一种从芡实加工废液（去涩液）中制备抗菌物质的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从芡实加工废液（去涩液）中制备抗菌物质的方法，属于食品生物【技术领域】。主要技术方法如下：先采用冰冻匀浆法对芡实加工废液（去涩液）中的芡实外壳皮细胞进行处理；接着，采用现代超声法进一步裂解芡实外壳皮细胞；最后，抑菌实验证实从芡实加工废液（去涩液）中制备的物质有明显的广谱抑菌活性。其制备方法简单，生产成本低廉，抑菌活性高，环保效应好。该物质具有制备成抑菌膏剂，抑菌喷剂，食品防腐剂，各种抑菌卫生用品（香皂，洗手液，沐浴露等等）等商品的应用前景。
【专利说明】一种从芡实加工废液(去涩液)中制备抗菌物质的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品生物学【技术领域】，具体涉及一种从芡实加工废液(去涩液)中制备抗菌物质的方法。
[0002]发明背景
芡实为一年生，水生草本植物，睡莲科。其广泛分布于我国南北各地，南至海南省北至黑龙江都有生长，其中尤以江苏、安徽、山东等省份的产量居多，品质为佳。芡实含有多种营养成分，其传统功效有养血安神、益肾固精、去湿健脾、止泻止滞等。近年的研究表明，芡实还具有除了上述功能以外的一些功效，如改善心脏缺血功能，提高机体抗氧化能力等等。
[0003]芡实是一种具有多种营养和保健功能的食品，其传统的食用方法多用于熬粥或制作汤羹食用，亦可碾磨成粉后制成糊状食用，这些传统食法的原料都是芡实的种仁即芡实米。近年来，一种新的芡实食用方法(休闲吃法)在茶吧、棋牌室、饮吧等高档娱乐消费场所悄然流行。用于休闲吃饭的芡实处理方法简单，只需要用去涩机对芡实进行去涩处理后(因为芡实种子的外壳种皮口感很涩)，直接用开水或微波炉加热3-4分钟，然后像磕瓜子一样，磕开芡实壳后食用其鲜嫩、润滑的果仁。
[0004]随着芡实休闲吃饭的流行，市场对去涩后的芡实需求处于急速上升阶段，江苏扬州、金湖一带，安徽天长一带的芡实企业的主要产品之一就是“去涩后的芡实”。然而，企业在生产芡实制品的过程中，产生了大量的芡实废液(去涩液)，造成了生态环境的污染和资源的浪费。本发明利用天然产物分离、纯化的方法，从这些芡实去涩液中制备了具有明显抑菌活性的物质。该发明不但挖掘了芡实的新的价值，而且提供了一种新的天然抑菌剂的制备方法，因此，我们可以说该发明具有很好的社会效益、经济效益和环保效益，具有潜在的商品化生产的前景。
【发明内容】
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[0005](一)本发明要解决的技术问题:
本发明主要提供一种从从芡实加工废液(去涩液)中制备抗菌物质的方法，其具体包括(I)芡实废液(去涩液)的回收、处理方法；(2)芡实废液(去涩液)中抗菌物质的制备方法的确定。
[0006](二)本发明的技术方案:
(I)收集9-11月份安徽、江苏等地芡实加工企业的直接排放的芡实加工废液(去涩液)。
[0007](2)芡实去涩液12000 rpm,离心5分钟，收集离心后的芡实去涩液上清(命名为芡实离心上清1，-20°C保存备用)和芡实去涩液的沉淀(芡实外壳皮及外壳皮细胞)。
[0008](3)称取芡实去涩液的沉淀加入PBS溶液，其中芡实去涩液的沉淀与PBS溶液的比为10:40g/ml，搅拌均匀后，放在_20°C冰冻处理，得到芡实去涩液冰冻物。
[0009](4)芡实去涩液冰冻物弄碎成3-4个大块后，进行间歇式匀浆处理(先匀浆10秒，停30秒，连续3-6次，之后再匀浆30秒，停10秒，连续4-8次)，以达到匀浆芡实外壳皮组织和冻融芡实外壳皮两重效果。[0010](5)采用超声波对芡实去涩液的匀浆液中的外壳皮细胞进行破碎15分钟(超声3秒，停3秒)，使细胞中的活性物质从细胞中游离出来。
[0011](6)芡实去涩液沉淀物的超声裂解物在12000 rpm条件下，离心10分钟后，收集离心上清(命名为芡实离心上清2)。
