一种制备癌细胞靶向性仿细胞微囊的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备癌细胞靶向性仿细胞微囊的方法。选用人脐带静脉内皮细胞作为原料制备表面带有氨基的仿细胞微囊，将其分散在含醛基的核酸适配体溶液中；孵育一段时间后，核酸适配体标记到仿细胞微囊表面，然后用磷酸盐缓冲液洗涤；将处理后的仿细胞微囊浸入盐酸阿霉素的药物溶液中，通过静电作用装载药物，最终得到不同载药量的仿细胞微囊。本发明制备方法简便可控，材料来源广泛，生产效率高，可以方便地调节仿细胞微囊的载药量，同时具有靶向癌细胞的特点，有良好的应用前景。
【专利说明】一种制备癌细胞靶向性仿细胞微囊的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备癌细胞靶向仿细胞微囊的方法。尤其是利用核酸适配体修饰仿细胞微囊实现癌细胞靶向的方法。
【背景技术】 [0002]药物载体的靶向性是非常重要的一个概念。药物载体对癌细胞的特异性识别可以提高药物在肿瘤组织的浓度，因此可以显著降低给药剂量，从而降低对正常组织或者细胞的毒副作用。因此，实现药物载体的靶向性在药物传递领域具有非常重要的意义。
[0003]通常的具有靶向功能的药物载体主要是使用人工合成的聚合物或天然来源的蛋白质和多糖作为原料，其结构比较简单。但是往往生物相容性差，较易被人体的免疫系统识别并清除，具有靶向癌组织和细胞能力不强的缺点，这些缺点限制了其推广与应用。
[0004]仿细胞微囊是由细胞膜将囊内空间与囊外空间隔离开来形成的球状物质。利用细胞松弛素b处理哺乳动物细胞，破坏维持细胞形态的肌动蛋白的组装，然后在机械剪切的作用下制备仿细胞微囊。
[0005]仿细胞微囊作为癌细胞靶向性的药物载体有诸多优点:一方面是由于微囊表面实质是一层类细胞膜结构，小分子药物通过氢键、疏水相互作用等作用可以包埋在微囊内部或者囊壁上；因此可以有效避免药物暴释现象的发生，同时也可以降低药物分子对细胞的毒害。另一方面，不同于传统化学修饰的微纳载体，仿细胞微囊来源于细胞，因此具有极佳的生物相容性，并且有望降低自体免疫系统的清除作用，具有更好的临床应用价值。
[0006]核酸适配体AS1411是富含G的寡核苷酸，它可特异性地与癌细胞表面的核仁素结合，从而实现靶向功能。之前的实验证明其可以富集到癌组织和细胞，并抑制癌细胞的增殖。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种简便快速制备癌细胞靶向性仿细胞微囊的方法。
[0008]本发明的制备癌细胞靶向的仿细胞微囊的方法，包括以下步骤:
1)在培养有人脐带静脉内皮细胞的培养盘中加入20μ?浓度为lmg/mL的细胞松弛素b溶液，37°C下孵育30min ;磷酸盐缓冲液洗数次，胰酶消化收集细胞，涡旋处理所得细胞，离心取上清液，得到仿细胞微囊悬液；
2)取Img步骤I)所得的仿细胞微囊悬液加入到末端修饰有醛基的核酸适配体溶液中，使核酸适配体的浓度为lKg/mL ;37°C下孵育4h ;离心收集所得微粒，洗涤，得到核酸适配体修饰的仿细胞微囊；
3)取200μg步骤2)所得的仿细胞微囊加入到盐酸阿霉素溶液中，使盐酸阿霉素的浓度为40~20(^g/mL，37°C孵育3~24h ;离心收集所得微粒，洗涤，得到装载盐酸阿霉素的癌细胞靶向性仿细胞微囊。
[0009]本发明中，所说的核酸适配体为AS1411，其序列:5’ -GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGT-GGTGG。
[0010] 本发明的原理:在仿细胞微囊中加入核酸适配体AS1411溶液，通过适配体所带的醛基与仿细胞微囊表面蛋白的氨基反应将AS1411接枝到仿细胞微囊表面。再将其与盐酸阿霉素溶液混合，进行药物负载。核酸适配体与盐酸阿霉素分别赋予仿细胞微囊以靶向与杀伤癌细胞的功能。
[0011]本发明的有益效果在于:
本发明工艺过程简单，制备速度快，可控性好，材料来源于天然细胞，具有优越的生物相容性和传递性能；利用带有活性反应基团的核酸适配体分子与仿细胞微囊进行原位反应，节省原料且可通过控制投料比调控微囊表面适配体的密度；得到的仿细胞微囊由于同时具有核酸适配体与盐酸阿霉素，具有了更好的靶向与杀伤癌细胞的性质。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为标记有细胞膜红色荧光探针DiI的仿细胞微囊的荧光照片，微囊分散在磷酸盐缓冲液中。
[0013]图2是接枝有红色染料Cy3标记的核酸适配体修饰的仿细胞微囊的荧光照片，微囊分散在磷酸盐缓冲液中。
