利用胞壁二肽诱导dc-cik的方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用胞壁二肽诱导DC-CIK的方法，即向CIK或DC-CIK培养液中加入胞壁二肽诱导CIK或DC-CIK细胞增殖与分化，以提升CIK或DC-CIK细胞的杀瘤活性，其包括以下步骤：外周血采集、肿瘤抗原获取、单个核细胞分离、收集单个核细胞、单个核细胞的洗涤、MDP-DC-CIK细胞的诱导、培养。本方法诱导培养的MDP-DC-CIK细胞，经流式细胞检测仪检测发现其CD3+CD56+的无MHC限制性的NKT细胞的比例高达可以高达80%以上；同时，其杀伤肿瘤细胞的活性大大高于常规诱导培养的DC-CIK细胞，杀瘤百分率实验室检测结果达到99%以上。
【专利说明】利用胞壁二肽诱导DC-CIK的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫【技术领域】，具体涉及利用蛋白质多肽合成技术获得的胞壁二肽，加入诱导培养基中诱导MDP-DC-CIK细胞增殖与分化，使MDP-DC-CIK的杀瘤活性得到大幅提升的方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤细胞生物治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自体免疫细胞抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和制剂对从肿瘤病人体内采集的免疫细胞进行体外诱导培养和扩增后，回输到病人体内的方法，通过激发、调节和增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤生物治疗是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗技术，具有第四大肿瘤治疗技术之称。生物疗法包括细胞因子治疗、免疫细胞治疗、基因治疗、分子靶向治疗和抗体靶向治疗等。
[0003]免疫细胞治疗肿瘤原理:人体的免疫系统是防御体系，一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能；另一方面清除体内衰老细胞和发生突变的细胞(有的突变细胞会变成肿瘤细胞)。机体免疫系统和肿瘤细胞之间相互作用的结果最终决定了肿瘤的演变。对于健康的人群来说，其免疫系统的强大足以及时清除突变的肿瘤细胞。但对于肿瘤病人来说，普遍存在免疫功能低下，不能有效地清除、杀灭肿瘤细胞；同时，肿瘤细胞大量增殖，会进一步抑患者的免疫功能；另一方面，肿瘤细胞有很多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤。因此，肿瘤的免疫治疗就是借助免疫学技术和细胞工程技术，提高免疫细胞的识别、杀伤肿瘤细胞的能力，给机体补充足够数量的功能正常的免疫细胞和相关分子，激发、调节和增强机体抗瘤免疫应答，提高肿瘤对机体抗肿瘤免疫效应的敏感性，在体内、外诱导免疫细胞的特异性和非特异性杀伤肿瘤细胞的效应细胞和分子，达到最终清除肿瘤的目的。
[0004]肿瘤生物治疗的目的不是杀死全部肿瘤细胞，而是一方面，通过人为的干预，调节机体自身的免疫系统对肿瘤细胞进行识别、杀灭和抑制其增殖；另一方面，通过诱导分化使免疫细胞分化为没有MHC限制性的`NKT和具有对肿瘤高杀伤活性的CD8+的CTL细胞，通过清除微小的残留病灶或明显抑制了残留肿瘤细胞增殖的方式来达到治疗肿瘤的目的。
[0005]肿瘤生物治疗是优于手术、放疗和化疗的最新肿瘤治疗技术，是通过生物技术在GMP标准的实验室内诱导、增殖、分化培养的可杀伤肿瘤的自体免疫细胞。回输体内可直接杀伤肿瘤细胞、调节机体免疫机能的治疗方法。与传统的治疗方法不同，肿瘤生物治疗在不损伤机体免疫系统和功能的前提下，直接识别、杀伤、清除存在于人体内血液、淋巴中的肿瘤细胞，重建和增强机体自然抗肿瘤免疫系统和功能。细胞免疫治疗肿瘤具有提高患者自身的免疫功能与提高生活质量，并适用于除T细胞淋巴瘤以外的所有肿瘤疾病，该生物治疗技术已正式运用于临床。
[0006]免疫细胞疗法治疗肿瘤，具有以下优势:
[0007]1、效果确切、有效率高。对某些肿瘤，有效率高达70%。
[0008]2、无放疗、化疗的毒副作用，病人不痛苦、耐受性好、杀瘤特异性强。[0009]3、能够激发全身性的抗肿瘤效应，对多发病灶或转移的恶性肿瘤同样有效。
[0010]4、可以帮助机体快速恢复被放疗、化疗破坏的免疫系统，提高远期抗肿瘤能力。
[0011]5、对肿瘤术后防复发效果显著，远期抗肿瘤效果良好。
[0012]6、可单独使用，也可与其它治疗方法联合使用。单次有效，多次使用效果更佳。
[0013]MDP-DC-CIK细胞免疫疗法:
[0014]CIK细胞杀伤肿瘤细胞主要通过以下四种途径:
