白芍总苷作为egfr酪氨酸激酶抑制剂的新用途

白芍总苷作为egfr酪氨酸激酶抑制剂的新用途
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及白芍总苷作为白芍总苷作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂的新用途，白芍总苷中芍药苷(C23H28O11)的含量不得少于34.6％。与传统的EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼相比相比，具安全性高，既可显著降低EGFR酪氨酸激酶的表达量又能降低其激活量，价格低廉，资源丰富等优点，为药物开发提供一种新的选择。
【专利说明】白芍总苷作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂的新用途
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，涉及白芍总苷作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂的新用途。
【背景技术】
[0002]白苟总苷(Total Glucosides ofPaeony)是我国常用的传统中药材白苟饮片中提取的总苷物。是苟药苷(paeoniflorin)、羟基苟药苷(hydroxy-paeonif1rin)、苟药花苷(paeonin)、苟药内酯苷(albif1rin)、苯甲酰苟药苷(benzoylpaeoniflorin)等一系列糖苷类化合物的混合物。白芍总苷具有多种生物学功能和药理学价值，具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗等功效，其资源在国内十分丰富，作为传统中药，已经在多种中药复方中应用超过1500年。白芍总苷于1998年被国家食品药品监督管理总局(SFDA)批准上市作为治疗类风湿性关节炎的临床药物，十余年的应用中没有毒性报告，安全性高，副作用少。
[0003]表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)是一种跨膜受体膜受体，可将有丝分裂信号从细胞外传递到细胞内，可有效调节细胞对外界刺激的反应、细胞增生、存活、黏附、迁移和分化，细胞存活及生长状况等。EGFR酪氨酸激酶信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用。在多种恶性肿瘤如神经胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、宫颈癌、食管癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌等中都有过度表达，激活EGFR酪氨酸激酶会加快肿瘤细胞繁殖，促进肿瘤血管生成，加速肿瘤转移，阻碍肿瘤凋亡。
[0004]目前已知的EGFR酪氨酸激酶抑制剂有可逆EGFR酪氨酸激酶抑制剂，如埃罗替尼，吉非替尼，Lapatinib (GW572016)，PKI66 (CGP59326)，PD158780, PD165557,不可逆 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂，如 EKB-596，C1-1033 (PD2183805)。
[0005]长期以来，化疗是治疗肿瘤的主要的治疗手段。虽然近年来新一代化疗药物的应用，其疗效得到了一定的提高，但是多数资料表明，化疗药物对肿瘤细胞的杀伤同时出现血液毒性、胃肠道反应等副作用，依然是其深入广泛应用的最大障碍。EGFR酪氨酸激酶抑制剂对癌症的治疗作用引起了人们的关注，目前已上市的酪氨酸激酶非常昂贵，一般病人难以承受巨大的治疗成本而丧失治疗机会，而且有研究显示，这类药物由于成分单一，在给药后会诱导肿瘤细胞产生的EGFR酪氨酸激酶分子二次突变(获得性突变)，而产生耐药性使这类药物失去治疗作用。白芍总苷无毒，价廉，资源丰富，目前尚未有文献报道白芍总苷作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂方面的用途。

【发明内容】

[0006]针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是寻找一种资源丰富，价廉，安全性高的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，为药物开发提供一种新的选择。
[0007]实现本发明的技术特征是:
