一种脂肪乳剂及其制备方法及其应用及方法、以及一种血栓形成前状态动物模型的制作方法
【专利摘要】本发明提出了一种脂肪乳剂，包括：胆固醇、猪油、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶、吐温80、丙二醇和水，将所述脂肪乳剂应用于建立家兔血栓形成前状态动物模型中，周期短，制得的血栓形成前状态动物模型满足实验需求。
【专利说明】一种脂肪乳剂及其制备方法及其应用及方法、以及一种血栓形成前状态动物模型
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物实验领域，特别是指一种脂肪乳剂，本发明还涉及一种脂肪乳及的制备方法，本发明还涉及一种脂肪乳剂在建立家兔血栓形成前状态动物模型的应用及应用方法，本发明还涉及一种血栓形成前状态动物模型。
【背景技术】
[0002]高血脂症及/或血栓形成被公认为是动脉粥样硬化(AS)的危险因子，但其致病机理非常复杂，有些方面还不是十分清楚，为了阐明其致病机理，血栓形成前状态(PST)动物模型的制作尤为重要，目前，动物实验中常采用高脂饲料喂养制备血栓形成前状态动物模型，该方法对于大、小鼠杂食性动物的制备效果尚可，但由于鼠类采血量极少，不能同时检测数个相关的指标，并且受到动物食性、剂量、周期等因素的影响，造成血栓形成前状态模型质量不稳定，且复制时间较长(达3-4个月)，因而限制了其在制备动物模型中的应用；而采用高脂饲料喂养制备家兔血栓形成前状态动物模型可以避免这方面缺陷，可以从心脏一次取血达10ml，能够同时检测几个相关指标，但由于动物食性等因素造成剂量不容易准确投喂，并且喂养周期长，给实验带来一定的困难。
【发明内容】
[0003]本发明的一个目的是提出一种脂肪乳剂，制备简单，成本低。
[0004]本发明的另一个目的是提出一种脂肪乳剂的制备方法，过程简单，适合推广。
[0005]本发明的另一目的是提出一种脂肪乳剂在建立家兔血栓形成前状态动物模型的应用及应用方法，过程简单，能够缩短建立时间，提高实验效率。
[0006]本发明的另一个目的是提出一种血栓形成前状态动物模型，建立简单，满足实验的需求。
[0007]本发明的技术方案是这样实现的:一种脂肪乳剂，包括:胆固醇、猪油、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶、吐温80、丙二醇和水。
[0008]优选的，所述脂肪乳剂中，主要组分的浓度为，胆固醇100g/L，猪油200g/L，胆酸钠20g/L，丙基硫氧嘧啶10g/L。
[0009]所述脂肪乳剂的制备方法，包括以下步骤:
[0010]a、取80份猪油至容器中，加热至融化；
[0011]b、继续加入40份胆固醇并使之融化；
[0012]C、继续加入8份胆酸钠和4份丙基硫氧嘧啶，搅匀；
[0013]d、加入水、84-88份吐温80和83-84份丙二醇，搅匀；
[0014]e、继续加入水至主要组分达到设定的浓度。
[0015]所述脂肪乳剂的在建立家兔血栓形成前状态动物模型中的应用。
[0016]所述脂肪乳剂在建立家兔血栓形成前状态动物模型的应用，包括以下步骤:[0017]I)家兔除给予普通饲料150g/只/天喂养外，还取所述脂肪乳剂按照2ml/kg.d进行灌胃，每天一次，持续两周；
[0018]2)灌胃前后分别从耳中央动脉6ml(采血前禁饮食12h)，然后分别进行如下操作:
[0019]2.1)取其中 3ml 用 20g/L EDTA_Na2 抗凝(抗凝剂:标本=1:9), 2500r/min 离心5min，取血浆低温冰箱保存，取部分红细胞测定:膜流动性(Μ-Flu)、E-MDA (红细胞-丙二醛)和E-SOD (红细胞超氧化物歧化酶)含量；
[0020]2.2)将剩下的红细胞酶法测定M-TC含量；
[0021]2.3)取血浆放兔法测定TXB2A-Keto-PGFp ET,酶联免疫吸附双抗体夹心法测定GMP-140，发色底物法测定t-PA、PAI ；
[0022]2.4)另采3ml直接离心测定血清酶法TC、TG、APOA1、ΑΡ0Β，免疫浊度法vWF，
[0023]2.5)另取部分动脉血高效薄层层析法测定PAF含量；
[0024]2.6)灌胃两周后处死动物做肉眼及光镜观察；
[0025]3)将灌胃前后测定的各项指标进行对比和分析。
[0026]其中，步骤2.1中，膜流动性(M-Flu)采用如下方法进行测定:
