一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法
【专利摘要】本声明提供一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将德国小蠊灭活；(2)用乙醇清洗、浸泡、风干后置于-80℃冰箱保存备用；(3)取适量的冰冻德国小蠊在液氮中研磨成粉末；(4)使用丙酮脱脂后冷冻，随后冻干成粉末；(5)称取德国小蠊粉末加入提取液，在涡旋振荡器上充分混匀吸取上清；(6)用相应的抗过敏原的特异性抗体鉴定德国小蠊过敏原粗提物中过敏原的含量及比例；(7)加入酵母菌或昆虫表达的重组蛋白质，使其达到与德国小蠊自身的五种主要过敏原含量及比例的一致性为65％～75％，即得到本发明的过敏原制剂。本发明方法提取的德国小蠊过敏原粗提物能最大程度的获得德国小蠊主要过敏原蛋白，提取物可重复性好，误差小于30％。
【专利说明】一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药【技术领域】，具体为一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]过敏性疾病是人类重大疾病之一。其发病率目前估计约占世界人口的22%，而且正以每年大于1%的速度增加，且以儿童患者的发病率上升最为明显。其危害性不能简单地以其死亡率来衡量,而要考虑疾病的高发作频度给患者造成的经济负担。由于过敏性疾病多发生在年轻人群，其对人类社会和经济的影响就更严重。我国在工业化转型过程中，其发病率显著增加，严重影响了我国受累人口的生活质量、工作效率，加重了患者的经济负担。仅欧洲每年用于治疗过敏患者的费用已经超过500亿欧元，并继续以3倍于其它疾病的增速在发展。美国每年仅哮喘和过敏性鼻炎的花费已分别高达64和60亿美元。全国尚有数以亿计的人有潜在的诊断和治疗需求。因此，积极扶持我国过敏原体内诊断和治疗制剂研发，能有效防止因国外产品对我国的渗入造成的医疗费用上涨，减少国家医疗财政支出和人民负担。
[0003]过敏原标准化是一项世界性难题，我国在此领域与欧美国家差距逐渐拉大。例如，美国为有效管理过敏原制剂，专门成立了 FDA / CBER / LIB实验室，旨在建立过敏原参考品、过敏患者参考血清池、标准的生物效价检定方法、设定有效合理的质量放行标准。1981年，美国市场上有超过5000种非标准化过敏原产品出售，其中绝大部分均没有安全性和有效性验证。而现今，FDA经过多年过敏原标准化体系规范，正式批准的标准化过敏原仅19种。德国生物制品研究所-PEI研究所(Paul Ehrlich Institute, PEI)执行了同样的策略，强制在德国推行标准化过敏原，加强监管，关闭了数十家过敏原生产企业。欧盟通过连续三届框架科技计划资助，建立了桦树主要致敏蛋白重组参考品rBet Vl以及标准的ELISA检定方法，准备写入欧洲药典。我们在本项目中利用新的提取和重组技术，制备出第二代标准化过敏原制剂。
[0004] 早在上世纪60年代，就有蟑螂引起哮喘的报道。但直到近年来，蟑螂在哮喘发病中的作用才逐渐受到人们的关注。资料显示，美国哮喘患者中蟑螂过敏的发生率达到27.5~42%，欧洲为3.9~24.5%，非洲为30~44.6%，在我国，北京、上海等大城市中儿童哮喘患者的蟑螂过敏率也高达27.8~43.8%。哮喘发病率的不断升高，在很大程度上与蟑螂污染加剧有关，蟑螂已经成为仅次于尘螨的第二大室内过敏源。目前常见的德国小蠊过敏原已经被鉴定出来，使第二代标准化德国小蠊过敏原制剂的制备有了依据。但是，到目前为止，尚无公开发表的德国小蠊制备工艺，而德国小蠊过敏原制剂又有较大的临床需求，以此本公司研发出第二代标准化德国小蠊过敏原制剂。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题在于提供一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，以解决上述【背景技术】中的问题。[0006]本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0007](1)将德国小蠊在_80°C冰箱中灭活；
[0008](2)用75%乙醇清洗、浸泡15分钟，风干后置于_80°C冰箱保存备用；
[0009](3)取适量的冰冻德国小蠊在液氮中研磨成粉末；
[0010](4)使用丙酮脱脂2次后，置于_80°C冰箱中冷冻，随后在真空冷冻干燥机内冻干成粉末；
[0011](5)称取德国小蠊粉末，按照德国小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相应的提取液，在涡旋振荡器上充分混匀，置4°C摇床上抽提，之后在转速为12000g，4°C条件下离心30min,吸取上清，即为德国小蠊过敏原粗提物；
[0012](6)用抗 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原Blag5的特异性抗体鉴定德国小蠊过敏原粗提物中主要过敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原 Blag5 的含量及比例；
[0013](7)根据步骤(6)中鉴定结果加入酵母菌或昆虫表达的重组蛋白质，使其达到与德国小蠊自身的五种主要过敏原Blag2或Blag9、Blag6.0U Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin, I种次要过敏原Blag5含量及比例基本一致，即得到本发明的过敏原制剂。
[0014]所述德国小蠊粉末加入提取液后置4°C摇床上提取时间为0.5~4h。
[0015]所述提取液为高渗磷酸盐缓冲液(PBS)，配方为:NaCl:35.1g~70.2g、KCl:
0.2g、Na2HPO4:1.42g、KH2PO4:0.27g，加入 800mlddH20 调节 pH 值 5.0 ~9.0，定容至 1L。
[0016]所述德国小蠊自身的五种主要过敏原含量及比例的一致性为65%~75%。
[0017]所述的德国小蠊为纯系，由一对双亲繁殖成。
[0018]与现有技术相比，本发明有以下有益效果:本发明方法提取的德国小蠊过敏原粗提物能最大程度的获得德国小蠊主要过敏原蛋白，提取物可重复性好，误差小于30%。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明中不同NaCl浓度PBS溶液抽提德国小蠊I小时结果。
【具体实施方式】
[0020]为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0021]实施例1
[0022]一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0023](1)将德国小蠊在_80°C冰箱中灭活；
[0024](2)用75%乙醇清洗、浸泡15分钟，风干后置于_80°C冰箱保存备用；
[0025](3)取适量的冰冻德国小蠊在液氮中研磨成粉末；
[0026](4)使用丙酮脱脂2次后，置于_80°C冰箱中冷冻，随后在真空冷冻干燥机内冻干成粉末；