[0012](7)合并芡实离心上清液I和芡实离心上清2得到芡实去涩液上清，并测定芡实上清液抑制革兰氏阳性菌(以金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为例)和革兰氏阴性菌(以沙门氏菌和副溶血弧菌为例)繁殖的能力。 [0013]其中步骤(3)中在冷冻处理之前在离心后沉淀物中加入PBS溶液，在-20°C过夜处理12小时左右，其中沉淀物与PBS溶液的用量比例为10:40 g/ml。
[0014](三)本发明其有益效果是:
芡实去涩液是一种芡实生产企业的废弃液，本发明不但研究出从芡实去涩液中制备一种新型抑菌剂的方法，而且该发明还具有诸多有益效果。具体效益如下:
(I)经济效益:使芡实加工废液(去涩液)变废为宝，增加了芡实的附加值，提高了芡实生产企业的经济效益。
[0015](2)环保效益:改变了芡实加工废液直接排放，污染环境的状态，减少了其对生态环境的直接污染，具有明显的环保效益。
[0016](3)社会效益:发明了一种新的天然抗菌剂的生产方法，为下一步开发新型环保抑菌剂奠定了基础。这必将造福百姓，带来较好的社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1:芡实去涩液上清抑制金黄色葡萄球菌繁殖活性的确定(见实施例1)
A:阴性对照；B:芡实去涩液上清；C:1:2稀释的芡实去涩液上清；D:1:4稀释的芡实去涩液上清；E:1:8稀释的芡实去涩液上清.图2:芡实去涩液上清抑制枯草芽孢杆菌繁殖活性的确定(见实施例2)
A:阴性对照；B:芡实去涩液上清；C:1:2稀释的芡实去涩液上清；D:1:4稀释的芡实去涩液上清；E:1:8稀释的芡实去涩液上清.图3:芡实去涩液上清抑制沙门氏菌繁殖活性的确定(见实施例3)
A:阴性对照；B:芡实去涩液上清；C:1:2稀释的芡实去涩液上清；D:1:4稀释的芡实去涩液上清；E:1:8稀释的芡实去涩液上清.图4:芡实去涩液上清抑制副溶血弧菌繁殖活性的确定(见实施例4)
A:阴性对照；B:芡实去涩液上清；C:1:2稀释的芡实去涩液上清；D:1:4稀释的芡实去涩液上清；E:1:8稀释的芡实去涩液上清。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
I芡实废液(去涩液)的回收、处理方法
收集芡实生产企业(天长市铜城镇龙岗龙腾芡实有限公司)直接排放的新鲜芡实去涩液。芡实的去涩液中主要固体成分为芡实种子外壳皮，这些外壳皮的细胞中含有一些具有特殊生物活性的天然成分。[0019]芡实去涩液上清的制备方法
芡实去涩液进行离心(12000 rpm, 5分钟)，收集离心上清(命名为芡实离心上清I )，收集离心沉淀，获得芡实外壳皮及外壳皮细胞。取10克离心后沉淀加入40毫升PBS溶液，在_20°C过夜处理(12小时左右)。次日，将芡实外壳皮细胞冰冻物进行间歇式匀浆(先匀浆10秒，停30秒，连续3-6次，之后再匀浆30秒，停10秒，连续4-8次)。匀浆结束后，匀浆液进行超声波处理15分钟(超声3秒，停3秒)。收集芡实超声波裂解液，12000 rpm,离心10分钟后，收集离心上清(命名为芡实离心上清2)。
[0020]合并芡实离心上清I和芡实离心上清2得到芡实去涩液上清。
[0021]芡实去涩液上清抑制金黄色葡萄球菌繁殖的活性确定(图1)
利用平板抑菌圈法，测定芡实去涩液上清抑制金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的繁殖能力。
[0022]先配制营养琼脂培养基，其组成为:蛋白胨占I %，牛肉粉占0.3 %，氯化钠占
0.5%，琼脂占I %，水占97.2 %。营养琼脂培养基在121 °C，灭菌21分钟后，放入超净台中冷却。待温度降至50 °C左右，加入90微升培养过夜的金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的培养液，摇匀后铺平板。
[0023]半小时后，待琼脂凝固，用打孔器在含有菌液的平板上按照五孔梅花图形进行打孔(孔径约5毫米)。给这五个孔分别编号为A，B，C，D, E,在A孔中加入PBS (阴性对照孔);B孔中加入芡实去涩液上清；(:孔中加入1:2稀释的芡实去涩液上清山孔中加入1:4稀释的芡实去涩液上清；E孔中加入1:8稀释的芡实去涩液上清。
