Dj-1蛋白在制备骨肉瘤诊断和治疗产品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种DJ-1蛋白在制备骨肉瘤诊断和治疗产品中的应用，该DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。本发明实验证明DJ-1蛋白在骨肉瘤组织中的表达明显高于非肿瘤组织；且在骨肉瘤细胞中过表达（敲除）DJ-1蛋白可显著降低（增加）骨肉瘤细胞对一线治疗药物的敏感性。因此，DJ-1蛋白可作为骨肉瘤诊断和治疗的特异性标志蛋白，提高骨肉瘤诊断的准确性和治疗的有效性。本发明DJ-1蛋白为防治骨肉瘤提供了新的治疗靶标和有效新药。
【专利说明】DJ-1蛋白在制备骨肉瘤诊断和治疗产品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物制药领域，涉及一种DJ-1蛋白在制备诊断和治疗骨肉瘤广品中的应用。
【背景技术】
[0002]骨肉瘤是最常见的恶性成骨性肿瘤之一，流行病学研究发现该病好发于15-25岁的青少年，且男性发病率高于女性。骨肉瘤好发部位是长管状骨的干骺端，该肿瘤恶性程度高，预后极差，单纯截肢后患者的5年生存率低于20%。因此，有效诊断和防治骨肉瘤是目前骨肿瘤研究中的重点和难点。[0003]人DJ-1 蛋白是由 DJ-1 基因(Genebank N0.NM 007262.4)编码而来，是 Thi j/PfPI家族成员之一。目前该蛋白的功能尚未被完全探明，有研究报道其与人类常染色体隐性遗传早发型帕金森病相关；在肿瘤方面有报道DJ-1在多种肿瘤性病变中异常表达，并可能参与恶性肿瘤的发生发展，但DJ-1蛋白能否作为骨肉瘤诊断的标记分子和治疗靶点尚无研究报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种DJ-1蛋白在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用，该DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:l所示。所述治疗骨肉瘤的药物包括:通过RNA干扰抑制DJ-1基因表达的双链核糖核酸，或用于抑制DJ-1蛋白功能的短肽和小分子化合物。
[0005]本发明的另一个目的是提供一种DJ-1蛋白在制备诊断骨肉瘤产品中的应用，该DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。所述诊断骨肉瘤的产品包括:用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断骨肉瘤的产品。
[0006]其中所述用免疫检测诊断骨肉瘤的产品包括--与DJ-1蛋白特异性结合的抗体。
[0007]所述用RT-PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异性扩增DJ-1基因的引物:正向引物:5’ -AGACGGTCATCCCTGTAGAT-3’ (SEQ ID No:2)；反向引物:5’ -GCTCCTTCAGTATCTCCTTCAC-3’ (SEQ ID No:3)。
[0008]所述用实时定量PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异性扩增DJ-1基因的引物:正向引物:5，-AGCCGTGATGTGGTCATTT-3，(SEQ ID No:4);反向引物:5，-GTCTTTAGCAAGAGGGTGTGT-3’ (SEQ ID No:5)。
[0009]所述用原位杂交诊断骨肉瘤的产品包括:与DJ-1基因的核酸序列杂交的探针:5’-TCATCCACATTACTGGAGGTAAGTAGT-3’ (SEQ ID No:6)。
[0010]所述用基因芯片诊断骨肉瘤的产品包括:与DJ-1基因的核酸序列杂交的探针:5’-ACTCGGTTGTCTCGTCATCCTGGACGT-3’ (SEQ ID No:7)。
[0011]在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对DJ-1蛋白的特异性抗体。例如，将纯化的人DJ-1蛋白或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人DJ-1蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。本发明的抗体包括可以阻抑DJ-1功能的抗体，也可以是不影响人DJ-1蛋白功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人DJ-1蛋白的片断或功能域致免疫而产生，而人DJ-1蛋白产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的DJ-1蛋白结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E.coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化DJ-1蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。