[0008]1.白芍总苷作为EGFR酪 氨酸激酶抑制剂的新用途。
[0009]2.白芍总苷，含芍药苷(C23H28O11)不得少于34.6%。[0010]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0011]药物安全性高，白芍作为传统中药，自1998年上市销售使用以来，没有任何毒副作用报道；疗效显著，调节诸多胞内重要的细胞分子的表达，尤其是对于EGFR酪氨酸激酶的抑制，使EGFR酪氨酸激酶的表达量和激活量显著降低，与传统的EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼相比能够明显减少EGFR酪氨酸激酶的表达量。价格低廉，资源丰富，白芍总苷来源于我国常用的传统中药材白芍饮片，其资源在国内十分丰富。
【专利附图】

【附图说明】
[0012]图1为肿瘤细胞受不同浓度白芍总苷与吉非替尼作用后胞内蛋白免疫印迹图。
[0013]图2为肿瘤细胞受不同浓度白芍总苷作用后胞内蛋白免疫印迹图。
[0014]图3为不同浓度白芍总苷与吉非替尼作用下的肿瘤细胞存活率曲线。
[0015]图4为不同浓度白芍总苷作用下肿瘤细胞状态显微照片。
【具体实施方式】
[0016]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细阐述。
[0017]实施例所用的白芍总苷为宁波立华制药有限公司的白芍总苷胶囊颗粒，使用时用5mL TBS溶解200mg,用0.22um的滤膜过滤除菌。
[0018]实施例1蛋白免疫印迹实验
[0019]取肺癌细胞A549，H1299，`对数生长期细胞，以RPMI1640-5% FBS培养液配制成9 X IO4个/ mL单细胞悬液，接种于IOcm培养皿中，每孔10mL，并设不加样品的细胞悬液为阴性对照。
[0020]将白芍总苷和吉非替尼用培养液配制成所需浓度，用真空泵吸走原有的培养液，将含有不同浓度药物的培养液加入培养皿中，每皿IOmL ;对照组加RPMI1640-5% FCS培养液，培养72h。
[0021]72h后，吸取培养清液于试管中，4500转于4°C离心lmin，弃去上清，迅速用预冷的PBS重悬细胞并转移至1.5mL离心管中离心，吸去上层的PBS清液。用预冷的的PBS冲洗培养皿中贴壁的细胞一次，水平摇动洗涤细胞，吸掉PBS洗液，并把培养皿置于冰上。每盘细胞加IOOuL的Radio Immunoprecipitation Assay (RIPA)细胞裂解液,用干净的细胞刮快速将细胞刮于培养皿的一侧，吸取刮下的细胞和RIPA裂解液置于离心管中，4°C放置30min使细胞裂解充分，每隔IOmin涡旋数秒钟。用超声细胞破碎仪处理细胞，使其破碎完全，并于4°C离心机中13000rpm速度离心lOmin。将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于-20°C保存收集的细胞，离心，吸去上清。以BCATM蛋白质试剂盒检测各蛋白质样品的浓度，BCA反应液按A液和B液1: 50组成，96孔板中每孔加入200uL BCA反应液，于暗处反应2h后用酶标仪于562nm波长下检测。对收集的蛋白进行含量测定。
[0022]用还原型6X上样缓冲液对蛋白进行变性，用水浴锅于95°C变性lOmin，冷却后通过Western Blot试验检测蛋白含量。结果见图1和图2。
[0023]如图1所示，EGFR酪氨酸激酶含量，激活态EGFR酪氨酸激酶(P-EGFR)含量，下游重要信号分子激活态蛋白激酶B(P-AKT，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用)的含量随白芍总苷浓度的增大而减小，说明白芍总苷作用于肺癌细胞A549，H1299，H1650任何一种细胞既可以显著减少EGFR酪氨酸激酶的表达量又可减少激活量，同时影响下游重要信号分子AKT的磷酸化水平，该作用呈浓度依赖性，白芍总苷浓度达到640ug / ml时，EGFR酪氨酸激酶的激活几乎被完全抑制。作为目前临床上使用较多的EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼在IOuM时有相同的抑制P-EGFR的效果，但是吉非替尼作为小分子靶向药物，只能抑制EGFR酪氨酸激酶特定位点的磷酸化，却不能减少EGFR酪氨酸激酶的表达量。
