鬼鲉或其肝脏提取物在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鬼鲉或鬼鲉肝脏提取物在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用，本发明以资源丰富的海洋资源鬼鲉为研究对象，通过大量药理实验筛选鬼鲉的药理活性，实验结果表明，鬼鲉及其肝脏提取物具有明显的提高免疫器官指数，减少免疫器官损伤，增加免疫细胞的数目，提高血液中和细胞因子含量以及促进脾淋巴细胞的分裂增殖的作用，显示出非常好的增强免疫力的作用，并且对非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫均具有很好的增强作用，且实验结果表明用药安全可靠。鬼鲉资源丰富，可开发成新的提高免疫力功效的保健品或药品，具有很好的应用前景。
【专利说明】鬼鈾或其肝脏提取物在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及鱼类鬼鈾的新用途，具体涉及鬼鈾或其肝脏提取物在制备提高免疫力的保健品或药品中的新用途。
【背景技术】
[0002]鬼鈾，亦称日本鬼鈾，别名老虎鱼，为毒鈾科鬼鈾Inimicusjaponicas (Cuvier&volenciennes)的全体；其为近海小型底层鱼类，栖息于沿岸或海岛附近石砺底质的浅海中，肉食性，摄食甲壳类动物；分布于我国沿海，朝鲜、日本沿海。全年均可捕捉，捕后洗净，鲜用或晒干备用，日本鬼鈾的鱼肉常因肉质鲜美而被沿海居民所食用，其内部的肝脏等则作为废弃物而未被利用。鬼鈾鱼头上与头侧有凹陷和突起，颅骨均被皮膜所覆盖；头部、躯干部及各鳍条上到处有小触须存在。身体呈深褐色或紫红色，变异很大、各鳍有白点或白线，胸鳍内面有褐色斑点，胸鳍完全连于胸部，背鳍的棘有剧毒。现代研究表明日本鬼鈾的毒液对心肌、骨骼肌、平滑肌等均有直接的麻痹作用，而且毒腺提取液可使大鼠红细胞发生棘突样变，可明显降低血液单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞的活力；明显降低NK活性；并且降低巨噬细胞的吞噬能力。
[0003]现代医学研究表明，人类机体患病的原因大多是由于自身免疫力系统出现问题，机体免疫力降低导致，对于体质较差，年老体弱的疾病患者，提高机体免疫力具有重要作用，目前市场上提高免疫力的中药制剂较多，如:十全大补丸、补中益气丸、归脾胶囊等等，现有的中药制剂虽然具有一定的提高免疫力作用，但是均存在处方较大，在提高免疫力作用的同时，均在一定的副作用。
[0004]因此，很有必要在现有技术的基础之上，充分利用资源丰富的海洋资源，以鬼鈾为研究对象，研究开发其新的临床药理活性。
【发明内容】
[0005]发明目的:本发明的目的是在鬼鈾现有药理活性的基础上，开发其新的药理活性，提供一种具有很好提高免疫力作用、安全可靠的鬼鈾或其肝脏提取物制成的保健品或药品，
[0006]技术方案:为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为:
[0007]鬼鈾在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用。
[0008]鬼鈾肝脏提取物在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用。
[0009]作为优选方案，以上所述的鬼鈾肝脏提取物在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用，所述的鬼鈾肝脏提取物是通过以下方法制备得到:
[0010]取鬼鈾肝脏，剪碎，加入超纯水进行匀浆，然后在-20?-40°c冷冻12?24h，经4?6°C解冻融化12?24h，反复冻融3次，然后加入超纯水，在90°C?95°C下加热5?IOmin,冷却至室温，在4°C条件下8000?10000r/min离心20?30min，收集离心后上清液，上清液_66°C冷冻干燥，得鬼鈾肝脏提取物。
