基于透明质酸载药纳米粒的聚电解质复合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于透明质酸(HA)载药纳米粒的聚电解质复合物及制备方法和应用，透明质酸基聚合物包载药物形成负电性的纳米粒，再与聚阳离子静电复合形成的聚电解质复合物；透明质酸基聚合物为疏水改性的透明质酸，是由透明质酸HA上的羧基键接疏水侧链形成的接枝型的透明质酸，其中疏水侧链的质量含量占10-60%；疏水侧链的数均分子量为200-20000；复合物中聚阳离子与透明质酸基聚合物的正负电荷比在1.5-6.0之间；HA的数均分子量为2000-200000；复合物的粒径小于500nm。目的是促进药物的口服递送效果，尤其是提高抗肿瘤药物在肿瘤部位的聚集，提高疗效，降低毒副作用。
【专利说明】基于透明质酸载药纳米粒的聚电解质复合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于透明质酸载药纳米粒的聚电解质复合物及制备方法和应用，属于高分子材料在药物制剂中的应用技术。
【背景技术】
[0002]提高难溶性药物的口服生物利用度以及促进药物经肠粘膜的吸收仍是口服药物制剂的难题之一。疏水药物口服消化道吸收的主要屏障，主要来自于药物的低水溶性和消化道上皮细胞的细胞膜的阻碍。直径<500nm的纳米粒，可以通过模拟乳糜微粒的方式，实现纳米粒完整的消化道上皮细胞吸收。通过纳米粒载体的药物包封技术，将疏水性药物负载在纳米粒疏水内核中，可以增强药物的水溶性，但黏膜粘附性差，导致其口服生物利用度一直很低，如(PLGA)或PEG-聚酯两亲性共聚物用于疏水药物的口服。也有pH敏感性的纳米载体设计，负载药物进行口服，胃酸性环境(pH=l.0~3.0)下保护药物不释放，在肠道弱碱性环境(pH=7.4~8.0)下释放药物，促进药物的肠道吸收。但释放到肠道环境中的药物分子仍存在难以通过肠粘膜进入体循环的问题。壳聚糖，作为一种天然的阳离子多糖，具有较好的肠粘膜黏附性，从而有利于促进药物经肠粘膜的吸收。利用壳聚糖和聚谷氨酸通过静电复合形成的PH敏感纳米粒用于胰岛素等亲水性药物的口服研究已被广泛石开究(Y.H.Lin, K.Sonaje, K.M.Lin, J.H.Juang, F.L.Mi, H.ff.Yang, H.ff.Sung, Journal ofControlled Releas e, 2008, 132:141-149),在pH3.0-6.0下两种聚电解质形成纳米粒，将药物包裹在纳米粒内，pH7.4下纳米粒崩解,从而释放药物,但利用聚电解质复合纳米粒革巴向口服递送疏水药物，至今鲜有报道。申请者前期报道了一种含有疏水性药物的聚电解质复合物(201210192591.8)，具有pH敏感性释放载药纳米粒及药物的特性，用于疏水药物的口服给药。本发明在此技术基础上，为了进一步促进药物的口服递送效果，尤其是提高抗肿瘤药物在肿瘤部位的聚集，制备并评价了基于透明质酸的载药纳米粒，对其结构进行了优化，并以结构优化的透明质酸负载药物的纳米粒制备口服聚电解质复合物。不仅具备文献(CN201210192591.8)中所述聚电解质复合物的优点，而且还增加了透明质酸(HA)所具有的肿瘤细胞CD44特异性靶向作用，以及利用肿瘤组织及细胞内透明质酸酶对HA的降解性，进而可以促进复合物对抗肿瘤药物的靶向递送和肿瘤细胞内药物释放功能，因此，尤其适用于抗肿瘤药物的口服给药。此外，研究发现，本发明中的复合物有结肠部位聚集的特性，适于结肠靶向给药应用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种基于透明质酸(HA)载药纳米粒的聚电解质复合物，该聚电解质复合物适用于多种药物口服制剂的开发，尤其适用于抗肿瘤疏水性药物的口服给药，具有较好的应用前景。
[0004]本发明是通过以下技术方案加以实现的:[0005]一种基于透明质酸载药纳米粒的聚电解质复合物，于是透明质酸基聚合物包载药物形成负电性的纳米粒，再与聚阳离子静电复合形成的聚电解质复合物；透明质酸基聚合物为疏水改性的透明质酸，是由透明质酸HA上的羧基键接疏水侧链形成的接枝型的透明质酸，其中疏水侧链的质量含量占10-60% ;疏水侧链的数均分子量在200-20000 ;复合物中聚阳离子与透明质酸基聚合物的正负电荷比在1.5-6.0之间；HA的数均分子量为2000-200000 ;复合物的粒径小于500nm。