[0024]把加样后的平板放入37 °C培养箱，8-16小时后观察所加样品孔附近抑菌圈的有无。实验结果表明:芡实去涩液上清原液抑制金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径为I cm左右。
[0025]实施例2
I芡实废液(去涩液)的回收、处理方法
收集芡实生产企业直接排放的新鲜芡实去涩液。芡实的去涩液中主要固体成分为芡实种子外壳皮，这些外壳皮的细胞中含有一些具有特殊生物活性的天然成分。
[0026]芡实去涩液上清的制备方法
芡实去涩液进行离心(12000 rpm, 5分钟)，收集离心上清(命名为芡实离心上清1)，收集离心沉淀，获得芡实外壳皮及外壳皮细胞。取10克离心后沉淀加入40毫升PBS溶液，在-20°C过夜处理(12小时左右)。次日，将芡实外壳皮细胞冰冻物进行间歇式匀浆(先匀浆10秒，停30秒，连续3-6次，之后再匀浆30秒，停10秒，连续4-8次)。匀浆结束后，匀浆液进行超声波处理15分钟(超声3秒，停3秒)。收集芡实超声波裂解液，12000 rpm,离心10分钟后，收集离心上清(命名为芡实离心上清2)。
[0027]合并芡实离心上清I和芡实离心上清2得到芡实去涩液上清。
[0028]芡实去涩液上清抑制枯草芽孢杆菌繁殖的活性确定(图2)
利用平板抑菌圈法，测定芡实去涩液上清抑制枯草芽孢杆菌(ATCC6633)繁殖能力。
[0029]先配制营养琼脂培养基，其组成为:蛋白胨占I %，牛肉粉占0.3 %，氯化钠占
0.5%，琼脂占I %，水占97.2 %。营养琼脂培养基在121 °C，灭菌21分钟后，放入超净台中冷却。待温度降至50 °C左右，加入90微升培养过夜的枯草芽孢杆菌(ATCC6633)的培养液，摇匀后铺平板。
[0030]半小时后，待琼脂凝固，用打孔器在含有菌液的平板上按照五孔梅花图形进行打孔(孔径约5毫米)。给这五个孔分别编号为A，B，C，D, E,在A孔中加入PBS (阴性对照孔);B孔中加入芡实去涩液上清；(:孔中加入1:2稀释的芡实去涩液上清山孔中加入1:4稀释的芡实去涩液上清；E孔中加入1:8稀释的芡实去涩液上清。
[0031]把加样后的平板放入37 °C培养箱，8-16小时后观察所加样品孔附近抑菌圈的有无。实验结果表明:芡实去涩液上清原液抑制抑制枯草芽孢杆菌的直径在1.2 cm左右。
[0032]实施例3
I芡实废液(去涩液)的回收、处理方法
收集芡实生产企业直接排放的新鲜芡实去涩液。芡实的去涩液中主要固体成分为芡实种子外壳皮，这些外壳皮的细胞中含有一些具有特殊生物活性的天然成分。
[0033]芡实去涩液上清的制备方 法
芡实去涩液进行离心(12000 rpm, 5分钟)，收集离心上清(命名为芡实离心上清1)，收集离心沉淀，获得芡实外壳皮及外壳皮细胞。取10克离心后沉淀加入40毫升PBS溶液，在-20°C过夜处理(12小时左右)。次日，将芡实外壳皮细胞冰冻物进行间歇式匀浆(先匀浆10秒，停30秒，连续3-6次，之后再匀浆30秒，停10秒，连续4-8次)。匀浆结束后，匀浆液进行超声波处理15分钟(超声3秒，停3秒)。收集芡实超声波裂解液，12000 rpm,离心10分钟后，收集离心上清(命名为芡实离心上清2)。
[0034]合并芡实离心上清I和芡实离心上清2得到芡实去涩液上清。
[0035]芡实去涩液上清抑制沙门氏菌繁殖的活性确定活性的确定(图3)
利用平板抑菌圈法，测定芡实去涩液上清抑制沙门氏菌(野生型菌株007)繁殖能力。
[0036]先配制营养琼脂培养基，其组成为:蛋白胨占I %，牛肉粉占0.3 %，氯化钠占
0.5%，琼脂占I %，水占97.2 %。营养琼脂培养基在121 °C，灭菌21分钟后，放入超净台中冷却。待温度降至50 °C左右，加入90微升培养过夜的沙门氏菌(野生型菌株007)的培养液，摇匀后铺平板。