[0027](5)称取德国小蠊粉末，按照德国小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相应的提取液，在涡旋振荡器上充分混匀，置4°C摇床上抽提lh，之后在转速为12000g，4°C条件下离心30min,吸取上清，即为德国小蠊过敏原粗提物；
[0028](6)用抗 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原Blag5过敏原的特异性抗体鉴定德国小蠊过敏原粗提物中主要过敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原 Blag5 的含量及比例；
[0029](7)根据步骤(6)中鉴定结果加入酵母菌或昆虫表达的重组蛋白质，使主要过敏原 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDUBlagtrypsin, I 种次要过敏原 Blag5 含量及比例的一致性为68%，即得到本发明的过敏原制剂。
[0030]实施例2
[0031]一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0032](I)将德国小蠊在_80°C冰箱中灭活；
[0033](2)用75%乙醇清洗、浸泡15分钟，风干后置于_80°C冰箱保存备用；
[0034](3)取适量的冰冻德国小蠊在液氮中研磨成粉末；
[0035](4)使用丙酮脱脂2次后，置于_80°C冰箱中冷冻，随后在真空冷冻干燥机内冻干成粉末；
[0036](5)称取德国小蠊粉末，按照德国小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相应的提取液，在涡旋振荡器上充分混匀，置4°C`摇床上抽提1.5h，之后在转速为12000g，4°C条件下离心30min，吸取上清，即为德国小蠊过敏原粗提物；
[0037](6)用抗 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原Blag5过敏原的特异性抗体鉴定德国小蠊过敏原粗提物中主要过敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原 Blag5 的含量及比例；
[0038](7)根据步骤(6)中鉴定结果加入酵母菌或昆虫表达的重组蛋白质，使主要过敏原 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDUBlagtrypsin, I 种次要过敏原 Blag5 含量及比例的一致性为70%，即得到本发明的过敏原制剂。
[0039]实施例3
[0040]一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0041](I)将德国小蠊在_80°C冰箱中灭活；
[0042](2)用75%乙醇清洗、浸泡15分钟，风干后置于_80°C冰箱保存备用；
[0043](3)取适量的冰冻德国小蠊在液氮中研磨成粉末；
[0044](4)使用丙酮脱脂2次后，置于_80°C冰箱中冷冻，随后在真空冷冻干燥机内冻干成粉末；
[0045](5)称取德国小蠊粉末，按照德国小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相应的提取液，在涡旋振荡器上充分混匀，置4°C摇床上抽提2h，之后在转速为12000g，4°C条件下离心30min,吸取上清，即为德国小蠊过敏原粗提物；
[0046](6)用抗 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原Blag5过敏原的特异性抗体鉴定德国小蠊过敏原粗提物中主要过敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原 Blag5 的含量及比例；[0047](7)根据步骤(6)中鉴定结果加入酵母菌或昆虫表达的重组蛋白质，使主要过敏原 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDUBlagtrypsin, I 种次要过敏原 Blag5 含量及比例的一致性为72%，即得到本发明的过敏原制剂。
[0048]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。·
【权利要求】
1.一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)将德国小蠊在-80°C冰箱中灭活； (2)用75%乙醇清洗、浸泡15分钟，风干后置于_80°C冰箱保存备用； (3)取适量的冰冻德国小蠊在液氮中研磨成粉末； (4)使用丙酮脱脂2次后，置于_80°C冰箱中冷冻，随后在真空冷冻干燥机内冻干成粉末； (5)称取德国小蠊粉末，按照德国小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相应的提取液，在涡旋振荡器上充分混匀，置4°C摇床上抽提，之后在转速为12000g，4°C条件下离心30min，吸取上清，即为德国小蠊过敏原粗提物；
(6)用抗Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原Blag5过敏原的特异性抗体鉴定德国小蠊过敏原粗提物中主要过敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 种次要过敏原 Blag5 的含量及比例； (7)根据步骤(6)中鉴定结果加入酵母菌或昆虫表达的重组蛋白质，使其达到与德国小蠊自身的五种主要过敏原 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin, I种次要过敏原Blag5含量及比例的一致性为65%~75%，即得到本发明的过敏原制剂。
2.根据权利要求1所述的一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，其特征在于:所述德国小蠊粉末加入提取液后置4°C摇床上提取时间为0.5~4h。
3.根据权利要求1所述的一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，其特征在于:所述提取液为高渗磷酸盐缓冲液(PBS)，配方为=NaCl:35.1g ~70.2g、KCl:0.2g、Na2HP04:1.42g、KH2PO4:0.27g,加入 800mlddH20 调节 pH 值 5.0 ~9.0，定容至 1L。
4.根据权利要求1所述的一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，其特征在于:所述德国小蠊自身的五种主要过敏原含量及比例的一致性为65 %~75 %。
5.根据权利要求1所述的一种德国小蠊过敏原制剂的制备方法，其特征在于:所述的德国小蠊为纯系，由一对双亲繁殖成。
【文档编号】A61P37/08GK103656635SQ201310694219
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】何韶衡 申请人:安徽润敏江生物科技有限公司