[0011]本发明提供的鬼鈾或其肝脏提取物可以用于制备提高免疫力的保健品或药品，如可以将鬼鈾或其肝脏提取物和食品上或药学上可接受的载体制备成口服液、片剂或胶囊剂
坐寸O
[0012]有益效果:本发明和现有技术相比具有以下优点:
[0013]本发明通过大量药理实验筛选鬼鈾的药理活性，实验结果表明，鬼鈾及其肝脏提取物具有明显的提高免疫器官指数，减少免疫器官损伤，增加免疫细胞的数目，提高血液中TNFa和一些细胞因子(IL-Ιβ、IL-2、IL-6)含量以及促进脾淋巴细胞的分裂增殖的作用，显示出非常好的增强免疫力的作用，并且对非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫均具有很好的增强作用，且实验结果表明用药安全可靠。鬼鈾资源丰富，可开发成新的提高免疫力功效的保健品或药品，具有很好的应用前景。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0015]实施例1
[0016]1、实验材料
[0017]1.1实验动物
[0018]ICR小鼠300只，雌雄各半，体重18_22g，扬州大学比较医学中心(SPF级)提供，动物质量合格证号:SCXK(苏)2012-0004。动物饲养于南京中医药大学动物中心SPF级小鼠实验室内，温度23°C ±2°C，湿度55±5%，颗粒饲料(分别为汤山龙泉牌实验鼠颗粒饲料和兔颗粒词料)喂养，自由饮水。
[0019]1.2药品与试剂
[0020]日本鬼鈾Inimicus japonicus (Cuvier e tValenciennes)由厦门大学丁少雄教授提供；注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32020857);盐酸左旋咪唑片(南京白敬宇制药有限责任公司)；黄芪多糖注射液(爱迪森(北京)生物科技有限公司，批准文号:兽药字(2011) 010122712);绵羊红细胞(广州蕊特生物科技有限公司提供);豚鼠血清(广州蕊特生物科技有限公司提供)；TNFa、IL-1 β、IL_2、IL-6ELISA试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；其它试剂均为国产分析纯。
[0021]1.3实验仪器
[0022]冷冻干燥机(美国LABC0NC0公司)，冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)，JJ-2B型组织捣碎匀浆机(金坛市荣华仪器制造有限公司)，RE-201D升降恒温水浴锅(南京金正教学仪器有限公司)，实验室级超纯水器(南京易普易达科技发展有限公司)，紫外分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)，酶标仪(PerkinElmer股份有限公司)，全自动血细胞分析仪(日本希森美康公司)，电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，海尔医用低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)。
[0023]2、实验方法
[0024]2.1鬼鈾肝脏提取物的制备[0025]取鬼鈾肝脏(_80°C冻存)，而后在4°C下融化，去除血管与结缔组织后，将肝脏剪碎，加入两倍量的超纯水进行匀浆(低速10000r/min，30s/次，3次)，然后再反复冻融3次(在-20 V冷冻12h，经4°C解冻融化12h左右)。加入两倍量的超纯水，并在95 °C下加热5min。冷却至室温，在4°C条件下离心(8000r/min，20min)，收集离心后上清液。上清液_66°C冷冻干燥，得鬼鈾肝脏粗多肽冻干粉，_20°C下保存。经考马斯亮蓝法测得鬼鈾上清液的蛋白浓度约为40.06 μ g/mg。给药前用0.2%的CMC-Na溶液配制成低浓度组(I JLL)0.025g/mL、中浓度组(IJLM) 0.05g/mL、高浓度组(IJLH) 0.1 g/mL的溶液。
[0026]2.2免疫低下小鼠造模及给药