[0037]半小时后，待琼脂凝固，用打孔器在含有菌液的平板上按照五孔梅花图形进行打孔(孔径约5毫米)。给这五个孔分别编号为A，B，C，D, E,在A孔中加入PBS (阴性对照孔);B孔中加入芡实去涩液上清；(:孔中加入1:2稀释的芡实去涩液上清山孔中加入1:4稀释的芡实去涩液上清；E孔中加入1:8稀释的芡实去涩液上清。
[0038]把加样后的平板放入37 °C培养箱，8-16小时后观察所加样品孔附近抑菌圈的有无。实验结果表明:芡实去涩液上清原液抑制抑制沙门氏菌的最大抑菌直径为1.2 cm左右。
[0039]实施例4
I芡实废液(去涩液)的回收、处理方法
收集芡实生产企业直接排放的新鲜芡实去涩液。芡实的去涩液中主要固体成分为芡实种子外壳皮，这些外壳皮的细胞中含有一些具有特殊生物活性的天然成分。
[0040]芡实去涩液上清的制备方法
芡实去涩液进行离心(12000 rpm, 5分钟)，收集离心上清(命名为芡实离心上清1)，收集离心沉淀，获得芡实外壳皮及外壳皮细胞。取10克离心后沉淀加入40毫升PBS溶液，在-20°C过夜处理(12小时左右)。次日，将芡实外壳皮细胞冰冻物进行间歇式匀浆(先匀浆10秒，停30秒，连续3-6次，之后再匀浆30秒，停10秒，连续4-8次)。匀浆结束后，匀浆液进行超声波处理15分钟(超声3秒，停3秒)。收集芡实超声波裂解液，12000 rpm,离心10分钟后，收集离心上清(命名为芡实离心上清2)。
[0041]合并芡实离心上清I和芡实离心上清2得到芡实去涩液上清。
[0042]芡实去涩液上清抑制副溶血弧菌繁殖的活性确定(图4)
利用平板抑菌圈法，测定芡实去涩液上清抑制副溶血弧菌(ATCC17802)的繁殖能力。
[0043]先配制营养琼脂培养基，其组成为:蛋白胨占I %，牛肉粉占0.3 %，氯化钠占3.5%，琼脂占I %，水占94.2 %。营养琼脂培养基在121 °C，灭菌21分钟后，放入超净台中冷却。待温度降至50 °C左右，加入90微升培养过夜的副溶血弧菌(ATCC17802)的培养液，摇匀后铺平板。
[0044]半小时后，待琼脂凝固，用打孔器在含有菌液的平板上按照五孔梅花图形进行打孔(孔径约5毫米)。给这五个孔分别编号为A，B，C，D, E,在A孔中加入PBS (阴性对照孔);B孔中加入芡实去涩液上清；(:孔中加入1:2稀释的芡实去涩液上清山孔中加入1:4稀释的芡实去涩液上清；E孔中加入1:8稀释的芡实去涩液上清。
[0045]把加样后的平板放入37 °C培养箱，8-16小时后观察所加样品孔附近抑菌圈的有无。实验结果表明:芡实去涩液粗提物原液抑制副溶血弧菌的抑菌直径在1.0 cm左右。
【权利要求】
1.一种从芡实加工废液去涩液中制备抗菌物质的方法，按照下述步骤进行: (1)收集芡实加工企业的直接排放的芡实加工废液去涩液； (2)芡实去涩液12000rpm,离心5分钟，收集离心后的芡实去涩液上清，命名为芡实离心上清1，-20°C保存备用，并收集芡实去涩液的沉淀； (3)称取芡实去涩液的沉淀加入PBS溶液，其中芡实去涩液的沉淀与PBS溶液的比为10:40g/ml，搅拌均匀后，放在_20°C冰冻处理，得到芡实去涩液冰冻物； (4)芡实去涩液冰冻物弄碎成3-4个大块后，进行间歇式匀浆处理:先匀浆10秒，停30秒，连续3-6次，之后再匀浆30秒，停10秒，连续4-8次，以达到匀浆芡实外壳皮组织和冻融芡实外壳皮两重效果； (5)采用超声波对芡实去涩液的匀浆液中的外壳皮细胞进行破碎15分钟:超声3秒，停3秒，使细胞中的活性物质从细胞中游离出来； (6)芡实去涩液沉淀物的超声裂解物在12000rpm条件下，离心10分钟后，收集离心上清，命名为芡实离心上清2 ; (7)合并芡实离心上清液I和芡实离心上清2得到芡实去涩液上清。
2.根据权利要求1所述的从芡实加工废液去涩液中制备抗菌物质的方法，其特征在于其中步骤(3)中在冷冻处理之前在离心后沉淀物中加入PBS溶液，在-20°C过夜处理12小时左右，其中沉 淀物与PBS溶液的用量比例为10:40 g/ml。
【文档编号】A61K36/62GK103638113SQ201310617903
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】蔡梅红 申请人:江苏大学