[0015]1、CIK细胞能以不同的机制识别肿瘤细胞，通过细胞毒作用直接杀伤肿瘤细胞；
[0016]2、通过诱导肿瘤细胞凋亡杀伤肿瘤细胞；
[0017]3、CIK细胞分泌IL-2、IL-6、IFN-Y[0018]4、CIK细胞回输后可激活机体免疫系统，提高机体的免疫功能。
[0019]MDP-DC-CIK细胞疗法联合应用将取得“ 1+1>2”的疗效，通过具有抗原递呈功能的DC细胞显著地提高免疫细胞对肿瘤细胞的识别，达到抑制肿瘤细胞的生长、增殖，明显改善患者的生活质量，提高肿瘤患者的生存期，是继肿瘤手术、放疗、化疗后又一种更加有效的新手段。
[0020]该疗法既可单独使用，也可以作为手术、化疗和放疗后的有力辅助手段，效果显著。结合手术切除、介入、射频、氩氦刀等治疗，可清除不能用手术切除的极微小瘤灶或是体内残存的肿瘤细胞，延缓或阻止肿瘤的转移或复发；对于部分暂时不适宜做手术、介入或其它治疗的肿瘤患者，也可以先进行MDP-DC-CIK细胞治疗，提高机体机能，改善生活质量，争取其它治疗机会。
[0021]DC细胞，即树突状细胞，发现于1973年。它是机体中功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈肿瘤抗原。DC细胞与肿瘤的发生、发展有着密切关系，是特异性激活机体免疫系统、激发抵御肿瘤侵袭最有效的途径之一。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞成熟后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。临床验证,大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。
[0022]在肿瘤免疫中，DC不仅能直接杀伤肿瘤细胞，还能通过识别肿瘤细胞特异性抗原，将其信号呈递给具杀伤效应的T细胞来达到监测、杀灭肿瘤的功能，因此DC与肿瘤杀伤细胞CIK细胞共同培养、联合使用，将细胞免疫治疗的效果达到一个新的高度。
[0023]CIK细胞(Cytokine-1nduced Killer)是多种细胞因子诱导的肿瘤杀伤细胞，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-Y等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞[16]。
[0024]DC是迄今为止发现的功能最为强大的抗原提呈细胞(即把肿瘤的相关信息提供给人体内具有杀伤肿瘤活性的细胞)，在机体的免疫系统里扮演近似“雷达”的角色；CIK是外周血单个核细胞，在体外经多种细胞因子共同诱导培养后，产生的一类以⑶3+⑶56+的T细胞为主要效应细胞的一群异质细胞，因此CIK同时具有T细胞和NK细胞两种具有抗肿瘤活性细胞的效应，其在体外其抗肿瘤活性较以往生物治疗中的LAK、CTL、TIL细胞活性强100~1000倍。医学家们对其更形象地描述是:如果T细胞在免疫系统中充当“炮弹”的角色，那么CIK则相当于威力更为强大的“导弹”。
[0025]胞壁酰二肽(MDP)具有以下特性:(1)可有效增加巨噬细胞吞噬力，提高外周白细胞水平；(2)促进T细胞分化和增加其识别力，缩短其到达靶细胞的时间；(3)提升B细胞数量和结合力度；(4)纠正其它免疫促进剂免疫双向调节的平衡性；(5)最终达到细胞免疫和体液免疫的高水平平衡调节。除此以外，胞壁酰二肽还能明显稳定肝、肾细胞膜稳定性，有效防止细胞膜过氧化及谷胱甘肽的氧化；显著增加肝、肾、脾细胞膜表面电荷的数量和密度，有效阻止病原体特别是病毒的攻击；通过改善微循环促排毒素，提供肝、肾充分营养，促进肝脏蛋白合成，具有明显的保肝、护肾、健脾作用。
[0026]MDP-DC-CIK细胞免疫疗法就是在体外培养干细胞，诱导其分化为树突状细胞，再用经抗原刺激的树突状细胞诱导CIK细胞产生特异性肿瘤杀伤作用。
[0027]MDP-DC-CIK细胞治疗能增强放化疗的敏感性、减少毒副作用；抵抗化疗药物的免疫抑制作用，提高化疗的疗效；迅速缓解患者的临床症状，大部分患者可达到瘤体缩小甚至消失、或长期带瘤生存的效果。同时对于放化疗无效的患者采用生物治疗可以延长其生存期。对于大多数早期肿瘤患者来说，甚至可以一边工作一边治疗。
[0028]MDP-DC-CIK细胞对肿瘤细胞的识别能力极强，对于那些体质相对较弱或者错过了手术最佳治疗时期，同时又承受不了放化疗反应的患者，较为适合选用MDP-DC-CIK细胞治疗技术。
[0029]由于MDP-DC-CIK细胞治疗具有免疫调节和自体细胞修复作用。在治疗肿瘤的同时，大部分患者，都会不同程度地减轻或消除放化疗后出现的消化道症状、使皮肤有光泽、黑斑淡化、头发停止脱落并恢复生长、白发变黑发等“年轻化”表现，精神状态和体力亦有明显恢复。