[0006]所述HA上疏水侧链选自可降解聚酯、脱氧胆酸、胆固醇或甘草次酸；疏水侧链数均分子量200-600时，HA上疏水侧链接枝率为20-60%，疏水侧链数均分子量600-20000时，HA上疏水侧链接枝率为1_30%。
[0007]所述的疏水侧链为内酯、交酯的均聚物或共聚物可降解聚酯；内酯是进行开环聚合反应的内酯，交酯为丙交酯或乙交酯；
[0008]所述的疏水侧链内酯是己内酯、1，4，8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮、对二氧六环酮的均聚物或它们的共聚物；所述的己疏水侧链内酯是内酯和TOSUO的共聚物，TOSUO单元占疏水侧链的质量百分比为5-30%。
[0009]所述的复合物中的聚阳离子选自壳聚糖及其衍生物、聚赖氨酸、阳离子淀粉衍生物、明胶、阳离子性蛋白质或多肽、阳离子聚酯、阳离子聚磷酸酯、聚乙烯基吡咯盐、N，N-取代的(甲基)丙烯酸酯的均聚物及共聚物。
[0010]所述的聚阳离子选自壳聚糖，壳聚糖的数均分子量为2000-200000。
[0011]本发明的聚电解质复合物，其中所负载`疏水性药物为适于口服的水不溶性药物；优选自抗肿瘤药物、抗菌、抗病毒、消炎类疏水性药物。
[0012]所负载的药物为抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、羟基喜树碱或
姜黄素。
[0013]本发明的聚电解质复合物的制备方法，步骤如下:
[0014]I)将配方量的疏水改性透明质酸与疏水药物溶解到共溶剂中配成溶液，然后装到透析袋中，用PH7.4的PBS透析至溶剂完全被除去，离心，去掉沉淀物，得到负载疏水药物的疏水改性透明质酸的纳米粒水分散液；
[0015]2)将纳米粒水分散液进一步冻干，得到纳米粒的冻干粉；
[0016]3)搅拌下，把I)中得到的负载药物的疏水改性透明质酸的纳米粒水分散液或2)中得到的纳米粒冻干粉再分散到水中形成的纳米粒水分散液，滴加到含有配方量聚阳离子的水溶液中，进行静电复合，制得负载疏水性药物的聚电解质复合物纳米粒的水分散液；
[0017]4)将3)制备的聚电解质复合物纳米粒的水分散液冻干或与冻干稳定剂混合再冻干，得到聚电解质复合物的冻干粉；冻干稳定剂选自甘露醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、右旋糖酐、蔗糖、氯化钠、甘氨酸钠、去氧胆酸钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、山梨醇或右旋糖苷的一种或它们的任意组合。
[0018]本发明的含有疏水性药物的聚电解质复合物的应用，所述的复合物以纳米粒状态分散到水介质中形成的水状液，或其冻干粉装载在胶囊中，或制备成片剂，作为口服药物制剂；或同其它药物或材料复配，用于制备口服药物制剂。
[0019]本发明的优点是通过静电复合形成的含药物的复合物，外部的正电荷壳层能够保护复合物在胃酸性环境下的稳定性，而在肠道的偏碱性环境下复合物解离释放出内含的载药的疏水改性HA纳米粒，通过纳米粒的透肠粘膜作用，促进药物经肠道粘膜的吸收，而且解离的聚阳离子外壳具有黏膜粘附性，可以延长药物在胃肠黏膜的停留时间。因此，适用于疏水药物口服给药，增加疏水性药物的生物利用度，减少注射给要给患者带来的痛苦。
[0020]此外，透明质酸(HA)具有的肿瘤细胞CD44受体特异性靶向作用，可以促进复合物对抗肿瘤药物的靶向递送，而且肿瘤组织及细胞内较高浓度的透明质酸酶对HA的降解作用，可以促进药物在肿瘤细胞内的释放。因此，本发明技术尤其适用于疏水性抗肿瘤药物的口服给药应用，有利于克服疏水性抗肿瘤药物口服生物利用度低，抗肿瘤效果差的问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1.(A)PCL, (B、C)实施例1制备的HA-g-PCL在氘代二甲基亚砜和氘代水中的核磁谱图。从谱图B可计算出接枝段分子量及接枝率，C中看不到疏水段的质子峰，证明HA-g-PCL在水中形成了疏水段在核内的纳米粒。 [0022]图2A是HAg-1纳米粒、图2B是HAg-1在正负电荷比为4:1、ρΗ=6下与壳聚糖(CS)复合形成的纳米粒(I1-1)的粒径分布和TEM照片。HAg-1呈固体球形，I1-1具有核壳结构，分别是内核和CS外壳。
