溶血性的特性。
[0020]表1 LL-37抗菌活性的半数抑制浓度以及溶血性检测
[0021]
【权利要求】
1.一种抗菌肽水凝胶，其特征在于:包含人源抗菌肽分子、天然生物多糖高分子材料和热敏性材料，多糖高分子材料和热敏性生物材料在所述水凝胶中的总含量为1^-49%(w/w)。
2.如权利要求1所述的抗菌肽水凝胶，其特征在于:所述的天然生物多糖高分子材料为:壳聚糖，葡聚糖，蔗糖，海藻酸，透明质酸，木糖，纤维素，糖胺聚糖当中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的抗菌肽水凝胶，其特征在于:所述的热敏性材料为:聚丙乙烯聚乙烯共聚物和/或聚氧丙烯聚乙烯共聚物。
4.如权利要求1所述的抗菌肽水凝胶，其特征在于:所述的多糖高分子和所述的热敏性材料的质量比例为1:1到1: 10。
5.如权利要求1所述的抗菌肽水凝胶，其特征在于:所述的活性成分抗菌肽为人源抗菌肽的防御素家族、组织蛋白酶抑制素家族、富含组氨酸蛋白家族、或富含甘氨酸蛋白家族当中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的抗菌肽水凝胶，其特征在于:生物多糖高分子与抗菌肽分子的配比为10: I到200: I之间。
7.一种抗菌肽水凝胶的制备方法，其步骤如下: (1)抗菌肽的制备:采用固相化学合成，或基因工程的方法将含有人抗菌源肽基因的载体在细胞中表达所述多肽分子，而后分离纯化； (2)天然生物多糖高分子材料的交联:以天然生物多糖高分子材料为原料，辅以热敏性材料，采用原位交联技术制备水凝胶敷料基质； (3)人抗菌源肽的包埋:通过原位聚合包埋人源抗菌肽分子； 所述天然多糖高分子材料和热敏性生物材料在所述水凝胶中的总含量为1% -49%(w/w)。
8.如权利要求7所述的抗菌肽水凝胶的制备方法，其特征在于:所述的天然生物多糖高分子材料为:壳聚糖，葡聚糖，蔗糖，海藻酸，透明质酸，木糖，纤维素，糖胺聚糖当中的一种或多种。
9.如权利要求7所述的抗菌肽水凝胶的制备方法，其特征在于:所述的热敏性材料为:聚丙乙烯聚乙烯共聚物和/或聚氧丙烯聚乙烯共聚物。
10.如权利要求7所述的抗菌肽水凝胶的制备方法，其特征在于:所述的人源抗菌肽为:防御素家族、组织蛋白酶抑制素家族、富含组氨酸蛋白家族、或富含甘氨酸蛋白家族当中的一种或多种。
【文档编号】A61L15/28GK103611181SQ201310517751
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】王明慧, 邱岸 申请人:无锡灵锡医疗器械科技有限公司