[0030]对于晚期肿瘤、转移性肿瘤患者、体质较弱的患者，都可以选择MDP-DC-CIK细胞治疗技术。调节体内的免疫功能，恢复体内免疫细胞的识别和杀伤肿瘤的功能，抑制肿瘤的转移和复发。为肿瘤患者带来新的希望。
[0031]然而目前常规诱导培养的DC-CIK细胞其杀伤肿瘤细胞的活性并不是很高，这就需要一种新型诱导方法。
【发明内容】
[0032]为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用胞壁二肽诱导DC-CIK的方法，经该法制备的MDP-DC-CIK细胞杀瘤活性较常规诱导的DC-CIK显著提高。
[0033]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种利用胞壁二肽诱导DC-CIK的方法，其特征在于，向CIK或DC-CIK培养液中加入胞壁二肽诱导CIK或DC-CIK细胞增殖与分化，以提升CIK或DC-CIK细胞的杀瘤活性。
[0034]所述向CIK或DC-CIK培养液中加入胞壁二肽诱导DC-CIK细胞增殖与分化具体包含按顺序进行的以下步骤:
[0035]步骤[1]外周血采集:无菌抽取肿瘤疾病患者外周血50ml，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血；
[0036]步骤[2]肿瘤抗原获取:室温2000rpm离心沉淀所采集外周血10分钟，收集5~IOml的上层血浆，将其加入MDP-DC-CIK诱导培养基中；所得细胞沉淀物用于分离单个核细胞；
[0037]步骤[3]单个核细胞分离:所得细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加至淋巴细胞分离液表面，在650g条件下离心20分钟；[0038]步骤[4]收集单个核细胞:离心结束后，用一次性塑料巴氏收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml —次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀；
[0039]步骤[5]单个核细胞的洗漆:室温2000rpm离心沉淀5分钟,弃上清,沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，再室温2000rpm离心沉淀5分钟；
[0040]步骤[6]MDP-DC_CIK细胞的诱导、培养:离心结束后，弃上清，沉淀物用含胞壁二肽的MDP-DC-CIK诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液稀释计数，均分至4个75cm2的一次性塑料细胞培养瓶中，补充MDP-DC-CIK诱导培养基至50ml/瓶，置37°C、5%C02 (V/V)、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，期间根据细胞的生长状况适时换液扩增，直至细胞数量达到回输所需。
[0041]步骤[6]中所述含胞壁二肽的MDP-DC-CIK诱导培养基，其胞壁二肽的浓度为
0.01 μ g/ml ~lmg/mlο
[0042]本发明的积极效果:本发明应用多肽合成技术合成的胞壁二肽(MDP)，利用MDP可有效增加巨噬细胞吞噬能力，增加其抗原递呈能力、促进T细胞分化、促进剂免疫双向调节以及对免疫细胞的免疫佐剂作用等特性。通过该方法诱导培养的MDP-DC-CIK细胞，经流式细胞检测仪检测发现其⑶3+⑶56+的无MHC限制性的NKT细胞的比例高达可以高达80%以上，远高于国内外文献报道的百分率；同时，其杀伤肿瘤细胞的活性大大高于常规诱导培养的DC-CIK细胞，杀瘤百分率实验室检测结果达到99%以上。体外实验显示，经该法制备的MDP-DC-CIK细胞杀瘤活性较常规诱导的DC-CIK显著提高；动物实验显示，经该法制备的MDP-DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠，其肿瘤负荷可明显降低或消失，延长带瘤生存期；临床应用发现，经该法制备的MDP-DC-CIK细胞治疗肿瘤患者均不同程度的改善了生活的质量，延长了生存期，部分病人病情得到缓解甚至治愈。得到广大医务工作者以及肿瘤病患者的认可和重视， 为肿瘤的治疗提供了一种更为有效的方法和手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1是MDP诱导的免疫细胞MDP-DC-CIK与DC-CIK增殖图；
[0044]图2是MDP诱导的免疫细胞MDP-DC-CIK细胞形态图；
[0045]图3是MDP诱导的免疫细胞MDP-DC-CIK杀伤肿瘤细胞活性柱状图；
[0046]图4是MDP诱导的免疫细胞DC-CIK-⑶流式检测结果图；
[0047]图5是MDP诱导的免疫细胞DC-CIK-NKT流式检测结果图；
