从泥炭中制备靶向性前药的方法、靶向性前药及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从泥炭中制备靶向性前药的方法，以及由该方法得到的靶向性前药和该前药的用途。所述的方法包括下述步骤：（1）制备生物活性组分和印迹分子；（2）将分别含有生物活性组分和印迹分子的两种反应液混合，进行偶联反应，偶联反应结束后对产物进行提纯，即得靶向性前药。本发明的靶向性前药能够抗病毒细胞，或抑制胃癌、肺癌肿瘤、抗关节炎、白血病；与阿昔洛韦、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺或雷公藤相比，效果相当甚至更佳。
【专利说明】从泥炭中制备靶向性前药的方法、靶向性前药及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从泥炭中制备靶向性前药的方法，以及由该方法得到的靶向性前药和该靶向性前药的用途。
【背景技术】
[0002]泥炭(peat)又称草炭、泥煤，是植物残体腐殖化初期阶段的产物。云南省石屏县宝秀镇的泥炭产地为洼地，具有植物芦苇、苔草、睡菜、拂子茅、席草等低等植物的特征，以草炭为主，也有木炭高等植物的遗骸特征，该泥炭含有纤维素、木质素、腐植酸、蛋白质、浙
主雄
冃寺?
[0003]以目标分子(称为印迹分子)为模板合成药物的方法，可追溯到Pauling提出的以抗原为模板合成抗体的设想；分子印迹技术发端于20世纪70年代，在90年代得到较快发展。分子印迹法制药具有:构效预定性、特异识别性、实用性、稳定性等优点，能够识别生物分子和化学分子，如氨基酸(蛋白质的单体主要有脂族氨基酸，也有少量芳香族氨基酸，如色氨酸、组氨酸等，肽键(-NH-CO-)、硫醚键(-S-S-)、脒键(-N=C-)，酯键、氢键连接起来，形成具有三维网状分子特征的蛋白质)和蛋白质(王战勇，苏婷婷.泥炭固体发酵生产单细胞蛋白的研究.氨基酸和生物资源2007.29(3):12~15)、核苷酸衍生物、药品和食品等。分子印迹法在分离纯化、固相萃取、膜分离、化学传感器、酶催化及药物分析等领域有开发和应用，但尚未见有对矿物源泥炭(草炭)活性组分与印迹分子偶联生物制药的示例。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中缺乏矿物源泥炭(草炭)活性组分与印迹分子偶联生物制药的方法，而提供了一种从泥炭中制备靶向性前药的方法以及由此得到的靶向性前药及其应用。
[0005]本发明提供了一种从泥炭中制备靶向性前药的方法，其包括下述步骤:
[0006]( I)制备生物活性组分和印迹分子；
[0007]其中，制备生物活性组分的方法包括:在有氧条件下，将泥炭与橘青霉菌及其 内酰胺酶混合，和/或与放线菌及其乙酰胆碱酶混合，所述泥炭在所述内酰胺酶
和/或所述乙酰胆碱酶的作用下，于5-75°C发生酶解反应和发酵反应，得含有生物活性组分的反应液a，所述酶解反应和发酵反应的时间为5-70小时；所述的放线菌为灰色链丝菌(Streptomyces griseus)、金色链丝菌(Streptomyces auraofaciens)和刺抱小单抱菌(Micromonospora echinospora)中的一种或多种；
[0008]其中，制备印迹分子的方法包括:在无氧条件下，将泥炭和枝链霉菌及其聚磷酸酯酶和木聚糖酶，和/或酵母菌及其淀粉酶混合，所述泥炭在所述枝链霉菌和/或所述酵母菌的作用下，于5-50°C发生酶解反应和发酵反应，得含有印迹分子的反应液b，所述酶解反应和发酵反应的时间为5-50小时；
[0009]制备生物活性组分和制备印迹分子时所使用的泥炭的质量比为(1-5):(2-10)；[0010](2)将反应液a与反应液b混合,使反应液a中的生物活性组分和反应液b中的印迹分子进行偶联反应，偶联反应结束后对产物进行提纯，即得靶向性前药。
[0011]步骤(1)中，所述的泥炭较佳地包含纤维素2.1-7.5%、木质素7.5-10.5%、腐植酸35.0-45.5%、灰分20.10-23.81%和水分11.39-15.89%，所述的百分比为各成分相对于干燥无灰基(又称daf或可燃基)的质量百分比。