[0012]在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其他衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能够完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可以短至25、20、15或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0013]人DJ-1蛋白是由DJ-1基因(Genebank N0.NM 007262.4)编码而来，目前研究报道DJ-1在多种肿瘤性病变中异常表达，并可能参与恶性肿瘤的发生发展，但DJ-1蛋白能否作为骨肉瘤诊断的标记分子和治疗靶点尚无研究报道。本发明实验证明DJ-1蛋白在骨肉瘤组织中的表达明显高于非肿瘤组织；且在骨肉瘤细胞中过表达(敲除)DJ-1蛋白可显著降低(增加)骨肉瘤细胞对一线治疗药物的敏感性。因此，DJ-1蛋白可作为骨肉瘤诊断和治疗的特异性标志蛋白， 提高骨肉瘤诊断的准确性和治疗的有效性。本发明DJ-1蛋白为防治骨肉瘤提供了新的治疗靶标和有效新药。
[0014]【专利附图】
【附图说明】
图1是本发明通过免疫组化法验证DJ-1在人骨肉瘤组织中的表达。
[0015]图2是本发明通过免疫组化法检测骨肉瘤中DJ-1蛋白水平。
[0016]图3是采用质粒转染法在骨肉瘤细胞KHOS中过表达DJ-1蛋白后对体外骨肉瘤细胞药物敏感性的影响。
[0017]图4是采用质粒转染法在骨肉瘤细胞U20S中过表达DJ-1蛋白后对体外骨肉瘤细胞药物敏感性的影响。
[0018]图5是采用SiRNA特异性敲除骨肉瘤细胞KHOS中的DJ-1蛋白后对体外骨肉瘤细胞药物敏感性的影响。
[0019]图6是采用SiRNA特异性敲除骨肉瘤细胞U20S中的DJ-1蛋白后对体外骨肉瘤细胞药物敏感性的影响。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021]实施例1:
选取骨肉瘤临床样本51例，用10%甲醛溶液固定7天，随后制备石蜡包埋的组织块。将样本制备厚度为8微米的石蜡切片，并采用免疫组化法检测DJ-1蛋白(氨基酸序列如SEQID No:1所示)的表达情况，与此同时选取另一张切片进行H&E染色。在正置显微镜下观察DJ-1蛋白的表达情况，以及H&E染色的情况。参见图1，样本癌组织中DJ-1蛋白的表达高于同一张片子中非肿瘤组织。
[0022]实施例2:
对前述实施例1中的51例骨肉瘤临床样本中DJ-1蛋白的表达情况进行统计，发现强阳性为24例，阳性为15例，弱阳性为7例，阴性为5例(图2)。
[0023]在传代培养的骨肉瘤细胞KHOS和U20S中分别转染DJ-1基因(DJ-1组)，并设置空白对照(PCMV6组)。待转染24小时后，分别给予顺钼、紫杉醇、阿霉素和甲氨蝶呤，检测药物对转染细胞的生长抑制作用。参见图3和图4，过表达DJ-1基因后，骨肉瘤细胞KHOS和U20S对药物敏感性显著降低。
[0024]实施例4:
在传代培养的骨肉瘤细胞KHOS和U20S中分别采用SiRNA特异性敲除DJ-1基因(SiRNADJ-1组)，并设置空白对照(NC组)。待转染24小时后，分别给予顺钼、紫杉醇、阿霉素和甲氨蝶呤，检测药物对细胞的生长抑制作用。参见图5和图6，敲除DJ-1基因后，骨肉瘤细胞KHOS和U20S对药物敏感 性显著增加。
【权利要求】
1.一种DJ-1蛋白在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用，其特征在于，该DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.—种DJ-1蛋白在制备诊断骨肉瘤产品中的应用，其特征在于，该DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述诊断骨肉瘤的产品包括:用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断骨肉瘤的产品。
3.根据权利要求2所述的一种DJ-1蛋白在制备诊断骨肉瘤产品中的应用，其特征在于，所述用免疫检测诊断骨肉瘤的产品包括与DJ-1蛋白特异性结合的抗体。
4.根据权利要求2所述的一种DJ-1蛋白在制备诊断骨肉瘤产品中的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异性扩增DJ-1基因的引物:正向引物:5’ -AGACGGTCATCCCTGTAGAT-3’，反向引物:5’ -GCTCCTTCAGTATCTCCTTCAC-3’。
5.根据权利要求2所述的一种DJ-1蛋白在制备诊断骨肉瘤产品中的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异性扩增DJ-1基因的引物:正向引物:5’ -AGCCGTGATGTGGTCATTT-3’，反向引物:5’ - GTCTTTAGCAAGAGGGTGTGT-3’。
6.根据权利要求2所述的一种DJ-1蛋白在制备诊断骨肉瘤产品中的应用，其特征在于，所述用原位杂交诊断骨肉瘤的产品包括--与DJ-1基因的核酸序列杂交的探针:5’-TCATCCACATTACTGGAGGTAAGTAGT-3，。
7.根据权利要求2所述的一种DJ-1蛋白在制备诊断骨肉瘤产品中的应用，其特征在于，所述用基因芯片诊断骨肉瘤的产品包括:与DJ-1基因的核酸序列杂交的探针:5’-ACTCGGTTGTCTCGTCATCCTGGACGT-3’。
【文档编号】A61K38/17GK103585619SQ201310528113
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】杨波, 何俏军, 曹戟, 谢楠, 张俊 申请人:浙江大学