[0048]图6是MDP诱导的免疫细胞MDP-DC-CIK-CD流式检测结果图；
[0049]图7是MDP诱导的免疫细胞MDP-DC-CIK-NKT流式检测结果图；
[0050]图8是荷瘤小鼠MDP-DC-CIK细胞治疗前后生存期结果图。
【具体实施方式】
[0051]下面对本发明的优选实施例进行详细说明。
[0052]一、胞壁酰二肽(MDP)合成
[0053]合成胞壁酰二肽(化学名:N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，MuramylDip印tide，英文缩写:MDP，其合成方法可参照陈正英陈兰福龚雄麒:免疫佐剂一胞壁酰二肽(MDP)的合成，药学学报1986年06期)，获得纯度> 99%的胞壁酰二肽用于后续实验。[0054]二、免疫细胞MDP-DC-CIK的分离、诱导、培养
[0055]患者准备:根据免疫细胞MDP-DC-CIK治疗的适应症和禁忌症选择适合该治疗的肿瘤患者，告知该治疗所涉及的各种相关信息和注意事项，获得患者及家属的理解和配合；签署知情同意书；检测血常规；
[0056]外周血动员:采血前24小时应皮下注射GM-CSF150 μ g ；
[0057]外周血采集:病人采血前应清淡饮食,无菌抽取肿瘤疾病患者外周血50ml，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血；
[0058]肿瘤抗原获取:室温2000rpm离心沉淀10分钟，收集适量的上层血浆，加入MDP-DC-CIK诱导培养基中即可。细胞沉淀物用于分离单个核细胞；
[0059]单个核细胞分离:细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加至淋巴细胞分尚液表面，650g条件下尚心20分钟；
[0060]收集单个核细胞:离心结束，用一次性塑料巴氏小心收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml —次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀；
[0061]单个核细胞的洗漆:室温2000rpm离心沉淀5分钟。弃上清,沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，再室温2000rpm离心沉淀5分钟；
[0062]MDP-DC-CIK细胞的诱导、 培养:离心结束，弃上清，沉淀物用含浓度为10 μ g/ml的胞壁二肽的MDP-DC-CIK诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液适当稀释计数。均分至4个75cm2的一次性塑料细胞培养瓶中，补充MDP-DC-CIK诱导培养基至50ml/瓶。置37°C、5%C02、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养。期间根据细胞的生长状况适时换液扩增，直至细胞数量达到回输所需；
[0063]三、免疫细胞MDP-DC-CIK的回输:
[0064](I)预计细胞总数达要求的数目前3天应取样进行微生物学检测、细胞标志物检测(CD3、CD4、CD8 及 CD 16/56)；
[0065](2)细胞质检合格方可进行回输，否则重新进行诱导；
[0066](3)回输大约于采血后的8~14天，细胞总数达4X109个后进行首次回输，每天回输一次，每一疗程分4-5次回输完毕。
[0067](4)回输过程可采用静脉或局部两个途径进行。
[0068]a.静脉回输:将MDP-DC-CIK细胞生理盐水混悬液，用输血器静脉滴注。在滴注过程中每5~10分钟轻轻晃动输液袋直至滴完，避免细胞沉降堆积。细胞输注前后均需要生理盐水冲管。细胞回输应在实验室处理完毕后2小时内完成；
[0069]b.局部注射:注射部位选择依次为:瘤体、有肿瘤转移的胸腹腔、有肿瘤转移的淋巴结周围；
[0070](5)回输过程中应密切观察患者的各种反应情况，作好各种不良反应发生的应急
处理预案。
[0071]四、诱导活化的MDP-DC-CIK细胞和常规诱导的DC-CIK细胞的生长特性
[0072]1.常规分离外周血单个核细胞，用RPM1-1640调细胞浓度为I X 105/ml，分别接种于96孔细胞培养板,每孔100 μ 1，每板8孔,共三板；
[0073]2.分别用2Χ浓缩的MDP-DC-CIK细胞和2Χ浓缩的常规诱导的DC-CIK培养液100 μ I/孔，每板的前四孔标识为实验组、后四孔标识为对照组；[0074]3.置37°C、5%C02 (V/V)的饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养；
[0075]4.分别于不同时间段3天、5天、7天，用MTT法检测其OD570 (如图1所示)；
