一种香菇多糖的提取及分级方法
【专利摘要】本发明提供了一种香菇多糖的提取及分级方法，首先将香菇依次进行干燥、粉碎、浸泡、水提得到香菇多糖粗提物；然后将得到的香菇多糖粗提物依次用氯苯、氯化钙、草酸铵、胰蛋白酶、Sevage试剂进行除蛋白，最后采用醇沉的方法即可制备得到香菇多糖。此方法在提取制备香菇多糖时，具有较高的产率，并且避免了采用酸或碱对香菇多糖造成的破坏，提纯后得到的香菇多糖具有较高的纯度，能够通过分级得到不同重均分子量的香菇多糖，且分子量分布范围较窄，在机体免疫调节和肿瘤辅助治疗中有广阔的应用前景。
【专利说明】一种香菇多糖的提取及分级方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及有效成分提取分级【技术领域】，尤其涉及一种香菇多糖的提取及分级方法。
【背景技术】
[0002]香菇属于担子菌纲伞形真菌，是世界上十分流行的食用菌。香菇中的主要成分是香菇多糖，多以混合多糖的形式存在，包括4种杂多糖和2种葡聚糖，其中，具有生物活性的是葡聚糖，其结构以(I— 3)吡喃葡萄糖苷键为主链，以β- (I —6)吡喃葡萄糖苷键为分支。
[0003]现代研究表明香菇多糖具有调节免疫力，抗肿瘤，降血糖，抗病毒及抗氧化等功能。香菇多糖对机体具有免疫调节作用，主要是由于其属于典型的T细胞激活剂，在体内能促进迟发超敏反应，提高抗体依赖性细胞毒细胞活性，同时还能诱导产生急性蛋白诱导因子等因子，从而产生相关免疫应答。有报道表明香菇多糖能够抑制小鼠S-180实体瘤的生长，同时对于治疗结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等都有良好的疗效，且能延长肿瘤患者的存活时间，也能够极大的减轻化疗带来的副作用；临床应用也发现，香菇多糖可改善乙肝患者的乏力、恶心、腹胀等常见症状，促进转氨酶和胆红素恢复正常；香菇多糖还对Abelson病毒、Α2 (Η2Ν2)病毒、12型腺病毒及流感病毒等均有抑制作用。
[0004]虽然近年来香菇多糖在临床应用上越来越受到人们的重视，但是其作用机制还不十分明确，特别是抗肿瘤活性的机理，其中很重要的一个原因就是香菇多糖本身的复杂性。
[0005]因此，对香菇多糖进行提取分级，对于研究香菇多糖的作用机制有非常重要的意义。目前对于香菇多糖的提取方法主要包括:稀碱提取法，多以氢氧化钠为提取剂，提取可以得到较多的碱溶性多糖，不能但是这种方法得到的多糖杂质较多，多糖也易被破坏；还有稀酸提取法，多以三氯乙酸为提取剂，可以得到较多的酸溶性多糖，但是多糖也易被破坏；还有稀盐提取法，多以氯化锌为提取剂，但是这种方法提取率较低，对原料造成较大的浪费；此外，还有微波、超声波法，以去离子水为提取剂，但是热敏性多糖易被破坏。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种香菇多糖的提取及分级方法，不会对多糖造成破坏，并且对多糖的提取率较高，同时能够对多糖进行较好的分级。
[0007]本发明提供了一种香菇多糖的提取方法，包括:
[0008]Α)将香菇依次进行干燥、粉碎、浸泡、水提得到香菇多糖粗提物；
[0009]B)将步骤Α)得到的香菇多糖粗提物依次用氯苯、氯化钙、草酸铵、胰蛋白酶、Sevage试剂进行除蛋白，最后采用醇沉的方法得到香菇多糖。
[0010]优选的，所述粉碎的粒度为50目~300目。
[0011]优选的，所述浸泡的时间为12h~72h ;所述水提的温度为60V~98°C。
[0012]优选的,所述氯化?丐的用量为所述香菇的10wt%~40wt% ;所述草酸铵的用量为所述香燕的lwt%~5wt%。
[0013]优选的，所述醇沉的方法采用的醇为乙醇。
[0014]优选的，所述步骤B)中，在依次用草酸铵、胰蛋白酶对香菇多糖粗提物进行除蛋白的步骤中间，还包括:加入氯化钠。
[0015]优选的，所述步骤B)中，在用Sevage试剂对香菇多糖粗提物进行除蛋白后，还包括:加入活性炭。
[0016]本发明还提供了一种上述提取方法得到的香菇多糖分级的方法，包括:
[0017]用丙酮对香菇多糖进行分级沉淀，得到分级后的香菇多糖。
[0018]优选的，所述方法具体为:
[0019]a)将通过权利要求1所述的提取方法得到的香菇多糖溶解于蒸馏水中，加入丙酮至出现沉淀，离心得到上清液和沉淀，所述沉淀为第一级香菇多糖；
[0020]b)取步骤a)中得到的上清液，加入丙酮至出现沉淀，离心得到上清液和沉淀，所述沉淀为第二级香菇多糖；
[0021]c)重复上述过程，至丙酮浓度达到90wt%。
[0022]本发明还提供了一 种香菇多糖在制备增强免疫力的药物或食品中的应用，所述香燕多糖的重均分子量为16200。
