一种a型口蹄疫ctl表位肽及筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种A型口蹄疫CTL表位肽及其筛选方法。所述CTL表位肽是由九个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为：Ala-Met-Leu-Arg-Ala-Ala-Thr-Tyr-Tyr。该表位肽能够与来源于不同品系猪的SLA---蛋白有较强的结合能力并能够引起细胞毒性免疫应答，适用于多种品系猪口蹄疫病毒的防治疫苗的制备，应用范围广。本发明利用构建的六品系猪SLA-I单链分子在体外结合口蹄疫病毒的CTL模拟表位肽，质谱测定筛选能够与复合体结合的多肽，并经过ELISPOT检测，确定能够诱导产生T细胞免疫应答能力的模拟表位肽。本发明为今后大量筛选和鉴定口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并为研制猪口蹄疫多表位疫苗奠定了基础。
【专利说明】一种A型口蹄疫CTL表位肽及筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子免疫学领域，具体涉及SLA-1结合并能够引起细胞毒性免疫应答的A型口蹄疫CTL表位肽以及利用SLA-1复合体筛选和鉴定所述CTL表位肽的方法。
【背景技术】
[0002]猪主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex, MHC),亦即猪的白细胞抗原(swine leukocyte antigen, SLA),是猪重要的免疫应答分子。SLA共分为三类，分别为SLA-1、SLA-1I, SLA-1II。其中SLA-1类分子包括重链和轻链，重链具有多态性，功能基因主要为SLA-1, -2, -3ο而轻链由Beta 2微球蛋白(Beta 2 microglobulin,β2πι)基因编码。在细胞内质网，SLA-1重链、抗原多肽与轻链以非共价键结合，形成SLA-1-p印tides复合物，经高尔基体加工后，递呈到细胞表面，与⑶8+ T淋巴细胞受体结合，引起细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)免疫应答，CTL释放细胞因子并杀死被病毒感染的靶细胞。能够与SLA-1类分子结合并能引起细胞毒性免疫应答的多肽即为CTL表位。
[0003]口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是危害偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病的病原，血清型分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial型，各型之间无交互免疫力。由于口蹄疫病毒的流行株不断变异，传统的疫苗已经不能适应口蹄疫防治的要求。含有多种血清型和不同流行株的表位疫苗可以起到防治不同血清型口蹄疫病毒的要求。研制口蹄疫病毒表位疫苗的关键是确定表位，细胞表位包括B细胞表位、辅助性T细胞(T helper, Th)表位和CTL表位。目前，多个B细胞表位和Th表位已经报道。口蹄疫属于严格的细胞内寄生物，体液免疫固然重要，但细胞免疫必不可少。近来的研究表明，在FMDV急性发作期的控制主要是由中和抗体发挥作用，而在FMDV持续性感染期的免疫方面则主要由CTL发挥作用。最近，一些学者开始研究口蹄疫病毒的CTL表位。2006年，Barfoed (Antiviral Res, 2006, 72 (3): 178-89)等证实了一个小鼠 H_2Kd 限制性的来源于口蹄疫病毒非结构蛋白2C的CTL表位KYKEAKEWL，能够在小鼠体内引起CTL反应。另外，Guzman 等(J Gen Virol, 2008, 89 (Pt 3): 667-75)最近也证实了一个牛 BoLA N*02201 限制性的口蹄疫病毒CTL表位，该表位位于O型口蹄疫UKG/2001株结构蛋白的795- 803氨基酸残基，该表位能够引起靶细胞杀伤效应。然而，到目前为止，所有报道的口蹄疫病毒CTL表位都是通过小鼠、牛等动物加以验证，至今还未报道经猪SLA-1类分子直接递呈的口蹄疫病毒CTL表位。