[0027]小鼠70只，雌雄各半，称重编号，随机分成7组，设空白组，模型组，阳性对照1(左旋咪唑，37.5mg/kg)组，阳性对照2 (黄芪多糖)组，以上2.1制备得到的鬼鈾肝脏提取物低浓度组(IJLL)、中浓度组(IJLM)、高浓度组(IJLH)。第3d，空白组每天灌胃CMC-Na溶液0.4mL和腹腔注射生理盐水0.4mL，模型组每天灌胃CMC-Na溶液0.4mL和腹腔注射环磷酰胺(CTX) 50mg/kg,阳性对照I组和CTX50mg/kg。各组每天给药2次,连续5d,模型组、阳性对照组、给药组均连续造模3d。鬼鈾肝脏提取物组每天分别灌胃给药，同时腹腔注射CTX50mg/kg,阳性对照2组每天皮下注射给药0.1mL/次，同时腹腔注射。
[0028]2.3体重和免疫器官指数观察
[0029]每天给小鼠称重并记录，按剂量灌胃、造模，眼眶采血后处死小鼠，解剖取出脾脏和胸腺，分别用生理盐水漂洗后滤纸吸干，称重并计算脏器指数。
[0030]脏器指数=脏器质量(mg) /体重(g)
[0031]实验数据以表示，组间比较采用t检验，以P〈0.05为具有统计学意义。
[0032]2.4巨噬细胞吞噬功能的测定
[0033]采用碳粒廓清法，在末次给药30min后，经小鼠尾静脉注入3倍稀释的印度墨汁0.05mL/10g。分别于30s和360s从眼眶后取血20 μ L，并将其加入到0.l%Na2C03溶液2mL中摇匀，在分光光度计680nm波长处测光密度值，ODl表示30s的光密度值，0D2表示360s的光密度值。根据公式计算廓清指数K，K值经体重及肝脾重量换算后，得吞噬指数a。
[0034]廓清指数K= (lg0Dl-lg0D2) / (t2_tl)
[0035]吞噬指数α =体重/肝脾重X 3Κ
[0036]实验数据以表示，组间比较采用t检验，以P〈0.05为具有统计学意义。
[0037]2.5血清溶血素的含量测定
[0038]造模与给药方法同2.2。各组小鼠于给药第3d，腹腔注射2%SRBC0.2mL致敏。末次给药后24h，处死动物，小鼠眼眶取血，分离血清，用生理盐水将血清稀释200倍，各组样品管中分别加入1:200试验小鼠血清稀释液lmL、l:10补体血清稀释液lmL、以及10%SRBC0.5ml震荡混匀另取空白管，分别加入等量的补体、SRBC及ImL生理盐水。然后各管于37°C水浴锅中辉育lOmin，冰浴IOmin终止反应，2000rpm离心lOmin，取上清液，以空白管调零，在可见光分光光度计540nm处测定各管OD值，记录结果。实验数据以I表示，组间比较采用t检验，以P〈0.05为具有统计学意义。
[0039]2.6外周血常规观察
[0040]造模与给药方法同2.2。在末次给药30min后，眼眶采血20 μ L7EDTA抗凝后迅速用血细胞计数仪检测小鼠外周血常规，分别对白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞进行计数。实验数据以表示，组间比较采用t检验，以P〈0.05为具有统计学意义。
[0041]2.7 血清中 TNF α、IL-1 β、IL-2、IL-6 的测定
[0042]造模与给药方法同2.2。在末次给药30min后，眼眶采血0.5mL,分离得到血清，血清中TNFa、IL-1 β、IL_2、IL_6采用ELISA法测定。实验数据以表示，组间比较采用t检验，以P〈0.05为具有统计学意义。
[0043]2.8小鼠脾细胞周期的检测
[0044]造模与给药方法同2.2。在末次给药30min后，小鼠脱颈处死后，取小鼠脾脏用载玻片碾磨，用生理盐水制成细胞取小鼠脾脏用载玻片碾磨，用生理盐水制成细胞悬液备用。取脾细胞悬液，200目筛网过滤，用PBS洗涤2次后70%冷乙醇固定，4°C保存。上机前PBS洗漆，制成细胞悬液，加入含RNA酶的碘化丙啶(PI)染液，4°C，30min,经300目尼龙网滤过后，上流式细胞仪测定各组细胞周期。每个样本获取30000个细胞。以MULTICYCLE软件分析细胞周期。实验数据以表示，组间比较采用t检验，以P〈0.05为具有统计学意义。
[0045]2.9小鼠胸腺组织的形态观察