[0012]步骤(1)中，所述的泥炭较佳地为矿物源泥炭，更佳地为石屏泥炭。
[0013]步骤(1)中，所述的酶解反应的酶解模型为本领域常规的酶解模型，较佳地按照下
式所示的酶解模型进fi卜S^^ES^^E + P，式中的E代表酶，S代表底物，ES代表中间产物，P代表最终产物。
[0014]步骤(1)中，在制备生物活性组分时，所述橘青霉菌和/或所述放线菌按照本领域常规方法，以含有所述橘青霉菌和/或所述放线菌的培养基的形式加入。所述的培养基较佳地包括红糖水和胡萝卜汁；所述的红糖水与胡萝卜汁的质量比较佳地为(5-30):(1-5)，所述的红糖水的质量百分浓度较佳地为5% ;所述的胡萝卜汁的质量百分浓度较佳地为5%。所述的培养基中，所述橘青霉菌和/或所述放线菌的活菌数较佳地为(1-9) X 107cfu/mL。
[0015]其中，当所述的培养基中同时含有橘青霉菌和放线菌时，所述的橘青霉菌和所述放线菌的活菌数的比例较佳地为(1-6.5):(0.1-3.5);所述的β-内酰胺酶和所述的乙酰胆碱酶的质量比较佳地为(6-15):(1-3)。
[0016]步骤(1)中，在制备生物活性组分和印迹分子时，所述的泥炭较佳地以泥炭悬浮液的形式加入。所述的泥炭悬浮液中泥炭与水的质量比较佳地为(0.05-20):(0.5-5)。所述的泥炭悬浮液中的培养基较佳地包括红糖水、硫酸钾和胡萝卜汁；所述的红糖水的质量百分浓度较佳地为5% ;所述的胡萝卜汁的质量百分浓度较佳地为5% ;红糖水、硫酸钾和胡萝卜汁的质量比较佳地为(0.05-1.5):0.01:3。
[0017]其中，含有所述橘青霉菌和/或所述放线菌的培养基与所述泥炭悬浮液的质量比较佳地为(0.1:15)- (0.7:1)，更佳地为(0.1:10)- (0.5:1)。
[0018]步骤(1)中，在制备生物活性组分时，所述酶解反应和所述发酵反应的温度较佳地为25-70°C。在制备生物活性组分时，所述酶解反应和发酵反应的时间较佳地为10-50小时。
[0019]步骤(1)中，在制备生物活性组分时，所述的有氧条件可按照本领域常规方法实现，较佳地为通空气实现有氧条件。
[0020]步骤(1)中，所述的生物活性组分较佳地为萜类、留类和醌-酚类物质。所述生物活性组分的浓度较佳地为l-100g/L反应液a。
[0021]步骤(1)中，在制备印迹分子时，所述枝链霉菌和/或所述酵母菌按照本领域常规方法，以含有所述枝链霉菌和/或所述酵母菌的培养基的形式加入。所述的培养基中，所述枝链霉菌和/或所述酵母菌的活菌数较佳地为(1-9) X107cfu/mL。当所述的培养基中同时含有枝链霉菌和所述酵母菌时，所述枝链霉菌和所述酵母菌的活菌数的比例较佳地为(0.3-2 ):(1-10 )，所述的活菌数的单位为亿个/ml。
[0022]本发明中，所述的酵母菌较佳地包括热带假丝酵母菌(C.shehatae)、树干毕赤酵母菌(P.stipitis)和乳克鲁维氏酵母菌(Kluveromyces mar xi anus)中的一种或多种。
[0023]其中，含 有所述枝链霉菌和/或所述酵母菌的培养基与所述泥炭悬浮液的质量比较佳地为(0.1:10)- (0.5:1)，更佳地为(0.1:6)- (0.3:1)。
[0024]步骤(1)中，在制备印迹分子时，所述酶解反应和所述发酵反应的温度较佳地为10-50°C。在制备印迹分子时，所述酶解反应和发酵反应的时间较佳地为10-30小时。
[0025]步骤(1)中，所述印迹分子较佳地为氨基酸、蛋白质和核苷酸类印迹分子。
[0026]步骤(2)中，所述偶联反应的条件为本领域常规条件。所述偶联反应的反应温度较佳地为30-38°C。所述偶联反应的时间较佳地为30-90小时。所述偶联反应较佳地在搅拌条件下进行，所述搅拌的速率为本领域常规，较佳地为60-180r/min。
[0027]步骤(2)中，所述提纯为本领域常规操作，较佳地为采用膜分离技术进行提纯，更佳地为采用微滤膜、超滤膜或纳滤膜进行提纯。所述的超滤膜较佳地采用华东理工大学化学工程膜分离研究所提供的聚砜平板膜。所述的纳滤膜较佳地采用华东理工大学化学工程膜分离研究所提供的聚砜平板膜，或采用华东理工大学生物工程平台提供的陶瓷中空膜。所述的微滤膜较佳地采用华东理工大学生物工程平台提供的陶瓷中空膜。所述的提纯的目的是去除酵母菌、放线菌等丝质体以及NaCl等小分子的盐。