[0023]图3.在不同pH条件下，复合纳米粒(I1-1)的透射电镜照片:(A)pH=L 2，(B)pH=5.0, (C)pH=5.8，(D)pH=6.8, (E)pH=7.4，(F)pH=7.4下分离出来的上清液中的纳米粒。表明在酸性条件下，I1-1能够保持稳定的球状形态和层层复合结构。当在PH7.4条件下，外层的壳聚糖解离，释放出内含的HAg-1纳米粒。
[0024]图4 (A)实施例13的HAg-13空白纳米粒纳米粒；⑶是负载紫杉醇的HAg_13纳米粒(11-16) ; (C)壳聚糖(CS)与HAg-13复合纳米粒(I1-16)水分散液的粒径分布。
[0025]图5.复合物I1-1纳米粒在不同pH下的释放，介质中没有透明质酸酶。这是模拟胃肠HAg-1道环境下的药物释放，可见，复合物I1-1在胃肠道内均释放很少量的药物，保持药物在胃肠道内的稳定性。
[0026]图6.HAg-1纳米粒(HA-g-PCL/PTX)在不同透明质酸酶浓度下的药物释放曲线。结果表明，HAg-1纳米粒(HA-g-PCL/PTX)在无透明质酸酶(Hyal-1)下，药物释放很少。在Hyal-1存在下,药物释放速率迅速增大,且随着Hyal-1浓度增大而提高。
[0027]图7.是紫杉醇不同制剂给药后，小鼠肿瘤生长曲线。生理盐水(Saline)为阴性对照组，以紫杉醇临床制剂(Taxol，泰素)腹腔注射为阳性对照组，透明质酸接枝聚己内酯与壳聚糖复合纳米粒(CS/HA-g-PCL)为空白对照，HAg-1纳米粒(HA-g-PCL/PTX)和I1-1复合物纳米粒(CS/HA-g-PCL/PTX)为检测组。阴性对照组不具有任何抗肿瘤效果，肿瘤生长明显。四组给药组中，紫杉醇制剂直接口服组抗肿瘤效果最差，说明紫杉醇溶液直接口服生物利用度很低，紫杉醇制剂腹腔注射能一定程度抑制肿瘤的增长，未与壳聚糖复合的紫杉醇纳米粒HAg-1不具有任何抗肿瘤效果，说明未与壳聚糖复合的HAg-1纳米粒溶液直接口服生物利用度很低。I1-1复合物纳米粒口服组与紫杉醇制剂腹腔注射组比较，I1-1复合物纳米粒能显著抑制肿瘤体积的增长，呈现更好的抗肿瘤活性。
[0028]图8紫杉醇不同制剂腹腔注射及口服(灌胃)给药后小鼠成活率。由于紫杉醇制剂的毒副作用很强，虽然紫杉醇制剂口服比注射毒性降低，但仍然存在毒性。I1-1复合物纳米粒组实验期间无动物死亡，这证明通过疏水作用负载的紫杉醇能有效降低其毒副作用，延长动物的存活时间。
【具体实施方式】[0029]一种基于透明质酸的聚电解质复合物(以下简称为:聚电解质复合物)，其特征在于是HA基聚合物及其衍生物包载药物形成负电性的纳米粒，再与聚阳离子通过静电复合形成的聚电解质复合物。
[0030]只要是HA基聚合物包载药物形成的表面负电性的纳米粒，都适于本发明中聚电解质复合物的制备。优选地，以疏水改性的HA自组装形成的纳米粒更适于负载疏水性药物并制备成聚电解质复合物。
[0031]疏水改性的透明质酸是由透明质酸(HA)上的羧基键接疏水侧链形成的接枝型的透明质酸，其中疏水侧链的质量含量占10-50%，优选为20-40% ;疏水侧链的数均分子量在200-20000，优选200-5000 ；所述复合物中聚阳离子与透明质酸基聚合物的正负电荷比在
1.5-6.0之间，优选2.0-4.0 ；HA的数均分子量为2000-200000，优选为2000-100000，进一步优选2000-50000 ;所述复合物的粒径小于500nm。
[0032]本发明中，疏水侧链的质量含量占疏水改性透明质酸的10-50%，优选为20-40% ；疏水侧链优选自可降解聚酯，脱氧胆酸，胆固醇，甘草次酸。疏水侧链数均分子量200-600时，HA上疏水侧链接枝率优选为20-60%，疏水侧链数均分子量600-20000时，HA上疏水侧链接枝率优选为1_30%。疏水段接枝率是指HA上接枝的测链摩尔数占HA结构单元摩尔数的百分比。