[0023]与现有技术相比，本发明提供了一种香菇多糖的提取方法，采用了除蛋白的复合方法，首先将香菇依次进行干燥、粉碎、浸泡、水提得到香菇多糖粗提物；然后将得到的香菇多糖粗提物依次用氯苯、氯化钙、草酸铵、胰蛋白酶、Sevage试剂进行除蛋白，最后采用醇沉的方法即可制备得到香菇多糖。此方法在提取制备香菇多糖时，具有较高的产率，并且避免了采用酸或碱对香菇多糖造成的破坏，提纯后得到的香菇多糖具有较高的纯度，能够通过分级得到不同数均分子量的香菇多糖。本发明提供的香菇多糖纯度很高，几乎不存在杂质及有害物质，故经过灭菌处理后即可用于体外体内实验进行生物活性研究，而分级后的不同数均分子量的香菇多糖对研究香菇多糖的生物活性机理更有重要意义，因此本发明提供的提取方法有利于香菇多糖的进一步研究及开发。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例23制备的香菇多糖的红外图谱；
[0025]图2是本发明实施例23制备的香菇多糖的核磁共振氢谱图；
[0026]图3是本发明实施例24~42分级得到的香菇多糖的渗透凝胶电泳图；
[0027]图4是本发明实施例43中小鼠体重变化图；
[0028]图5为本发明实施例43中小鼠脾脏指数变化图；
[0029]图6为本发明实施例43中小鼠胸腺指数变化图；
[0030]图7为本发明实施例43中小鼠外周血白细胞数变化图；
[0031]图8为本发明实施例43中小鼠骨髓微核数变化图。
【具体实施方式】
[0032]本发明提供了一种香菇多糖的提取方法，包括:
[0033]A)将香菇依次进行干燥、粉碎、浸泡、水提得到香菇多糖粗提物；[0034]B)将步骤A)得到的香菇多糖粗提物依次用氯苯、氯化钙、草酸铵、胰蛋白酶、Sevage试剂进行除蛋白，最后采用醇沉的方法得到香菇多糖。
[0035]本发明通过除蛋白的复合方法对香菇多糖进行提取，选用氯苯、氯化钙、草酸铵、胰蛋白酶、Sevage试剂等进行除蛋白，具有较高的产率，并且避免了采用酸或碱对香菇多糖造成的破坏，提纯后得到的香菇多糖具有较高的纯度，能够通过分级得到不同数均分子量的香菇多糖。本发明提供的香菇多糖纯度很高，几乎不存在杂质及有害物质，故经过灭菌处理后即可用于体外体内实验进行生物活性研究，而分级后的不同数均分子量的香菇多糖对研究香菇多糖的生物活性机理更有重要意义，因此本发明提供的提取方法有利于香菇多糖的进一步研究及开发。
[0036]本发明提供的香菇多糖的提取方法，包括以下步骤:
[0037]首先是香菇多糖粗提物的制备，即将香菇依次进行干燥、粉碎、浸泡、水提得到香菇多糖粗提物，具体操作步骤如下:
[0038]将香菇洗净去柄，60°C~80°C风干干燥，粉碎至50目~300目，然后在粉碎后的样品中加入蒸馏水，所述蒸馏水的体积与香菇的质量的比例优选为(IOmL~200mL):1g,更优选为(IOOmL~150mL):lg，加入蒸馏水后浸泡12h~72h，然后再60°C~98°C高温水浴12h~48h进行水提，水提后将溶液冷却至室温并用碳酸氢钠调整pH值至5.0~8.0，更优选调整至6~7，再加入复合蛋白酶水解蛋白，35°C~55°C，更优选40°C~50°C水浴反应Ih~3h,再在搅拌子搅拌下80°C~90°C水浴Ih~3h使酶失活,然后冷却，过滤,残洛用蒸馏水复溶，重复I~3次，收集滤液，得到香菇多糖水提物粗产品。所述粉碎的粒度更优选为100目~300目；所述水提的温度更优选为85°C~95°C，高温水浴的时间更优选为20h~40h ;所述复合蛋白酶的用量优选为香燕的lwt%~5wt%,更优选为2wt%~4wt%。
[0039]得到香菇多糖水提物粗产品后，对其进行醇沉，具体的，将滤液以3500rpm~4500rpm的转速离心IOmin~3`0min,收集上清,将上清液40°C~50°C旋转蒸发浓缩体积至原体积的1/15~1/3,然后加入浓缩液的3~8倍(体积比)无水乙醇，搅拌混合30min~60min,静置，以7000rpm~9000rpm的转速离心IOmin~30min并收集沉淀,将沉淀加蒸懼水复溶，重复上述醇沉步骤3~5次，最后得到的沉淀真空冷冻干燥，得到香菇多糖的粗提物。所述乙醇更优选加入5~7倍(体积比)。
[0040]得到香菇多糖粗提物后，对其进行纯化，具体的，在香菇多糖粗提物中加入蒸馏水，所述蒸馏水的体积与香菇的质量的比例优选为(2mL~IOmL):lg，加入蒸馏水后对其适当搅拌加热至充分溶解，然后加入氯苯进行提纯，搅拌30min后离心收集上清，上清液重复上述氯苯处理的步骤5~8次，最终得到氯苯处理后的香菇多糖溶液；所述氯苯的用量优选为溶液体积的1/4~1/2，更优选为1/3。加入氯苯的目的为除蛋白。