[0027]用PBS洗涤红血球2次配成4*107细胞/ml浓度的红细胞悬液，按照1:1与DPH(荧光探针)标记液混匀，于25°C保温30min，离心弃去标记残液，用PBS洗涤细胞2次，再用PBS稀释成2ml悬液，在25°C下采用荧光光度计分别测定与激发偏振光振动方向平行、垂直时荧光偏振强度，根据公式计算·出M-Flu。
[0028]其中，步骤2.2中，采用如下方法进行测定:
[0029]将剩下的红细胞用生理盐水洗涤后，溶于0.25nmol/L的CaCl2溶液中，于4°C置30min至完全溶血，然后以1400r/min离心10min，去掉溶血液，沉淀物用PH值为7.4的
0.01mmol/L磷酸盐缓冲液反复洗涤，再按所取的细胞体积加入50g/L氯化钠，先在先在漩涡混合器震动匀浆再用500r/min的速度离心5min，以上清液IOum测定红细胞M-TC含量。
[0030]一种血栓形成前状态动物模型，通过除给予家兔普通饲料150g/只/天喂养外，还采用所述脂肪乳剂，按照2ml/kg.d进行灌胃，每天一次，持续两周制备形成。
[0031]本发明的有益特点主要体现在:本发明公开了一种脂肪乳剂，制作简单，成本低，使用方便，特别是在建立家兔血栓形成前状态动物模型中的应用，能够在2周内迅速制造出血栓形成前状态动物模型，周期短，制备过程中剂量投放准确等，本发明提供的脂肪乳剂，血栓形成前状态动物模型及其建立的方法，均简单易行，能够为动物实验提供更实用的方法，促进相关疾病的研究进展。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]图1为本发明一个实施例家兔灌胃2周后取主动脉做光镜检查的光镜图；
[0034]图2为本发明一个实施例家兔灌胃2周后取主动脉做电镜检查的电镜图；
[0035]图3为本发明一个实施例家兔灌胃2周后取主动脉做电镜检查的另一电镜图。【具体实施方式】
[0036]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037]一种脂肪乳剂，包括:胆固醇、猪油、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶、吐温80、丙二醇和水。
[0038]优选的，所述脂肪乳剂中，主要组分的浓度为，胆固醇100g/L，猪油200g/L，胆酸钠20g/L，丙基硫氧嘧啶10g/L。
[0039]脂肪乳剂的制备方法，包括以下步骤:
[0040]a、取80份猪油至容器中，加热至融化；
[0041]b、继续加入40份胆固醇并使之融化；
[0042]C、继续加入8份胆酸钠和4份丙基硫氧嘧啶，搅匀；
[0043]d、加入水、84-88份吐温80和83-84份丙二醇，搅匀；
[0044]e、继续加入水至主要组分达到设定的浓度。
[0045]脂肪乳剂的在建立家兔血栓形成前状态动物模型中的应用。
[0046]脂肪乳剂在建立家兔血栓形成前状态动物模型的应用，包括以下步骤:
[0047]I)家兔除给予普通饲料150g/只/天喂养外，还取所述脂肪乳剂按照2ml/kg.d进行灌胃，每天一次，持续两周；
[0048]2)灌胃前后分别从耳中央动脉6ml (采血前禁饮食12h)，取其中3ml用20g/LEDTA-Na2抗凝(抗凝剂:标本=1:9), 2500r/min离心5min,取血衆低温冰箱保存(先取少量血液测定Hb含量)，取部分红细胞测定:膜流动性(M-Flu)，用PBS洗涤红血球2次配成4*107细胞/ml浓度的红细胞悬液，按照1:1与DPH (荧光探针)标记液混匀，于25°C保温30min，离心弃去标记残液，用PBS洗涤细胞2次，再用PBS稀释成2ml悬液，在25°C下采用荧光光度计分别测定与激发偏振光振动方向平行、垂直时荧光偏振强度，根据公式计算出M-Flu ；E-MDA,参考Uchlyma等方法提取MDA前质，再按钟福孙等提供的硫代巴比妥酸比色法测定E-MDA含量；E-S0D含量采用邻苯三酚自氧化法测定。
[0049]将剩下的红细胞用生理盐水洗涤后，溶于0.25nmol/L的CaCl2溶液中，(体积比1:1)，于4°C置30min至完全溶血，然后以1400r/min离心10min，去掉溶血液，沉淀物用PH值为7.4的0.01mmol/L磷酸盐缓冲液反复洗涤，再按所取的细胞体积加入50g/L氯化钠，先在先在漩涡混合器震动匀浆再用500r/min的速度离心5min，以上清液IOum测定红细胞M-TC含量，取血浆放兔法测定TXB2A-Keto-PGFp ET,酶联免疫吸附双抗体夹心法测定GMP-140，发色底物法t-PA、PAI，邻苯三酚自氧化法S0D。