[0004]研究表明，利用体外构建MHC I重链分子、肽及轻链复合体的方法可以在体外筛选病毒表位。White 等(J Immunol, 1999，162 (5): 2671-6)用一个 Linker 将小鼠 MHC-1 的重链和轻链连接，构建了 MHC-1分子，并证明了它可以和抗原肽分子特异结合。Denberg等(Eur J Immunol, 2000, 30 (12): 3522-32)用一个多肽、Linker、重链及轻链 β 2m 构建了人的HLA-A2单链分子，并证明构建的结合多肽的单链分子具有识别细胞受体的功能。在课题组前期研究中，已经构建了六品系猪SLA-1复合体蛋白，并且在pMAL-p2X进行了表达，经检测表达蛋白为可溶性蛋白，并保持良好的蛋白构象。本发明在前期研究的基础上，利用构建的六品系猪SLA-1单链分子在体外结合口蹄疫病毒的CTL模拟表位肽，质谱测定筛选能够与复合体结合的多肽。可结合的多肽经过ELISPOT实验检测多肽的CTL活性。本发明为今后大量筛选口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并为研制猪口蹄疫病毒多表位疫苗奠定基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种能够与SLA---分子结合并能够引起细胞毒性免疫应答的A型口蹄疫CTL表位肽。
[0006]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为一种A型口蹄疫CTL表位肽，所述A型口蹄疫CTL表位肽命名为QA4，其由九个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为:Ala-Met-Leu-Arg-Ala-Ala-Thr- Tyr-Tyr (SEQ ID No:1),即丙氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸_精氨酸_丙氨酸_丙氨酸_苏氨酸_酪氨酸_酪氨酸。 [0007]所述A型口蹄疫CTL表位肽(QA4)来源于A型口蹄疫病毒VPl蛋白，其与来源于不同品系猪的SLA---蛋白均有较强的结合能力，且能诱导猪PBMC极显著释放IFN- Y。
[0008]本发明所述A型口蹄疫CTL表位肽(QA4 )应用于口蹄疫多肽疫苗的制备。
[0009]如上所述的A型口蹄疫CTL表位肽(QA4)的筛选方法，其包括如下步骤:
(O 利用生物学信息软件 netMHCpan2.4(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan)，输入口蹄疫病毒VPl蛋白序列，选择九肽，在SLA基因下预测得到能与SLA---蛋白结合，并提呈到细胞表面引起细胞毒性免疫应答的CTL模拟表位肽，以人工化学法合成上述预测得到的CTL模拟表位肽；
(2)将步骤(1)得到的CTL模拟表位肽和SLA---蛋白的体外结合反应，反应混合物经C-18柱除盐、精制、冷冻干燥后得到固体粉末状SLA----多肽复合物；
(3)SLA----多肽复合物经质谱测定筛选能与SLA---结合的CTL模拟表位肽；
(4)以能与SLA---蛋白结合的CTL模拟表位肽为抗原，以分离得到的口蹄疫感染的猪脾脏淋巴细胞为待测细胞，进行ELISPOT检测，确定能够诱导产生T细胞免疫应答能力的模拟表位肽。
[0010]上述CTL表位肽的筛选和鉴定方法中，步骤(1)所述CTL模拟表位肽的氨基酸序列优选为SEQ ID No:1~4。
[0011]上述CTL表位肽的筛选方法中，步骤(1)所述口蹄疫病毒VPl蛋白序列可以来源于不同血清型的口蹄疫病毒，其血清型可以为O、A、C、SATU SAT2、SAT3和Asial型等。
[0012]上述CTL表位肽的筛选方法中，所述SLA---蛋白来源于长白猪、大约克猪、托佩克猪、荷包猪、烟台猪或莱芜黑猪中的一种或多种。