[0024]如图2所示，在两种肺癌细胞系A549中，白芍总苷作用于肿瘤细胞对于一些细胞内重要的信号分子有明显的调节作用，且该作用呈浓度依赖性。这些蛋白中大多数都作为EGFR酪氨酸激酶下游的信号分子，其表达水平和激活受EGFR酪氨酸激酶直接或间接地调控，当EGFR酪氨酸激酶受体激活受到抑制，下游信号蛋白的一系列磷酸化难以进行，导致生长信号传导受阻。从图中可以看出，调控细胞周期的蛋白周期素CyclinD / E和周期素依赖蛋白CDK都在白芍总苷的作用下明显减少，这直接导致ATP不能进入核内使视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白(Rb)磷酸化。Rb作为核内结合转录因子的重要周期节点蛋白，在非磷酸化状态结合转录因子，磷酸化时释放转录因子，从图中看出，总Rb的水平在给药后明显上升，核内非磷酸化状态的Rb水平上升，使转录因子的结合量上升，从而细胞增殖周期受阻，使细胞生长停滞。EGFR酪氨酸激酶不能激活会诱导细胞凋亡程序启动，从图中可以看出，白芍总苷作用后，线粒体上重要的原癌基因蛋白家族中的B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)表达量减少，促凋亡蛋白(Bax)在药物作用下没有明显的影响，凋亡进程中重要标志蛋白天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase3)和DNA修复酶(PARP)在白芍总苷作用后都产生明显的断裂，这些断裂的碎片进一步参与到肿瘤细胞的凋亡进程中。这些变化可充分地证明白芍总苷对EGFR酪氨酸激酶有明显地抑制作用。
[0025]实施例2细胞存活率实验
[0026]取肺癌细胞A549，H`1299，H1650对数生长期细胞，以RPMI1640-5 % FBS培养液将每种细胞系配制成I X IO4个/ mL单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200uL，并设不加样品的细胞悬液为阴性对照。
[0027]将白芍总苷及吉非替尼用培养液配制成所需浓度，用真空泵吸走原有的培养液，将含有不同浓度的白芍总苷的培养液加入孔中，每个浓度设三个平行孔，每孔200uL ;对照组加RPMI1640-5% FCS培养液，培养72h。
[0028]72h 后，加 2mg / mL 的 Resazurin 溶液 20uL/ 孔，混匀后在 37°C>5% CO2 及饱和湿度条件下孵育16h。孵育完成后在全波段酶联免疫检测仪上，以激发波长544nm，发射波长595nm条件下测定各孔荧光强度，记录结果并计算白芍总苷对于肿瘤细胞的抑制率:抑瘤率=(1-加药组荧光值/阴性对照组荧光值)X 100%。结果见图3。
[0029]由图3可知，在肺癌细胞系A549，H1299，H1650中，白芍总苷能明显抑制肿瘤细胞的生长，640ug / mL以上的白芍总苷作用下存活的肿瘤细胞少于20%，且白芍总苷对于肿瘤细胞生长的抑制呈时间依赖性和浓度依赖性，这与目前临床上使用较多的EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼相比有相似的效果，也具有明显的时间依赖性和浓度依赖性，这正是因为细胞EGFR酪氨酸激酶信号通路受白芍总苷和吉非替尼阻断所导致的。
[0030]实施例3细胞形态学观察
[0031]取肺癌细胞A549，H1299，H1650对数生长期细胞，以RPMI1640-5% FBS培养液配制成9 X IO4个/ mL单细胞悬液，接种于IOcm培养皿中，每皿10mL，并设不加样品的细胞悬液为阴性对照。
[0032]将白芍总苷用培养液配制成所需浓度，用真空泵吸走原有的培养液，将含有不同浓度药物的培养液加入培养皿中，每皿IOmL ;对照组加RPMI1640-5% FCS培养液，培养72h。
[0033]取不同组别细胞培养皿置于显微镜下观察，将显微镜调整为10倍目镜，10倍物镜，使用照相软件对视野内细胞形态进行拍摄。结果见图4。
[0034]图4显示，空白对照组的细胞贴壁生长，呈多角形，细胞饱满，数目多，生长状态良好，随着白芍总苷给药浓度加大，细胞形态发生明显变化:细胞开始皱缩，边缘出现亮化，即贴壁状态受到药物的影响，细胞数明显减少，这些变化是由于细胞EGFR酪氨酸激酶信号通路受白芍总苷 阻断导致的。
【权利要求】
1.白芍总苷的新用途，其特征在于作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的白芍总苷，其特征在于，含芍药苷(C23H28O11)不得少于34.6%。
【文档编号】A61K36/71GK103550313SQ201310535739
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】张丽娟, 唐洋, 崔怡迪, 邱培菊, 兰莹 申请人:中国海洋大学