[0014]图3是癌细胞靶向性微囊负载盐酸阿霉素后的荧光照片，微胶囊分散于磷酸盐缓冲液中。
[0015]图4是实施例1-3所得的负载盐酸阿霉素的癌细胞靶向性微囊的载药量与药物浓度的关系。
[0016]图5是实施例4-6所得的负载盐酸阿霉素的癌细胞靶向性微囊的载药量与孵育时间的关系。
【具体实施方式】
[0017]以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
[0018]实施例1
I)在培养有人脐带静脉内皮细胞的培养盘中加入20 μ?细胞松弛素b溶液(浓度为lmg/mL), 37°C下孵育30min后用磷酸盐缓冲液洗三次，胰酶消化，离心收集细胞；涡旋处理所得细胞Imin ;离心收集所得上清液即为仿细胞微囊悬液。
[0019]将20(^g上述所得的仿细胞微囊分散在ImL磷酸盐缓冲液中；向其中加入lOPLlmg/mL的细胞膜红色染料Dil，使其混合均匀，孵育15min ;将所得仿细胞微囊离心洗涤数次以去除未标记上的染料；分散在磷酸盐缓冲液中的仿细胞微囊的荧光照片见图1。
[0020]2)取Img步骤I)所得的仿细胞微囊悬液加入到末端修饰有醛基的核酸适配体溶液中，使核酸适配体的浓度为lKg/mL，37°C下孵育4h，离心、磷酸盐缓冲液洗数次；得到核酸适配体修饰的仿细胞微囊的荧光照片见图2。
[0021]3)取200 μg步骤2)所得的仿细胞微囊加入到盐酸阿霉素溶液中，使盐酸阿霉素的浓度为4(^g/mL，37°C孵育12h ;离心磷酸盐缓冲液洗三次。得到装载盐酸阿霉素的癌细胞靶向性仿细胞微囊的荧光照片见图3。根据紫外光谱图中543nm处的吸光度得到该微囊的载药量为1.5Pg，见图4。[0022]实施例2
同实施例1，区别在于步骤3)，取200 μδ步骤2)所得的仿细胞微囊加入到盐酸阿霉素溶液中，使盐酸阿霉素的浓度为8(^g/mL，37°C孵育12h ;离心磷酸盐缓冲液洗三次。得到装载盐酸阿霉素的癌细胞靶向性仿细胞微囊。根据紫外光谱图中543nm处的吸光度得到该微囊的载药量为2.Mg，见图4。
[0023]实施例3
同实施例1，区别在于步骤3)，取200 μδ步骤2)所得的仿细胞微囊加入到盐酸阿霉素溶液中，使盐酸阿霉素的浓度为20(^g/mL，37°C孵育12h ;离心磷酸盐缓冲液洗三次。得到装载盐酸阿霉素的癌细胞靶向性仿细胞微囊。根据紫外光谱图中543nm处的吸光度得到该微囊的载药量为6.5Pg，见图4。
[0024]实施例4
同实施例1，区别在于步骤3)，取200 μδ步骤2)所得的仿细胞微囊加入到盐酸阿霉素溶液中，使盐酸阿霉素的浓度为20(^g/mL，37°C孵育3h ;离心磷酸盐缓冲液洗三次。得到装载盐酸阿霉素的癌细胞靶向性仿细胞微囊。根据紫外光谱图中543nm处的吸光度得到该微囊的载药量为2.Mg，见图5。
[0025]实施例5
同实施例1，区别在于步骤3)，取200 μδ步骤2)所得的仿细胞微囊加入到盐酸阿霉素溶液中，使盐酸阿霉素的浓 度为20(^g/mL，37°C孵育24h ;离心磷酸盐缓冲液洗三次。得到装载盐酸阿霉素的癌细胞靶向性仿细胞微囊。根据紫外光谱图中543nm处的吸光度得到该微囊的载药量为7.0Pg，见图5。
【权利要求】
1.一种制备癌细胞靶向性仿细胞微囊的方法，包括以下步骤: 1)在培养有人脐带静脉内皮细胞的培养盘中加入20μ?浓度为lmg/mL的细胞松弛素b溶液，37°C下孵育30min ;磷酸盐缓冲液洗数次，胰酶消化收集细胞，涡旋处理所得细胞，离心取上清液，得到仿细胞微囊悬液； 2)取Img步骤I)所得的仿细胞微囊悬液加入到末端修饰有醛基的核酸适配体溶液中，使核酸适配体的浓度为lKg/mL ;37°C下孵育4h ;离心收集所得微粒，洗涤，得到核酸适配体修饰的仿细胞微囊； 3)取200μg步骤2)所得的仿细胞微囊加入到盐酸阿霉素溶液中，使盐酸阿霉素的浓度为40~20(^g/mL，37°C孵育3~24h ;离心收集所得微粒，洗涤，得到装载盐酸阿霉素的癌细胞靶向性仿细胞微囊。
2.根据权利要求1所述的制备癌细胞靶向性仿细胞微囊的方法，其特征在于所说的核酸适配体为 AS1411，其序 列:5’ -GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGT-GGTGG。
【文档编号】A61K47/46GK103585133SQ201310566240
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】毛峥伟, 张元洪 申请人:浙江大学