[0028]步骤(2)中，所述提纯之前，体系中的主要成分包括泥炭黄腐酸1.2-5%，棕腐酸
0.8-5.0%，黑腐酸3.0-10.0%，灰分21.0-25.0%和水45.0-67.0% ;所述的百分比为质量百分比。
[0029]本发明还提供了一种由上述方法制备得到的靶向性前药，其包括生物活性组分与印迹分子偶联的产物；本发明的靶向性前药的数均分子量一般为200-1000Da，重均分子量一般为 1100-2000Da。
[0030]本发明还提供了所述靶向性前药在用于制备抑制胃癌、肺癌、抗关节炎或白血病的药物中的应用。
[0031]本发明还提供了所述靶向性前药在抗病毒细胞中的应用，其中所述的病毒细胞较佳地为单疱疫病毒细胞。
[0032]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0033]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0034]本发明的积极进步效果在于:
[0035](I)本发明开创性地采用泥炭进行靶向性前药的制备，通过分子印迹反应制得了能够抗病毒细胞，或抑制胃癌、肺癌肿瘤、抗关节炎、白血病的靶向性前药。
[0036](2)本发明的靶向性前药与阿昔洛韦、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、雷公藤相比，效果相当甚至更佳。
【具体实施方式】
[0037]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0038]下述实施例中，所述的超滤膜采用华东理工大学化学工程膜分离研究所提供的聚砜平板膜。所述的纳滤膜采用华东理工大学化学工程膜分离研究所提供的聚砜平板膜，或采用华东理工大学生物工程平台提供的陶瓷中空膜。所述的微滤膜采用华东理工大学生物工程平台提供的陶瓷中空膜。[0039]实施例1
[0040]本实施例中使用的石屏泥炭包括下述物质:纤维素7.3%、木质素7.5%、腐植酸45.5%的、灰分23.81%和水分15.89%。所述的百分比为各成分相对于干燥无灰基(又称daf或可燃基)的质量百分比。
[0041]所述的泥炭以泥炭悬浮液的形式加入。所述的泥炭悬浮液中泥炭与水的质量比为20:0.5。所述的泥炭悬浮液中的培养基包括红糖水、硫酸钾和胡萝卜汁；所述的红糖水的质量百分浓度为5% ;所述的胡萝卜汁的质量百分浓度为5% ;红糖水、硫酸钾和胡萝卜汁的质量比较佳地为1.5:0.01:3。
[0042](I)制备生物活性组分和印迹分子；
[0043]生物活性组分按下述步骤制备:取石屏泥炭悬浮液100g、柑橘或橙皮中筛选的橘青霉菌及其β -内酰胺酶，以及放线菌(灰色链丝菌(Streptomyces griseus))及其乙酰胆碱酶，混合均匀，其中，橘青霉菌及其内酰胺酶、放线菌及其乙酰胆碱酶以培养基的形式加入，该培养基与石屏泥炭悬浮液的质量比为0.1:10，培养基中橘青霉菌和放线菌的活菌数的比例为1:0.1，β-内酰胺酶和乙酰胆碱酶在培养基中的质量比为15:3 ；
[0044]所述泥炭在所述β -内酰胺酶和所述乙酰胆碱酶的作用下，以
五 + S^^KS^^五+ P的酶解模型，在温度37°C下通空气进行酶解和发酵反应50hr，
得含有浓度为15.2g/L的生物活性组分的反应液a，所述生物活性组分包括游离的萜类、甾类和醌-酚类物质。
[0045]印迹分子按下述步骤制备:在无氧条件下，取石屏泥炭悬浮液lOOOg，上海亚太酿酒有限公司提供的酵母菌(Hansenisa Pora)及其淀粉酶，枝链霉菌及其聚磷酸酯酶和木聚糖酶，所述酵母菌(Hansenisa Pora)及其淀粉酶,枝链霉菌及其聚磷酸酯酶和木聚糖酶以培养基的形式加入，该培养基与石屏泥炭悬浮液的质量比为0.1:10，在温度50°C下、经时间30hr发酵，得含有浓度为12.5g/L的印迹分子的反应液b ;所述的酵母菌为热带假丝酵母菌(C.shehatae)；