[0046]造模与给药方法同2.2。在末次给药30min后，小鼠脱颈处死后，剖取胸腺。胸腺经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚4?5 μ m，HE染色，病理专业人员阅片，根据各脏器病变由轻到重的程度，分别标记为轻度I分“ + ”，中度2分“++”，重度3分“+++”，极重度4分“++++”，无明显病变为阴性O分，轻微病变为0.5分“土 ”，累加所有分数，并计算出每组每只动物的均分，以T± Y表示，组间比较采用t检验，以P〈0.05为具有统计学意义。
[0047]3、实验结果
[0048]3.1对免疫低下小鼠体重的影响
[0049]与空白组比较，模型组小鼠的体重在第3d显著性减少(P〈0.05)，在第4、5d明显减少(P〈0.01);与模型组比较，阳性对照I组在第3d显著性减少(P〈0.05)，在第4、5d明显减少(P〈0.01);阳性对照2组和IJLM组在第4d显著性减少(P〈0.05)，在第6d明显减少(P〈0.0D5IJLH组在第6d显著性减少(P〈0.05)。结果提示，鬼鈾肝脏提取物可以减缓免疫低下小鼠体重的下降趋势。
[0050]3.2对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响
[0051]实验结果表明，与空白组比较，模型组小鼠的脾脏指数和胸腺显著性减小(P〈0.01);与模型组比较，阳性对照I组的脾脏指数和胸腺指数显著性增大(分别为P〈0.05，P〈0.01)，阳性对照2组的脾脏指数和胸腺指数显著性增大(P〈0.01)，鬼鈾肝脏提取物低浓度组(ULL)组的脾脏指数和胸腺指数显著性增大(分别为P〈0.05，P〈0.01)，鬼鈾肝脏提取物中浓度组(IJLM)组的脾脏指数和胸腺指数显著性增大(分别为P〈0.05, P<0.01)，鬼鈾肝脏提取物高浓度组(IJLH)组的脾脏指数和胸腺指数显著性增大(P〈0.01)。结果提示，鬼鈾肝脏提取物可以减少免疫低下小鼠脾脏和胸腺的损伤，显示出了很好的保护免疫器官损伤等功效。
[0052]3.3对免疫低下小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响
[0053]由表I实验结果表明，与空白组比较，模型组小鼠的吞噬指数和吞噬系数显著性减小(P〈0.01);与模型组比较，阳性对照组(左旋咪唑、黄芪多糖)、鬼鈾肝脏提取物低、中、高浓度组(IJLL、IJLM、IJLH)的吞噬指数和吞噬系数显著性的增大(P〈0.01)。结果表明，鬼鈾肝脏提取物可以增加免疫低下小鼠单核巨噬细胞吞噬功能。[0054]表1各组对免疫低下小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响(?±〃，η = 10)
【权利要求】
1.鬼鈾在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用。
2.鬼鈾肝脏提取物在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用。
3.根据权利要求1所述的鬼鈾肝脏提取物在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用，其特征在于，所述的鬼鈾肝脏提取物是通过以下方法制备得到: 取鬼鈾肝脏，剪碎，加入超纯水进行匀浆，然后在-2(T-40°C冷冻12?24h，经4?6°C解冻融化12?24 h，反复冻融3次，然后加入超纯水，在90°C、5°C下加热5?10 min，然后冷却至室温，在4°C条件下800(Tl0000 r/min离心20?30 min,收集离心后上清液，上清液_66°C冷冻干燥，得鬼鈾肝脏提取物。
【文档编号】A61K35/12GK103689597SQ201310719926
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】唐于平, 刘欣, 段金廒, 林祥志, 林汝榕 申请人:南京中医药大学, 国家海洋局第三海洋研究所