[0041]然后在上述氯苯处理后得到的香菇多糖溶液中加入无水氯化钙，持续沸腾Imin~3min,再5000rpm~7000rpm离心3~5min后收集上清,上清液中加入草酸铵并电动揽拌30min~60min,然后5000rpm~7000rpm离心3~5min收集上清，得到草酸铵处理后的香菇多糖溶液；所述无水氯化钙的用量优选为香菇的10wt%~40wt% ;所述草酸铵的用量优选为香菇的lwt%~5wt%。优选的，在加入氯化钙、草酸铵进行除蛋白后，在得到的上清液中还加入氯化钠过饱和并电动搅拌0.5h~3h,然后7000rpm~9000rpm离心8~IOmin收集上清，加氯化钠的目的为析出蛋白质。[0042]得到上述草酸铵处理后的香菇多糖溶液后，用碳酸氢钠调整其pH值到7.5~8.5，然后加入胰蛋白酶，得到胰蛋白酶水解蛋白后的香菇多糖溶液，所述胰蛋白酶的加入量优选为香燕的5wt%~15wt%。
[0043]采用胰蛋白酶水解蛋白后，将得到的香菇多糖溶液加入0.5~I倍体积的Sevage试剂(三氯甲烧:正丁醇=4:1),电动搅拌IOmin~30min,然后1000rpm离心3min~5min,分液去除下层液体，继续5000rpm~7000rpm离心3min~5min收集上清,上清液重复上述加入Sevage步骤3~8次,将最终收集的上清液旋转蒸发浓缩体积至原体积的1/5~1/4，收集上清液并加入3~8倍体积的无水乙醇，搅拌混合30min~60min，静置，然后3500rpm~4500rpm离心IOmin~30min收集沉淀,将沉淀加入蒸懼水复溶,重复上述醇沉的步骤3~5次，将最终得到的沉淀依次用无水乙醇清洗2~4次，无水乙醚清洗2~4次，真空抽干得到纯化的香菇多糖。优选的，用Sevage试剂对香菇多糖粗提物进行除蛋白后，还包括:加入活性炭，所述活性炭的用量优选为香菇的lwt%~ 3wt%。加入活性炭的作用是脱色。
[0044]采用红外吸收和核磁共振对制备的香菇多糖结构进行表征，结果表明，本发明所提取的香菇多糖具有式(I)所示结构:
[0045]
【权利要求】
1.一种香燕多糖的提取方法，包括: A)将香菇依次进行干燥、粉碎、浸泡、水提得到香菇多糖粗提物； B)将步骤A)得到的香菇多糖粗提物依次用氯苯、氯化钙、草酸铵、胰蛋白酶、Sevage试剂进行除蛋白，最后采用醇沉的方法得到香菇多糖。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述粉碎的粒度为50目~300目。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述浸泡的时间为12h~72h;所述水提的温度为60°C~98°C。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述氯化钙的用量为所述香菇的10wt%~40wt% ;所述草酸铵的用量为所述香燕的lwt%~5wt%。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述醇沉的方法采用的醇为乙醇。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤B)中，在依次用草酸铵、胰蛋白酶对香菇多糖粗提物进行除蛋白的步骤中间，还包括:加入氯化钠。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤B)中，在用Sevage试剂对香菇多糖粗提物进行除蛋白后，还包括:加入活性炭。
8.—种经权利要求1所述的提取方法得到的香菇多糖分级的方法，包括: 用丙酮对香菇多糖进行分级沉淀，得到分级后的香菇多糖。
9.根据权利要求8所述的分级方法，其特征在于，所述方法具体为: a)将通过权利要求1所述的提取方法得到的香菇多糖溶解于蒸馏水中，加入丙酮至出现沉淀，离心得到上清液和沉淀，所述沉淀为第一级香菇多糖； b)取步骤a)中得到的上清液，加入丙酮至出现沉淀，离心得到上清液和沉淀，所述沉淀为第二级香菇多糖； c)重复上述过程，至丙酮浓度达到90wt%。
10.香菇多糖在制备增强免疫力的药物或食品中的应用，所述香菇多糖的重均分子量为 16200。
【文档编号】A61P11/00GK103724447SQ201310753452
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】丁建勋, 许维国, 庄秀丽, 陈学思 申请人:中国科学院长春应用化学研究所