[0046](2)将反应液a与反应液b混合,使反应液a中的生物活性组分和反应液b中的印迹分子进行偶联反应，其偶联反应的时间为30h，温度为30°C，偶联反应结束后对产物进行提纯，即得靶向性前药；
[0047]步骤(2)中，所述提纯之前，体系中的主要成分包括泥炭黄腐酸5%，棕腐酸5%，黑腐酸10%，灰分25%和水45%，百分比为质量百分比。
[0048]经酶联免疫检测验证后，实施例1制得的是用于抑制病毒性DNA活动的泥炭活性组分-氨基酸、泥炭活性组分-核苷酸、泥炭活性组分-醌-酚类等的靶向性前药，其数均分子量:200~lOOODa，重均分子量1100~2000Da。
[0049]效果实施例1实施例1的毒性实验(抗肺癌、胃癌)
[0050]取健康小鼠(昆明种小鼠，清洁级，6周龄，18_22g，于清洁级动物实验室内饲养，由复旦动物实验中心提供，动物合格证号为SCXK (沪)(2009-0019))，适应性饲养观察120h，禁食不禁水过夜。次日称重、编号、分组，给药组(实施例1得到的靶向性前药)分为3个剂量组，每组90只小鼠，雌雄各半。以“不等浓度等容积”的原则，即给药分为高、中、低(浓度分别为lg/kg、0.5g/kg、0.25g/kg) 3个剂量组,分别灌胃给予受试药物32ml/kg,分别进行药物急性毒性受试实验。
[0051 ] 上述实验过程和测试方法参考了张大方主编的《药理与中药药理实验》。急性毒性受试实验的实验结果表明:本发明的靶向性前药在治疗胃癌时的半数致死量LD50=2.78g/kg小鼠，在治疗肺癌时的半数致死量LD50=1.48g/kg小鼠。
[0052]效果实施例2实施例1的药效实验(抗肺癌、胃癌)
[0053]经I个疗程后的动物实验，实施例1的靶向性前药与阳性对照药5-氟尿嘧啶相t匕，在肺癌的实验中lg/kg的药剂量比5-氟尿嘧啶的抑制率提高了 16.09%,同时在提高免疫力、提高小鼠肺血清TNFa (肿瘤坏死因子)的含量方面显著高于空白及阳性对照药(见表1)。其中，给药方案PoX 14是指考察周期为14天。
[0054]表1肺药对C57小鼠血清TNF α含量的影响
[0055]
【权利要求】
1.一种从泥炭中制备靶向性前药的方法，其特征在于，其包括下述步骤: (1)制备生物活性组分和印迹分子；制备生物活性组分的方法包括:在有氧条件下，将泥炭与橘青霉菌及其β -内酰胺酶混合，和/或与放线菌及其乙酰胆碱酶混合，所述泥炭在所述β -内酰胺酶和/或所述乙酰胆碱酶的作用下，于5-75°C发生酶解反应和发酵反应，得含有生物活性组分的反应 液a，所述酶解反应和发酵反应的时间为5-70小时；所述的放线菌为灰色链丝菌(Streptomyces griseus)、金色链丝菌(Streptomyces auraofaciens)和刺抱小单抱菌(Micromonospora echinospora)中的一种或多种； 制备印迹分子的方法包括:在无氧条件下，将泥炭和枝链霉菌及其聚磷酸酯酶和木聚糖酶，和/或酵母菌及其淀粉酶混合，所述泥炭在所述枝链霉菌和/或所述酵母菌的作用下，于5-50°C发生酶解反应和发酵反应，得含有印迹分子的反应液b，所述酶解反应和发酵反应的时间为5-50小时； 制备生物活性组分和制备印迹分子时所使用的泥炭的质量比为(1-5):(2-10)； (2)将反应液a与反应液b混合,使反应液a中的生物活性组分和反应液b中的印迹分子进行偶联反应，偶联反应结束后对产物进行提纯，即得靶向性前药。
2.如权利要求1所述的从泥炭中制备靶向性前药的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的泥炭包含纤维素2.1-7.5%、木质素7.5-10.5%、腐植酸35.0-45.5%、灰分20.10-23.81%和水分11.39-15.89%，所述的百分比为各成分相对于干燥无灰基的质量百分比；所述的泥炭为矿物源泥炭，较佳地为石屏泥炭；所述的酶解反应的酶解模型为:E + S ES ￡ + Z5，式中的E代表酶，S代表底物，ES代表中间产物，P代表最终产物。
