免疫疗法的新型免疫抗原表位的制作方法
【专利摘要】本发明涉及免疫疗法的新型免疫抗原表位，尤其涉及可与任一类MHC复合物相结合且引发免疫反应的肿瘤相关抗原衍生肽的氨基酸序列，以及该肽在治疗疾病中的用途。
【专利说明】免疫疗法的新型免疫抗原表位
【技术领域】
[0001]本发明涉及可与任一类MHC复合物相结合且引发免疫反应的肿瘤相关抗原衍生肽的新型氨基酸序列。
【背景技术】
[0002]是否能刺激免疫反应取决于是否提呈被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的提呈增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。对于癌症免疫疗法，目前正在探索利用免疫系统中的体液和细胞免疫的各种机制。
[0003]细胞免疫反应的某些元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T细胞(CTL)表明，这些细胞对癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用(Cheever et al., Annals N.Y.Acad.Sc1.1993690:101_112;Zeh HJj Perry-Lalley Dj Dudley ME, Rosenberg SA，Yang JC; JImmunol.1999, 162(2):989-94;High avidity CTLs for two self-antigens demonstratesuperior in vitro and in vivo anti tumour efficacy.)。特别是 CD8 阳性 T细胞(TCD8+)在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别细胞液8至10个源自蛋白或缺损核糖体产物(DRIPS) (Schubert U, Anton LC，Gibbs Jj Norbury CCj Yewdell JWj Bennink JR.; Rapiddegradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes;Nature2000; 404 (6779): 770-774)的残基中载有主要组织相容性复合体(MHC)的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。
[0004]MHC分子有两类:MHC-1类分子，大部分细胞核提呈内源性蛋白DRIPS裂解生成的肽以及较大肽的细胞上都能发现此类分子。MHC-1I类分子，主要发现于专职抗原提呈细胞(APC)及其在内吞作用过程中摄取并且随后进行加工的外源性蛋白提呈肽中(CresswellP.Annu.Rev.1mmunol.1994;1·2:259-93)。肽和MHC-1类分子的复合物由载有相应TCR的CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞识别，肽和MHC-1I类分子的复合物由载有相应TCR的CD4阳性辅助T细胞识别。本领域已熟知TCR、肽和MHC的化学计量数量丰富，比例为1:1:1。
[0005]CD4阳性辅助T细胞在安排抗肿瘤T细胞反应的效应子功能中发挥重要作用，因此，肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对开发能引发抗肿瘤免疫反应的药物可能非常重要(Kobayashij H.，R.0miyaj M.Ruiz, E.Huartej P.Sarobej J.J.LasartejM.Herraizj B.SangrojJ.Prieto, F.Borras-Cuestaj and E.Celis.2002.1dentification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes fromcarcinoembryonic antigen.Cl in.Cancer Res.8:3219-3225.，Gnjaticj S.，D.Atanackovicj E.Jagcr, M.Matsuo, A.Selvakumarj N.K.Altorkij R.G.Makij B.Dupont, G.Ritter, Y.T.Chen, A.Knuthj and L.J.0ld.2003.Survey of naturalIy occurringCD4+T_cell responses against NY-ESO-1in cancer patients: Correlation withantibody responses.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.100 (15):8862-7)CD4+T cellscan lead to locally increased levels of IFN(Qin Zj Schwartzkopff J，PraderaF，Kammertoens T，Seliger B，Pircher H，Blankenstein T;A critical requirementof interferon gamma-mediated angiostasis for tumour rejection by CD8+Tcells;Cancer Res.2003J;63(14):4095-4100)。