[0050]另采3ml直接离心酶法测定血清TC、TG、APOA1、APOB，免疫浊度法vWF。另取部分动脉血采用PAF高效薄层层析法测定PAF含量；灌胃两周后处死动物做肉眼及光镜观察。
[0051]3)将灌胃前后测定的各项指标进行对比和分析。
[0052]结果1:根据以上步骤，灌胃前后测定的血清TC、TG、ΑΡ0ΑΙ、ΑΡ0Β、vWF、血浆TXB2、6-Keto-PGFla、ET、GMP-140、t-PA、PA1、红细胞M-Flu、M-TC、E-MDA、E-S0D 水平及 PAF 活性的
比较，得到如表1所示灌胃前后测定的家兔各项指标比较(实施例中所有数据均采用S土 S表示，采用自身配对t检验方法进行统计)
[0053]表1:灌胃前后测定的家兔各项指标比较G土S，11=20)
【权利要求】
1.一种脂肪乳剂，其特征在于，包括:胆固醇、猪油、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶、吐温80、丙二醇和水。
2.如权利要求1中所述脂肪乳剂，其特征在于:主要组分的浓度为，胆固醇100g/L，猪油200g/L，胆酸钠20g/L，丙基硫氧嘧啶10g/L。
3.如权利要求1或2中所述脂肪乳剂的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: a、取80份猪油至容器中，加热至融化； b、继续加入40份胆固醇并使之融化； C、继续加入8份胆酸钠和4份丙基硫氧嘧啶，搅匀； d、加入水、84-88份吐温80和83-84份丙二醇，搅匀； e、继续加入水至主要组分达到设定的浓度。
4.如权利要求1或2中所述脂肪乳剂的在建立家兔血栓形成前状态动物模型中的应用。
5.如权利要求4中所述脂肪乳剂在建立家兔血栓形成前状态动物模型的应用，其特征在于:包括以下步骤: 1)家兔除给予普通饲料150g/只/天喂养外，还取所述脂肪乳剂按照2ml/kg.d进行灌胃，每天一次，持续两周； 2)灌胃前后分别从耳中央动脉采血6ml，然后分别进行如下操作: 2.1)取其中3ml用20g/L EDTA-Na2抗凝，2500r/min离心5min，取血浆低温冰箱保存，取部分红细胞测定:膜流动性(Μ-F`lu)、E-MDA和E-SOD含量； 2.2)将剩下的红细胞测定M-TC含量； 2.3)取血浆放兔法测定 TXB2A-Keto-PGFp ET、GMP-140, t_PA、PAI ； 2.4)另采3ml直接离心测定血清TC、TG、APOA1、APOB、SOD ； 2.5)另取部分动脉血测定PAF含量； 2.6)灌胃两周后处死动物做肉眼及光镜观察； 3)将灌胃前后测定的各项指标进行对比和分析。
6.如权利要求5中所述脂肪乳剂在建立家兔血栓形成前状态动物模型的应用，其特征在于:步骤2.1中，膜流动性(M-Flu)采用如下方法进行测定: 用PBS洗涤红血球2次配成4*107细胞/ml浓度的红细胞悬液，按照1:1与DPH (荧光探针)标记液混匀，于25°C保温30min，离心弃去标记残液，用PBS洗涤细胞2次，再用PBS稀释成2ml悬液，在25°C下采用荧光光度计分别测定与激发偏振光振动方向平行、垂直时荧光偏振强度，根据公式计算出M-Flu。
7.如权利要求5中所述脂肪乳剂在建立家兔血栓形成前状态动物模型的应用，其特征在于:步骤2.2中，采用如下方法进行测定: 将剩下的红细胞用生理盐水洗涤后，溶于0.25nmol/L的CaCl2溶液中，于4°C置30min至完全溶血，然后以1400r/min离心10min，去掉溶血液，沉淀物用PH值为7.4的0.01mmol/L磷酸盐缓冲液反复洗涤，再按所取的细胞体积加入50g/L氯化钠，先在超声波绞碎仪上超生匀浆再用500r/min的速度离心5min，以上清液IOum测定红细胞M-TC含量。
8.—种血栓形成前状态动物模型，其特征在于:通过如下方法制备形成:给予家兔普通饲料150g/只/天喂养，并采用权利要求1或2中所述脂肪乳剂，按照2ml/kg.d进行灌胃，每天一次，持续两周制备形成。
【文档编号】A61K9/107GK103860594SQ201310639837
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】马建林 申请人:马建林