[0076]MDP诱导的免疫细胞MDP-DC-CIK细胞型态如图2所示；
[0077]MDP诱导的免疫细胞MDP-DC-CIK杀伤肿瘤细胞活性结果如图3所示。
[0078]五、检测不同时间段诱导活化的MDP-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞的⑶标志物
[0079]1.收集培养诱导7天的MDP-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞各I X 106个；
[0080]2.常规标记 CD3-PerCP-A、CD4-FICT-A、CD8-PE-A 和 CD3-FITC-A、CD16CD56-PE_A ；
[0081]3.经流式细胞仪检测其结果(如图4-7所示)。
[0082]六、荷瘤小鼠MDP-DC-CIK细胞治疗前后生存期检测
[0083]1.复苏小鼠黑色素瘤B16细胞株；
[0084]2.取C57小鼠脾脏，常规制备小鼠MDP-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞；
[0085]3.C57小鼠腋下接种小鼠黑色素瘤B16细胞，每只注射约2.5X106个，共三十只，随机分为三组；
[0086]4.从第三天起每日腹腔注射诱导7天的MDP-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞，共五次，每次每只注射I X 106个/0.5ml，空白对照组注射生理盐水0.5ml ；
`[0087]5.观察并记录荷瘤小鼠的生存期(结果如图8所示)。
[0088]以上所述的仅为本发明的优选实施例，所应理解的是，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的思想和原则之内所做的任何修改、等同替换等等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种利用胞壁二肽诱导DC-CIK的方法，其特征在于:向CIK或DC-CIK培养液中加入胞壁二肽诱导CIK或DC-CIK细胞增殖与分化，以提升CIK或DC-CIK细胞的杀瘤活性。
2.根据权利要求1所述的一种利用胞壁二肽诱导DC-CIK的方法，其特征在于:所述向CIK或DC-CIK培养液中加入胞壁二肽诱导DC-CIK细胞增殖与分化具体包含按顺序进行的以下步骤: 步骤[I]外周血采集:无菌抽取肿瘤疾病患者外周血50ml，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血； 步骤[2]肿瘤抗原获取:室温2000rpm离心沉淀所采集外周血10分钟，收集5~IOml的上层血浆，将其加入MDP-DC-CIK诱导培养基中；所得细胞沉淀物用于分离单个核细胞； 步骤[3]单个核细胞分离:所得细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加至淋巴细胞分离液表面，在650g条件下离心20分钟； 步骤[4]收集单个核细胞:离心结束后，用一次性塑料巴氏收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml —次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀； 步骤[5]单个核细胞的洗漆:室温2000rpm离心沉淀5分钟,弃上清,沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，再室温2000rpm离心沉淀5分钟； 步骤[6]MDP-DC-CIK细胞的诱导、培养:离心结束后，弃上清，沉淀物用含胞壁二肽的MDP-DC-CIK诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液稀释计数，均分至4个75cm2的一次性塑料细胞培养瓶中，补充MDP-DC-CIK诱导培养基至50ml/瓶，置37°C、5%C02、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，期间根据细胞的生长状况适时换液扩增，直至细胞数量达到回输所需。
3.根据权利要求2所述的一种利用胞壁二肽诱导DC-CIK的方法，其特征在于:步骤[6]中所述含胞壁二肽的MDP-DC-CIK诱导培养基，其胞壁二肽的浓度为0.01 μ g/ml~lmg/ml。
4.由权力要求I~3所述的利用胞壁二肽诱导DC-CIK的方法获得的CIK或DC-CIK细胞用于肿瘤疾病的细胞治疗。
【文档编号】A61P35/00GK103710308SQ201310670029
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】吴炯, 张炬 申请人:吴炯, 张炬