[0033]所述的疏水侧链为可降解聚酯，所述的可降解聚酯是内酯、交酯的均聚物或共聚物；所述的内酯是可进行开环聚合反应的内酯，所述交酯优选为丙交酯、乙交酯。
[0034]本发明中，疏水侧链是己内酯、I，4，8-三氧杂螺[4.6] ~9~ 十一烷酮(TOSUO)、对二氧六环酮的均聚物或它们的共聚物；进一步优选为己内酯和TOSUO的共聚物，TOSUO单元占疏水侧链的质量百分比为5-30%，优选为5-20%。
[0035]形成本发明所述的聚电解质复合物，所用的外层聚阳离子可以是任何在水介质中带有正电荷的物质，优选自壳聚糖及其衍生物，聚赖氨酸，阳离子淀粉衍生物、明胶、阳离子性蛋白质或多肽、阳离子聚酯、阳离子聚磷酸酯、聚乙烯基吡咯盐、N，N-取代的(甲基)丙烯酸酯的均聚物及共聚物。
[0036]所述的聚电解聚阳离子进一步优选为壳聚糖，优选数均分子量5000-100000的壳聚糖及其衍生物，壳聚糖的数均分子量进一步优选为10000-100000。壳聚糖的去乙酰化度优选大于90%。
[0037]质复合物，其中所含的疏水性药物为适于口服的水不溶性药物；选自抗肿瘤药物，优选紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、羟基喜树碱、姜黄素；或选自抗菌、抗病毒、消炎类疏水性药物，选自青蒿素、吲哚美辛、地塞米松、醋酸泼尼松。
[0038]负电性的纳米粒中的药物质量含量可达到20%，优选0.5-15%。
[0039]所述的聚电解质复合物的制备是首先制备载药的疏水改性HA的纳米粒，该纳米粒的制备方法可采用常规的两亲性聚合物载药纳米粒的制备方法，如溶剂蒸发法，纳米沉淀技术、透析法等。在此，仅给出采用透析法制备载药的疏水改性HA纳米粒，再静电复合作用制备复合物。主要步骤在于:1)将配方量的疏水改性透明质酸与疏水药物溶解到共溶剂中配成溶液，然后装到透析袋中，用PBS (pH7.4)透析至溶剂完全被除去，离心，去掉沉淀物，得到负载疏水药物的疏水改性透明质酸的纳米粒水分散液。2)纳米粒水分散液可进一步冻干，得到纳米粒的冻干粉；3)搅拌下，把I)中得到的负载药物的疏水改性透明质酸的纳米粒水分散液或2)中得到的纳米粒冻干粉再分散到水中形成的纳米粒水分散液滴加到含有配方量聚阳离子的水溶液中，进行静电复合，制得负载疏水性药物的聚电解质复合物纳米粒的水分散液；4)将3)制备的聚电解质复合物纳米粒的水分散液冻干或与冻干稳定剂如聚乙二醇混合再冻干，得到所述的聚电解质复合物的冻干粉。
[0040]本发明所述的复合物以纳米粒状态分散到水介质中形成的水状液，或其冻干粉装载在胶囊中，或制备成片剂，作为口服药物制剂；所述的复合物也可以同其它药物或材料复配，用于制备口服药物制剂；优选用于抗肿瘤口服给药和结肠靶向给药。
[0041 ] 下面再以实施例对本发明进一步加以说明。
[0042]较高分子量的透明质酸(10000-200000)为市售产品，较低分子量透明质酸通过Co辐照及透明质酸酶降解方法来制备。
[0043]实施例1:
[0044]聚阴离子与疏水段通过酯键连接及载药纳米粒制备:
[0045]在干燥反应瓶中加入0.1g透明质酸(HA)(数均分子量2.9KDa)，33mg聚己内酯(PCL，3.3KDa)和82.52mg 二环己基碳二亚胺(DCC)，二甲基甲酰胺(DMF)溶解，最后加入48.87mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)。抽真空，充氮气。在室温下反应24h。反应液在DMF中透析24h，然后在蒸馏水透析 24h，之后将产品冷冻干燥24h，获得酯键键合疏水段的透明质酸。
[0046]25mg HAg-1与20mg紫杉醇溶解到IOml DMF中配成溶液、然后装到透析袋(截留分子量3500)中，用去PBS (pH7.4)透析48h，离心得到包载紫杉醇的HA-g-PCL共聚物纳米粒(HAg-1)水分散液。