[0006]在没有炎症的情况下，MHC-1I类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专职抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。令人吃惊的是，在肿瘤患者的肿瘤细胞中发现有MHC-1I类分子的表达(Dengjel J, NastkeMD，Gouttefangeas C，Gitsioudis G，Schoor O, Altenberend F，Miiller Mj KramcrB，Missiou A，Sauter M，Hennenlotter Jj Wernet Dj Stenzl A，Rammensee HG，KlingelK, Slcvanovic S.;Unexpected abundance of HLA class II presented peptides inprimary renal cell carcinomas;Clin Cancer Res.2006;12:4163-4170)。
[0007]哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应细胞(如，⑶8阳性T淋巴细胞)，⑶4阳性T细胞也能通过分泌干扰素-Y (IFNy)抑制血管生成，从而抑制肿瘤的出现(Qin, Z.and T.Blankenstein.2000.CD4+T-cell_mediated tumourrejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gammareceptor expression by nonhematopoietic cells.1mmunity.12:677-686)。此外，石开究还显示，CD4阳性T细胞可识别HLA-1I类分子所提呈的肿瘤相关抗原中的肽，这样可通过诱导抗体(Ab)反应而阻止肿瘤进展(Kennedy, R.C., Μ.H.Shearer, A.M.Watts, andR.K.Bright, 2003.CD4+T lymphocytes play a critical role in antibody productionand tumour immunity against simian virus401arge tumour antigen.CancerRes.63:1040-1045)。与肿瘤相关肽和HLA-1类分子相结合相比较而言，迄今只对TAA的少量 II 类配体有过描述(www.cancerimmunity.0rg，www.syfpeith1.de)。
[0008]由于HLA-1I类分子的组成性表达通常仅限于免疫系统的细胞(Mach，B.，V.Steimlej E.Martinez-Soriaj and W.Reith.1996.Regulation of MHC class 11genes: lessons from a disease.Annu.Rev.1mmunol.14:301-331)，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽被认为是不可·能的事。然而，Dengjel等人最近成功地在肿瘤中直接识别了 MHC-1I 类抗原的表位(EP04 023546.7，EP05 019 254.1;Dengjel J，NastkeMD, Gouttefangeas C，Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F，Mtlller M, KrimerB，Missiou A，Sauter M，Hennenlotter Jj Wernet Dj Stenzl A，Rammensee HG，KlingelK, Sievanovic S.;Unexpected abundance of HLA class II presented peptides inprimary renal cell carcinomas;Clin Cancer Res.2006;12:4163-4170)。
[0009]对于触发(引发)细胞免疫反应的肽，它必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-1类-结合肽的长度通常为8-10个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(“锚”)。这样，每个MHC的等位基因都有“结合基序”，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合(Rammensee H.G., Bachmann J.and Stevanovicj S;MHC Ligands and PeptideMotifs,Chapman & Halll998)。
[0010]在MHC-1类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-1类分子结合，而且它们还必须能被T细胞负载的特异性T细胞受体(TCR)识别。
[0011]肿瘤特异性T淋巴细胞所识别的抗原，即它们的表位，可以是源自所有类蛋白的分子，如，酶、受体、转录因子等，这些分子在各个肿瘤的细胞中表达上调。此外，肿瘤相关抗原也可以只存在于肿瘤细胞中，例如，突变基因产物或其他开放阅读框架(ORF)或蛋白剪接产物中(Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S，vander Bruggen P,Boon T,Van den Eynde BJ.An antigenic peptide produced by peptidesplicing in the proteasome, Science2004Apr23; 304 (5670): 587-90.)。另一种重要的肿瘤相关抗原是组织特异性抗原，如，表达于不同类型肿瘤和健康睾丸组织中的癌睾丸(CT)抗原。
