治疗血红蛋白病的组合物和方法

治疗血红蛋白病的组合物和方法
【专利摘要】本发明提供治疗诸如地中海贫血和镰状细胞病的血红蛋白病的组合物和方法。组合物和方法包含/包括一种或多种内切核酸酶或内切核酸酶融合蛋白，该内切核酸酶或内切核酸酶融合蛋白包括一种或多种归巢内切核酸酶和/或归巢内切核酸酶融合蛋白和/或CRISPR内切核酸酶和/或CRISPR内切核酸酶融合蛋白：(a)以破坏Bel11a编码区；(b)以破坏Bel11a基因调节区；(c)以修饰成人β-球蛋白基因座；(d)以破坏HbF沉默DNA调节元件或通路，诸如Bel11a-调节的HbF沉默区；(e)以突变一种或多种γ-球蛋白基因启动子来实现γ-球蛋白基因表达增加；(f)以突变一种或多种δ-球蛋白基因启动子来实现δ-球蛋白基因表达增加；和/或(g)以修正一种或多种β-球蛋白基因突变。
【专利说明】治疗血红蛋白病的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请作为PCT国际专利申请于2013年2月22日提交，并要求2012年2月24 日提交的美国临时专利申请No. 61/603, 231的优先权，其公开内容在此以全文引用的方式 并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申请包括作为txt文件的电子形式的序列表，其标题是"序列表 54428. 0006W0U1_ST25"并于2013年2月22日创建并且其大小为174千字节（KB)。所述 txt文件"序列表54428. 0006W0U1_ST25"的内容通过引用方式并入本文。

【技术领域】
[0005] 本公开总体涉及遗传病的治疗。更具体地，本公开提供用于改变球蛋白基因表达 的基于内切核酸酶的组合物和方法，包括基于归巢内切核酸酶和基于Cas9内切核酸酶的 组合物和方法，所述组合物和方法用于治疗地中海贫血、镰状细胞病和其它血红蛋白病。