[0047]实施例2~19:采用实施例1中方法，改变HA分子量、疏水段含量和种类，调整溶剂和催化剂的用量(保证DCC与疏水段摩尔比为3:1)，制备出表1各种疏水改性透明质酸；再按表1中药物种类及投药量，制备出不同的物理包载药物的聚阴离子纳米粒，如表1.[0048]表1通过酯键连接的疏水改性透明质酸载药纳米粒
[0049]
【权利要求】
1.一种基于透明质酸载药纳米粒的聚电解质复合物，其特征在于是透明质酸基聚合物包载药物形成负电性的纳米粒，再与聚阳离子静电复合形成的聚电解质复合物；透明质酸基聚合物为疏水改性的透明质酸，是由透明质酸HA上的羧基键接疏水侧链形成的接枝型的透明质酸，其中疏水侧链的质量含量占10-60% ;疏水侧链的数均分子量为200-20000 ;复合物中聚阳离子与透明质酸基聚合物的正负电荷比在1.5-6.0之间；HA的数均分子量为2000-200000 ;复合物的粒径小于500nm。
2.权利要求1所述的聚电解质复合物，其特征在于，所述HA上疏水侧链选自可降解聚酯、脱氧胆酸、胆固醇或甘草次酸；疏水侧链数均分子量为200-600时，HA上疏水侧链接枝率为20-60%，疏水侧链数均分子量600-20000时，HA上疏水侧链接枝率为1_30%。
3.权利要求2所述的聚电解质复合物，其特征在于，所述的疏水侧链为内酯、交酯的均聚物或共聚物可降解聚酯；内酯是进行开环聚合反应的内酯，交酯为丙交酯或乙交酯。
4.权利要求3所述的聚电解质复合物，其特征在于，所述的疏水侧链内酯是己内酯、1，4，8-三氧杂螺[4.6]-9-1^一烷酮、对二氧六环酮的均聚物或它们的共聚物；所述的己疏水侧链内酯是内酯和TOSUO的共聚物，TOSUO单元占疏水侧链的质量百分比为5-30%。
5.权利要求1所述的聚电解质复合物，其特征在于，所述的复合物中的聚阳离子选自壳聚糖及其衍生物、聚赖氨酸、阳离子淀粉衍生物、明胶、阳离子性蛋白质或多肽、阳离子聚酯、阳离子聚磷酸酯、聚乙烯基吡咯盐、N，N-取代的(甲基)丙烯酸酯的均聚物及共聚物。
6.权利要求5所述的聚电解质复合物， 其特征在于所述的聚阳离子选自壳聚糖，壳聚糖的数均分子量为2000-200000。
7.权利要求1~6所述的任意一项聚电解质复合物，其中所负载的疏水性药物为适于口服的水不溶性药物；优选自抗肿瘤药物、抗菌、抗病毒、消炎类疏水性药物。
8.权利要求7所述的聚电解质复合物，特征是所负载的药物为抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、羟基喜树碱或姜黄素。
9.权利要求1所述的聚电解质复合物的制备方法，其特征在于步骤如下: 1)将配方量的疏水改性透明质酸与疏水药物溶解到共溶剂中配成溶液，然后装到透析袋中，用pH7.4的PBS透析至溶剂完全被除去，离心，去掉沉淀物，得到负载疏水药物的疏水改性透明质酸的纳米粒水分散液； 2)将纳米粒水分散液进一步冻干，得到纳米粒的冻干粉； 3)搅拌下，把I)中得到的负载药物的疏水改性透明质酸的纳米粒水分散液或2)中得到的纳米粒冻干粉再分散到水中形成的纳米粒水分散液，滴加到含有配方量聚阳离子的水溶液中，进行静电复合，制得负载疏水性药物的聚电解质复合物纳米粒的水分散液； 4)将3)制备的聚电解质复合物纳米粒的水分散液冻干或与冻干稳定剂混合再冻干，得到聚电解质复合物的冻干粉；冻干稳定剂选自甘露醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、右旋糖酐、蔗糖、氯化钠、甘氨酸钠、去氧胆酸钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、山梨醇或右旋糖苷的一种或它们的任意组合。
10.权利要求1~8任意一项所述的含有疏水性药物的聚电解质复合物的应用，特征在于所述的复合物以纳米粒状态分散到水介质中形成的水状液，或其冻干粉装载在胶囊中，或制备成片剂，作为口服药物制剂；或同其它药物或材料复配，用于制备口服药物制剂。
【文档编号】A61K47/32GK103656653SQ201310658571
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】黄平升, 董岸杰, 邓联东 申请人:天津大学