[0012]多种肿瘤相关抗原已经得到确定。此外，在识别其他肿瘤相关抗原方面也做了大量研究。有些肿瘤相关抗原，在本领域中也称作肿瘤特异性抗原，具有组织特异性。例子包括但(不仅限于)黑色素瘤的酪氨酸酶、前列腺癌的PSA和PSMA、淋巴瘤中诸如bcr/abl的染色体交叉部位。但是，许多得到确定的肿瘤相关抗原出现于多种类型肿瘤中，有些抗原，如，实际上导致转化事件的致癌蛋白和/或肿瘤抑制基因(肿瘤抑制基因是LinehanWM, Walther MM, Zbar B 关于肾癌综述 The genetic basis of cancer of the kidney.JUrol.2003Dec;170(6Ptl):2163-72中所提及的)几乎出现于所有类型的肿瘤。例如，控制细胞生长和分化的正常细胞蛋白，如P53 (—种肿瘤抑制基因)、ras、c_met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu可累积突变,导致这些基因的表达上调，从而致癌(McCartey et al.CancerResearchl99815:582601-5;Disis et al.Ciba Found.Symp.1994，187:198-211)。这些突变蛋白也可是多种癌症的肿瘤特异性免疫反应的一个标靶。
[0013]对于被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而正常健康组织根本不表达或表达数量较少。此外，必要时，各个抗原不仅出现于一种肿瘤中而且浓度(即，每细胞肽的拷贝数)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原通常是源于由于细胞周期调控或凋亡等功能在正常细胞转化为肿瘤细胞中直接受累的蛋白。另外，这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此 可能与肿瘤间接相关。这些肿瘤间接相关抗原也可能是预防接种方法的革巴标(Singh-Jasuja H., Emmerich N.P., Rammensee H.G., Cancer Tmmunol.Tmmunoether.2004Mar; 453 (3): 187-95)。在这两种情况中，至关重要的是，都要存在抗原氨基酸序列的表位，所以这种来自肿瘤相关抗原的肽(“免疫原性肽”)可导致体外或体内T细胞反应。
[0014]基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞反应的前提是存在有着相应TCR的T细胞并且没有这个特定表位的免疫耐受性。
[0015]因此，TAA是开发肿瘤疫苗的出发点。识别和标记TAA的方法基于对患者或健康受试者CTL的使用情况，或基于差别转录特性或肿瘤与正常组织肽差别表达模式情况(Lemmel C., Weik S., Eberle U., Dengjel J., Kratt T., Becker H.D., RammenseeH.G., Stevanovic S.Nat.Biotechnol.2004Apr.; 22 (4): 450-4, T.Weinschenk, C.Gouttefangeas, M.Schirle, F.0bermayr, S.Walter, 0.Schoor, R.Kurek, ff.Loeser, Κ.H.Bichler,D.ffernet, S.Stevanovic, and H.G.Rammensee.1ntegrated functionalgenomics approach for the design of patient-1ndividual antitumor vaccines.Cancer Res.62(20):5818-5827，2002.)。
[0016]然而，识别肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过量或选择性表达的基因，不能提供免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫耐受性需要不存在或达到最低水平，因此，这些抗原表位只有一部分适用于这种情况。因此，只选择那些蛋白过量或选择性表达的肽，并且这些肽与可发现功能性T细胞的MHC分子一起提呈，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为“效应T细胞”，在特异性抗刺激后，可复制扩增并可执行效应功能。
[0017]辅助T细胞在安排抗肿瘤免疫方面的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发Thi细胞反应的辅助T细胞表位支持CD8阳性杀伤T细胞的效应子功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合物)。这样，肿瘤相关T辅助细胞表位单独使用或与其他肿瘤相关肽结合使用可作为刺激抗肿瘤免疫反应疫苗化合物的活性药物成分。
[0018]由于⑶8及⑶4依赖型反应共同和协同促进抗肿瘤作用，因此，⑶8+CTL (配体:MHC-1分子+肽表位)或⑶4阳性CTL (配体:MHC-1I类分子)对肿瘤相关抗原的识别和鉴定对开发肿瘤疫苗非常重要。因此，本发明的一个目标是为可与任一类MHC复合物结合的肽提供新型氨基酸序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1显示了 ESI液相色谱质谱确定的结肠癌样本CCA707的肿瘤相关肽(TUMAP)PCN-002 (图la)、胶质母细胞瘤样本GB1006的T0P-002 (图lb)、胶质母细胞瘤样本GB1006的PTP-001 (图lc)、肾细胞癌样本RCC190的GAL-001 (图1d)、胶质母细胞瘤样本GB1002的CH1-001 (图le)、胶质母细胞瘤样本GB1002的JAK-001 (图1f )、非小细胞肺癌NSCLC库2中的AKR-001 (图lg)、以及胰腺癌样本PC330的FN1-001 (图lh)，这些物质都以MHC-1类限制方式提呈。
[0020]图2显示了 ESI液相色谱质谱确定的胃癌GC库2中的肿瘤相关肽(TUMAP) CEA-009(图2)、胃癌GC库I中的TGFB1-006(图2b)、胶质母细胞瘤样本GB6002的TGFBI_007(图2c)、胶质母细胞瘤样本GB1004的TGFB1-008(图2d)、非小细胞肺癌NSCLC库I中的TGFB1-009(图21e)、以及胶质母细胞瘤样本GB6002的TGFB1-010 (图2f)，这些物质都以MHC-1I类限制方式提呈。