[0013]利用质谱法测定SLA-1单链分子与多肽的结合，可以非常精确的筛选出能够与SLA-1分子结合的多肽，特异性高。本发明的 申请人:通过前期研究已经构建巴马小型猪SLA-1单链分子，并进行了体外结合筛选口蹄疫病毒多肽，从而证明了该方法的科学性。然而，由于SLA-1类分子存在限制性，来源于不同品系猪的SLA-1可能结合不同的多肽。另外，由于SLA-1类分子限制性的多肽表位可能具有共同锚定残基，不同品系猪SLA-1也可能会结合共同的多肽表位。如果能分离和筛选共同适应于多种品系猪SLA-1的多肽，则会有助于研制具有防治效果的口蹄疫病毒多表位疫苗。本发明通过上述方法筛选和鉴定出与来源于大约克猪、荷包猪、烟台猪或莱芜黑猪的SLA---蛋白均具有良好的结合能力，并能够诱导猪PBMC显著释放IFN- Y的CTL表位肽(QA4)。本发明的CTL表位肽适用于多种品系猪口蹄疫病毒的防治疫苗的制备，应用范围广。
[0014]本发明的有益效果:①本发明的A型口蹄疫CTL表位肽(QA4)与来源于不同品系猪的SLA---蛋白均有较强的结合能力并能够引起细胞毒性免疫应答，适用于多种品系猪口蹄疫病毒的防治疫苗的制备，应用范围广。②本发明为今后大量筛选和鉴定口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并为研制猪口蹄疫多表位疫苗奠定了基础。③本发明的表位多肽也可用于今后与SLA-1蛋白进行体外结晶研究等，有利于研究防治口蹄疫中的分子、细胞作用机制。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为经Amylose亲和层析得到的融合蛋白SLA-1-MBP的SDS-PAGE电泳图，其中:M，代表低分子量蛋白标准品，1-6，分别代表长白猪、大约克猪、托佩克猪、荷包猪、烟台黑和莱芜黑猪SLA-1-MBP纯化蛋白；
图2为Factor Xa切割后的SLA-1-MBP的SDS-PAGE电泳图，其中:M，代表低分子量蛋白标准品，1-6，分别代表长白猪、大约克猪、托佩克猪、荷包猪、烟台黑和莱芜黑猪SLA-1切割后的蛋白，其中SLA-1蛋白大小为41.6kDa，融合蛋白的大小为84.1 kDa ；
图3为DEAE-葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化后的SLA-1的SDS-PAGE电泳图，其中:M，代表低分子量蛋白标准品，1-6，分别代表长白猪、大约克猪、托佩克猪、荷包猪、烟台黑和莱芜黑猪SLA-1纯化蛋白；
图4为Q02与六品系猪SLA-1的体外结合质谱测定结果；
图5为AS3与六品系猪SLA-1的体外结合质谱测定结果；
图6为QA4与与六品系猪SLA-1的体外结合质谱测定结果；
在所述图4~图6中，所述A、B、C、D、E和F分别表示，相应多肽与长白猪SLA-1体外结合质谱测定结果、大约克猪SLA-1体外结合质谱测定结果、托佩克猪SLA-1体外结合质谱测定结果、烟台黑猪SLA-1体外结合质谱测定结果和莱芜黑猪SLA-1体外结合质谱测定结果;
图7为ELISPOT检测多肽诱导CD8+T淋巴细胞产生IFN- Y能力，其中:**代表待测多肽与对照肽相比较差异极显著(P < 0.01)。
[0016]【具体实施方式】
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0017]实施例1六个品系猪SAL-1蛋白的准备
(I)六个品系猪SLA-1/pMAL-p2X重组大肠杆菌的准备
六个品系猪SLA-1/pMAL-p2X重组大肠杆菌，均为大连大学生命科学与技术学院分子免疫学实验室构建保存。所述六个品系猪包括长白、大约克、托佩克、荷包、烟台和莱芜黑猪。所述SLA-1/pMAL-p2X重组大肠杆菌由高凤山等(Gene, 2012, 502 (2): 147-153)中所述的方法获得。[0018](2)诱导表达SLA-1重组大肠杆菌
分别取六个品系猪的SLA-1/pMAL-p2X重组大肠杆菌菌液5mL接种至500mL LB培养基，在170rpm的37度温箱中振荡培养，隔一段时间检测其0D_，待生长至OD6tltl介于0.6至
0.8之间时，加入IPTG至0.5mmol/L, 37度诱导5小时。
[0019](3)融合蛋白MBP-SLA-1亲和纯化