3.如权利要求1所述的从泥炭中制备靶向性前药的方法，其特征在于，步骤(1)中，在制备生物活性组分时，所述橘青霉菌和/或所述放线菌以含有所述橘青霉菌和/或所述放线菌的培养基的形式加入；所述的培养基较佳地包括红糖水和胡萝卜汁；所述的红糖水与胡萝卜汁的质量比较佳地为(5-30):(1-5)，所述的红糖水的质量百分浓度为5% ;所述的胡萝卜汁的质量百分浓度为5% ;所述的培养基中，所述橘青霉菌和/或所述放线菌的活菌数较佳地为(1-9) X 107cfu/mL ； 当所述的培养基中同时含有橘青霉菌和放线菌时，所述的橘青霉菌和所述的放线菌的活菌数的比例较佳地为(1-6.5): (0.1-3.5);所述的β -内酰胺酶和所述的乙酰胆碱酶的质量比较佳地为(6-15):(1-3)。
4.如权利要求2或3所述的从泥炭中制备靶向性前药的方法，其特征在于，在制备生物活性组分和印迹分子时，所述的泥炭以泥炭悬浮液的形式加入；所述的泥炭悬浮液中泥炭与水的质量比较佳地为(0.05-20):(0.5-5);所述的泥炭悬浮液中的培养基较佳地包括红糖水、硫酸钾和胡萝卜汁；所述的红糖水的质量百分浓度较佳地为5% ;所述的胡萝卜汁的质量百分浓度较佳地为5% ;红糖水、硫酸钾和胡萝卜汁的质量比较佳地为(0.05-1.5):0.01:3 ； 含有所述橘青霉菌和/或所述放线菌的培养基与所述泥炭悬浮液的质量比为(0.1:15)- (0.7:1)，较佳地为(0.1:10) - (0.5:1)； 在制备生物活性组分时，所述酶解反应和所述发酵反应的温度为25-70°C ;所述酶解反应和发酵反应的时间为10-50小时；所述的有氧条件为通空气实现有氧条件；所述生物活性组分的浓度为l-100g/L反应液a。
5.如权利要求2或3所述的从泥炭中制备靶向性前药的方法，其特征在于，步骤(1)中，在制备印迹分子时，所述枝链霉菌和/或所述酵母菌以含有所述枝链霉菌和/或所述酵母菌的培养基的形式加入；所述的培养基中，所述枝链霉菌和/或所述酵母菌的活菌数较佳地为(1-9) X107cfu/mL ;当所述的培养基中同时含有枝链霉菌和所述酵母菌时，所述枝链霉菌和所述酵母菌的活菌数的比例较佳地为(0.3-2): (1-10)，所述的活菌数的单位为亿个/ml ； 所述的酵母菌包括热带假丝酵母菌(C.shehatae)、树干毕赤酵母菌(P.stipitis)和乳克鲁维氏酵母菌(Kluveromyces marxianus)中的一种或多种； 含有所述枝链霉菌和/或所述酵母菌的培养基与所述泥炭悬浮液的质量比为(0.1:10)- (0.5:1)，较佳地为(0.1:6)_ (0.3:1)； 在制备印迹分子时，所述酶解反应和所述发酵反应的温度为10-50°C ;所述酶解反应和发酵反应的时间为10-30小时。
6.如权利要求1所述的从泥炭中制备靶向性前药的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述偶联反应的反应温度为30-38°C;所述偶联反应的时间为30-90小时；所述偶联反应在搅拌条件下进行；所述搅拌的速率为60-180r/min。
7.如权利要求1所述的从泥炭中制备靶向性前药的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的提纯为采用膜分离技术进行提纯，较佳地为采用微滤膜、超滤膜或纳滤膜进行提纯；所述的微滤膜较佳地为陶瓷中空膜；所述的超滤膜较佳地为聚砜平板膜；所述的纳滤膜较佳地为聚砜平板膜或陶瓷中空膜。
8.一种由权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的靶向性前药。
9.如权利要求8所述的靶向性前药在用于制备抑制胃癌、肺癌、抗关节炎、白血病或抗病毒细胞的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的病毒细胞为单疱疹病毒细胞。
【文档编号】A61K47/48GK103690970SQ201310738174
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】吕伟东, 杨俊佳, 刘强, 周霞萍 申请人:云南联合药业有限责任公司, 华东理工大学