[0021]图3描述了编码胶质母细胞瘤相关肽PTP-001(图3a)和CH1-001(图3b)的两种基因的表达谱。这两种基因在正常组织不表达或表达很低，而在胶质母细胞瘤样本(GB1006T至GBlOlIT ；NCH359T和NCH361T)中表达增加250多倍。
[0022]图4描述了选定肽对HLA_A*0201的结合亲和力，结果用EpI ELISA法根据Sylvester-Hvid, C，Kristensenj N，Blicherj Tj Ferrej H，Lauemollerj SLj Wolf, XAj Lamberth,K, Nissenj MHj Pedersen, L0,和 Buus，S; 2002 年在 “Establishment of a quantitativeELISA capable of determining peptide—MHC class I interaction, TissueAntigens, 59，251 ±-258” 一文的叙述测得。仅对已知与MHC-1类分子结合的肽进行分析。HLA-DR结合肽的亲和力不能 用这种测定法测得。
[0023]图5描述了微球促使的外周血0DC-001和N0X-001特异性⑶8+淋巴细胞增殖的四聚体技术分析。
[0024]与抗⑶28+高密度肿瘤抗原A*0201/0DC-001 (上板)或抗⑶28+高密度肿瘤抗原A*0201/N0X-001(下板)耦合的微球每周对每孔中健康HLA_A*0201的1x106CD8+浓缩PBMC+供体HDlOO进行刺激。经过三次体外刺激，所有的细胞用抗体⑶8FITC+四聚体A*0201/NOX-OOIPE和A*0201/0DC-001APC进行染色。细胞在淋巴细胞群或CD8+淋巴细胞(右板)上得到门控，数字代表⑶8+淋巴细胞群内四聚体+的百分比。
[0025]图6描述了 5个刺激周期后干扰素Y酶联免疫斑点(IFNy ELI SPOT)检测到的TGFB1-004体外免疫原性。
[0026]TGFB1-004反复引发和再刺激细胞，然后以分别相关TGFB1-004 (第1、2、3和4孔)和不相关(阴性对照)肽进行培养。IFNy ELISP0T检测后，对ELISP0T阅读器(CTL，美国克利夫兰)进行分析。植物血凝素离子霉素作为阳性对照。数字表示阳性点计数。
[0027]图7描述了 5个刺激周期后ICS法检测到的TGFB1-004体外免疫原性。
[0028]负载TGFB1-004的DC引发细胞，自体PBMC+TGFB1-004反复再刺激细胞。对于读出细胞分别以相关TGFB1-004 (第1、2、3和4孔)和不相关(阴性对照)肽进行培养。除了细胞内IFNy染色，细胞还用⑶4-FITC和⑶8-PerCP抗体染色。用四色流式细胞仪(BD生物科学公司，德国)进行分析。
[0029]图8描述了 N0X-001肽体外重刺激后T细胞株产生IFN Y的ELISP0T分析。A.T细胞株7+源自供体HBC-154(分选的CD8+N0X-001四聚体+);B.T细胞株7-源自供体HBC-154(分选的⑶8+N0X-001四聚体)。
[0030]分选的⑶8+N0X-001四聚体+ (A.)和分选的⑶8+N0X-001四聚体_ (B.)细胞在用不相关(MLA-001)(上孔)和相关(N0X-001)(下孔)肽(10 μ g/ml)重新刺激之后，用IFNyELISP0T法分析。数字表示阳性点计数。
[0031]图9显示了本发明肽对HLA-A*0201的亲和力。P116HLA-1类肽和病毒标志物HBV-001的解离常数(Kd)用基于ELISA的测定法测得(见“实施例”)。
[0032]发明详述
[0033]在第一方面，本发明提出了一种肽，其包括选自SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.29群组的一个序列、或与SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.29具有80%同源性的其变体、或诱导与该肽发生T细胞交叉反应的一个变体。
[0034]在本发明中，“同源性” 一词系指两个氨基酸序列之间的同一度，如肽或多肽序列。前文所述的“同源”是通过将理想条件下调整的两个序列与待比较序列进行比对后确定的。此处要比对的序列在两个序列最佳排列中可能有增加或删除(例如，序列缺口等)。此类序列同源性可通过使用ClustalW等算法创建一个排列而进行计算(Nucleic AcidRes.，22 (22): 46734680 (1994).也可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是VectorNTI >GENETYX 或由公共数据库，如 http: //dragon, bio, purdue.edu/bioinfolinks/ 提供的分析工具。
[0035]本领域技术人员能评估特定肽变体诱导的T细胞是否可与该肽本身发生交叉反应(Fong, L, Hou, Y, Rivas, A, Benike, C，Yuen, A, Fisher, GA, Davis, MM, and Engleman, EG;2001, Altered peptide ligand vaccination with Flt31igandexpanded dendritic cells for tumor immunotherapy, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A, 98, 8809-8814)、(Zaremba, S, Barzaga, E, Zhu, M, Soares, N, Tsang, KY, andSchlom, J;Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptidefrom human carcinoembryonic antigen,Cancer Res.