将在上述(2)中用IPTG诱导培养5小时的菌体，3000r/min、离心lOmin，弃上清，加入 50mL 过柱缓冲液 A[20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4),200 mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA(pH8.0), I mmol/L叠氮钠，I mmol/L DTT]重悬菌体。菌体经超声破碎lOmin,90W,破碎5min停5min。菌体超声后4000r/min,离心lOmin,弃沉淀,取上清液。上清液中含有可溶性的融合蛋白SLA-1-MBP，利用麦芽糖结合蛋白(MBP)与柱子中特异性配体结合的性质，进行Amylose亲和层析,融合蛋白SLA-1-MBP被吸附到Amylose柱子上,用12倍柱体积的上述过柱缓冲液A洗脱除掉未结合杂蛋白后，再利用麦芽糖可以与MBP优势结合的性质，用3倍柱体积含有10 mmol/L麦芽糖的洗脱缓冲液(过柱缓冲液A + 10mmol/L麦芽糖)洗脱目的蛋白，洗脱后的液体进行浓缩，得到可溶性的SLA-1-MBP蛋白浓缩液。SLA-1-MBP蛋白浓缩液用SDS-PAGE电泳，检验目的蛋白的条带大小和纯度。结果见图1。图1结果显示，六品系猪SLA-1-MBP纯度约85%，大小为84.lkDa，符合预期SLA-1-MBP蛋白大小。
[0020](4 )融合蛋白切除MBP、分离纯化 由于MBP本身分子量较大，可能会干扰到目的蛋白分子与抗原肽的特异性结合，故需要将融合蛋白中的MBP切除。pMAL-p2X载体上在malE基因和多克隆位点之间，有一个被Xa因子识别的氨基酸序列，Ile-Glu-Gly-Arg，可以切除MBP。
[0021]具体切除方法为:
将步骤(3)得到的MBP-SLA-1融合蛋白用Factor Xa切割，切割条件为:lmol/L NaCl100 μ L, 100 mmoL/L CaCl2 20 μ L, lmol/L Tris-HCl 20 μ L，步骤(3)得到的 SLA-1-MBP蛋白浓缩液 400 μ L (约 I mg SLA-1-MBP 蛋白)，Factor Xa (I U 酶切割 50 mg) 20 U，加灭菌去离子水至I mL。21°C切割20 h，切割后进行SDS-PAGE检测融合蛋白切割情况，结果见图2。图2结果显示，在43kDa处，六个品系猪SLA-1-MBP均切割出一条约41kDa条带，与目的蛋白SLA-1大小41.6kDa 一致。
[0022]切割后的蛋白混合物首先经过Amylose柱纯化，收集过柱缓冲液A洗脱的蛋白样品。收集得到的蛋白样品再经过DEAE Ceramic HyperD F阴离子交换柱分离纯化蛋白，用10个柱体积含0.15 mo I/L NaCl的过柱缓冲液(0.15 moL/L NaCl的20mmoL/LTris-HCKpH 8.0))洗脱，根据分光光度计检测，收集洗脱峰，浓缩后，SDS-PAGE检测目的蛋白SLA-1，结果见图3。图3结果显示，最终收集得到的蛋白呈现单一的条带，大小为41.6kDa，纯度达到了 95%以上，符合进行蛋白功能研究的要求。
[0023]实施例2 口蹄疫病毒模拟表位肽的设计
利用生物学信息软件 netMHCpan2.4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan)，输入O型口蹄疫病毒VPl氨基酸序列(AJ539138)、A型口蹄疫病毒VPl氨基酸序列(GQ406249)及Asial型口蹄疫病毒VPl氨基酸序列(EF149009)，选择九肽，在SLA基因下预测得到能与SLA---蛋白结合，并提呈到细胞表面引起细胞毒性免疫应答的CTL模拟表位肽，共设计了 3条来源于口蹄疫病毒VPl蛋白的9肽，分别命名为Q02、AS3和QA4，其氨基酸序列以及其他基本信息见表1。其中Q02来源于O型口蹄疫的当前国内外流行毒株Tibet/CHA/99 ；AS3 来源于 Asial 型口蹄疫毒株流行株 Asia l/Jiangsu/China/2005 ；QA4来源于A型口蹄疫国际流行株A/VN/03/2009。另外，设计和合成了非相关对照肽Co。各表位肽以冻干状态储存于_80°C，备用。
__表1.-CTL表位肱及其相关信息_
【权利要求】
1.一种A型口蹄疫CTL表位肽，其特征在于:所述表位肽的氨基酸序列为:Ala-Met-Leu-Arg-AIa-AIa-Thr-Tyr-Tyr0
2.如权利要求1所述的C`TL表位肽在制备防治口蹄疫多肽疫苗中应用。
【文档编号】A61P31/14GK103724405SQ201310746389
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】高凤山 申请人:大连大学