，1997，57，4570—4577;Colombetti，Sj Fagerbergj T，Baumgartner, P，Chapattej L，Speiserj DEj Ruferj N，Michielinj 0，andLevy,F;, Impact of orthologous me Ian-A peptide immunizations on the ant1-selfmeIan-A/HLA-A2T cell cross-reactivity,J Immunol.，2006，176，6560-6567;Appay，V，Speiserj DEj Ruferj N，Reynard, S，Barbeyj C，Cerottinij JCj Leyvrazj S，Pinillaj C，andRomero, P;Decreased specific CD8+T cell cross-reactivity of antigen recognitionfollowing vaccination with Melan-A peptide, Eur.J Immunol.，2006，36，1805-1814)。
[0036]表1显示了这些肽、各自SEQ ID NO以及亲本蛋白的信息。
[0037]表1:本发明中的肽
[0038]
【权利要求】
1.一种肽，其包括选自SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.3至SEQ ID N0.29群组的一个序列、或与SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.3至SEQ ID N0.29具有80%同源性的其变体、或诱导与该肽发生T细胞交叉反应的一个变体。
2.根据权利要求1所述的肽，其中该肽总长度为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸，最优选为8至16个氨基酸。
3.根据权利要求1或2任一项中所述的肽，其具有与主要组织相容性复合体(MHC)I或II类分子结合的能力。
4.根据权利要求1至3任一项中所述的肽，其中该肽系由或基本系由根据SEQID NOl及SEQ ID N0.3至SEQ ID N029所选的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1至5任一项中所述的肽，其中该肽被修饰或包含非肽键。
6.根据权利要求1至5任一项中所述的肽，其中该肽为融合蛋白，特别是含HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸。
7.—种核酸，其编码根据权利要求1至5任一项中所述的肽。
8.根据权利要求7中所述的核酸，其可能为0嫩、00嫩、？嫩、0應、1?應，也可能为其组合物。
9.根据权利要求7或8中所述的一种能表达核酸的表达载体。
10.根据权利要求1至6任一项中所述的一种肽、根据权利要求7或8任一项中所述的一种核酸、或根据权利要求9中所述的一种表达载体。`
11.根据权利要求7或8中所述的一种宿主细胞或根据权利要求9中所述的一种表达载体。
12.根据权利要求11中所述的宿主细胞，该宿主细胞为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。
13.根据权利要求1至6任一项中所述的一种制备肽的方法，该方法包括根据权利要求11中所述的培养宿主细胞，从宿主细胞或其培养基中分离出肽。
14.一种体外制备激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，该方法包括将CTL与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式激活CTL，其中所述抗原为权利要求1至6任一项中所述的肽。
15.根据权利要求14中所述的方法，其中抗原通过与足够量的含抗原提成细胞的抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞表面的I或II类MHC分子。
16.根据权利要求14中所述的方法，其中该抗原提呈细胞包括一个表达载体，该载体有能力表达含SEQ ID NOl及SEQ ID N0.3至SEQ ID N029的肽或所述变体氨基酸序列。
17.根据权利要求14至16任一项中所述的按其方法制成的激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该淋巴细胞会有选择性地识别一种细胞，该细胞异常表达含权利要求1至4任一项中给定氨基酸序列的多肽。
18.—种杀灭患者中祀向细胞的方法,其中祀向细胞异常表达一种多肽,该多肽含权利要求I至4任一项中给定的氨基酸序列；一种给药方法，其中包括给予患者权利要求14至17任一项中定义的有效量细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
19.根据权利要求1至6任一项中所述的一种肽的用途、根据权利要求7至8中所述的一种核酸的用途、根据权利要求9中所述的一种表达载体的用途、根据权利要求11或12中所述的一种细胞的用途、根据权利要求17中所述的一种作为药剂或制造药剂的激活细胞毒性T淋巴细胞的用途。
20.根据权利要求19中所述的用途，其中药剂系指一种疫苗。
21.根据权利要求19或20中所述的用途，其中药剂有抗癌活性。
22.根据权利要求21中所述的用途，其中所述癌细胞为胶质母细胞瘤细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、肺`癌细胞、肾癌细胞或胃癌细胞。
【文档编号】A61K35/26GK103864893SQ201310724191
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2008年7月25日 优先权日:2007年7月27日
【发明者】哈普利特·辛格, 奥利弗·斯库尔, 克劳迪娅·特劳特温, 诺伯特·希勒夫, 托尼·温斯切尼克, 斯特芬·沃尔特, 彼得·莱温德洛斯基 申请人:伊玛提克斯生物技术有限公司