【背景技术】
[0006] 血红蛋白病，诸如地中海贫血和镰状细胞病，是在全球导致显著健康负担的非常 普遍的红细胞遗传病。每年有超过1，300, 000名患有严重血红蛋白病症的患者出生。当全 球人口的5%是携带者时，对于临床显著形式的地中海贫血和镰状细胞病（SCD)的出生率 分别是〇. 44个/千人和1. 96个/千人。
[0007] 在正常状态下，哺乳动物红系细胞中存在的血红蛋白主要由两条α样链（多肽） 和两条β样链的异源四聚体构成。所述β_球蛋白基因座的五个基因以簇的形式位于染 色体11上。所述基因在红系细胞中表达，并且伴随发育在特异性位置进行；所述ε、A Υ 和GY、及δ和β基因主要分别在胚胎期、胎儿期和产后期表达。出生时95%的β样 链是Υ，剩下的是β。这一比率在出生后第一年逐渐转变，这解释了为什么限于β_球 蛋白基因的表型诸如镰状细胞和大多数β_地中海贫血直到数月大时才表现出来。基于 染色体16的α样基因的表达不同；胚胎ζ-基因与ε的表达对应，但是成对的α-基 因从胎儿期开始表达。因此，α异常在子宫内表现，潜在地伴有毁灭性的结果（如胎儿水 肿）。所得的α -异源四聚体、β -异源四聚体伴随发育表达；胚胎：Hb Gowerl ( ζ 2, ε 2)、 Hb Gower2(a2，e2)和 Hb ?〇竹1&11(1((2，￥2);胎儿：册卩（胎儿）（〇2，￥2)以及成人 ： HbA2 ( a 2, δ 2)和 HbA (成人）（a 2, β 2)。
[0008] β-地中海贫血的起因是成人β-球蛋白基因座的异常，进而导致β样球蛋白链 与α样链的异常化学计量，造成未配对的α样链沉淀。地中海贫血的严重程度直接与该 球蛋白链的不平衡度相关。接下来通过数条通路介导的损伤（包括细胞蛋白和膜蛋白的氧 化）的最终结果是无效的红细胞生成、凋亡和红细胞存活减少。已经描述了导致β_地中 海贫血的超过200个突变。
[0009] 镰状细胞病的起因是球蛋白基因内的单核苷酸置换，进而造成谷氨酸被缬氨 酸在肽的第6位氨基酸处所置换，产生i3S。与正常成人血红蛋白（HbA)相反，携带该突变 的血红蛋白S(a 2, β S2)被称为HbS。在低氧浓度的情况下，HbS发生别构变化，在别构位 点处其可聚合。脱氧形式的血红蛋白在E和F螺旋之间的蛋白上呈现疏水补丁。在血红蛋 白β -链的第6位处的疏水性缬氨酸形成疏水补丁，所述疏水补丁可与其它血红蛋白S分 子的疏水补丁相结合，导致血红蛋白S分子聚集并形成纤维沉淀，继而引起红细胞变为镰 刀状并导致数条通路变化，这通过血管堵塞和溶血导致组织损伤。
[0010] 尽管β -地中海贫血和镰状细胞病（S⑶）分别是β -球蛋白基因座的定量病症和 定性病症，但正常β样球蛋白基因的表达可改善这两种疾病。在地中海贫血中，任何对球 蛋白链不平衡的改进都可为每个细胞提供选择优势，并产生临床效益。在镰状细胞病中，正 常或某些突变的β样链的存在可通过比突变的镰状细胞链更有效地竞争a样链从而减少 HbS的量，通过形成阻断Hbs (如HbF)的聚合的血红蛋白和增加每个细胞非镰变血红蛋白的 量，来改善临床表型。例如，在镰状细胞病中，仅8%的胎儿血红蛋白（HbF)水平可抑制HbS 聚合，这导致存活率提高，而20%的HbF水平提供近乎完全的表型校正。重要的是，含有正 常HbA的供体红系细胞的后代在造血干细胞移植（HSCT)之后具有超过含HbS的内源来源 的细胞的较强选择性优势。在骨髓中有11 %供体细胞的患者具有35%的供体BFUe和73% 的供体红细胞，这导致输血独立性。因此，修正相对小部分的移植HSC具有临床益处。
[0011] 严重型地中海贫血需要慢性输血，这导致铁过量。尽管费用、副作用和依从性严重 限制了功效，但存活率与螯合功效直接相关。FDA批准的唯一针对SCD的药物是羟基脲，其 可降低发病率和死亡率。然而，该治疗剂量过小，依从性差，且其不能完全保护健康。
[0012] 对于每年数以千计的患有恶性血液病和相关病症的患者来说，造血细胞移植 (HCT)是重要的治疗选择。根据国际血液和骨髓移植研究中心（CIBMTR)，在2009年进行了 大约60, 000例移植，与过去的十年相比每年增加超过15, 000例的移植。移植的有效性也 增加了，更多的近期结果表明复发的风险、非复发的死亡率和总死亡率显著降低。Gooley 等，N. Engl. J. Med 363:2091-101(2011)。
[0013] 来自HLA-匹配的同胞或不相关的供体的同种异体造血细胞移植（HCT)治愈了患 有血红蛋白病的患者，但受限于对适度匹配的相关或不相关供体的需要，且并发移植物抗 宿主病（GVHD)和感染。此外，主要障碍是高移植失败率，其高于对恶性肿瘤HCT所观察到 的移植失败率。可替代的方法包括用供体脐带血细胞进行HCT，因为几乎所有患者的脐带血 供体可被鉴别。额外的实验方法着重于使用患者自身的造血干细胞（HSC)并诱导内源球蛋 白基因表达，或添加外源β样球蛋白基因。
[0014] 对于许多不能找到供体的患者特别是那些少数族裔或混血背景的患者来说，脐带 血（CB)移植可最有希望治愈疾病。作为供体干细胞（在出生时易于收集，且母亲或婴儿没 风险）的来源，CB的优点还为易于获取和可安全用于HLA-不匹配的情况而不增加 GVHD风 险。
[0015] 不幸地是，几种因素，包括在许多脐带血单元可获得的低细胞剂量，导致在成人和 较大儿童中植入缓慢和移植相关死亡率升高。嗜中性粒细胞和血小板的显著延迟的造血功 能重建对于脐血移植（CBT)接受者是已知的风险因素，并且与在单份或双份CB移植物中提 供的低的总有核细胞（TNC)和CD34+细胞剂量有关。类似地，这些低的细胞数与较高的移 植失败率相关，因此存在移植失败高风险的血红蛋白病特别受到关注。实际上，最近对成人 单份CBT接受者的分析表明输注的CD34+细胞剂量是骨髓样植入最重要的预测物。
[0016] 当与匹配和不匹配的不相关供体接受者相比时，非复发性死亡率（NRM)在双份 CBT (dCBT)接受者中最高。Brunstein 等，Blood U6 :4693-9(2010) 〇 大部分 NRM 在移植 后的前100天内发生，其中感染是最常见死因。重要的是，对dCBT接受者中的NRM风险因 素进行的分析显示，如果恢复> 26天（即，植入dCBT接受者的中值时间），则骨髓样恢复 延迟（嗜中性细胞绝对计数（ANC) >500/ml所需的时间）的患者具有较高的风险。然而，当 对NRM风险因素的分析限制为仅包括那些在第26天前移植的dCBT接受者时，未发现各种 供体来源之间存在差异，这就突出了延迟植入对NRM风险增加的重要作用。
[0017] 此外，在干细胞移植后给定的任何一天>100的ANC此前已经显示是在移植后第 100天之前死亡率风险降低的重要阀值（Offner等，Blood型：4058-62(1996))。因此，在 CBT接受者中观察到的骨髓样恢复的显著延迟仍然是CBT情况下获得成功结果的主要障 碍。不仅增加可用于移植的CB祖细胞的绝对数量的能力，而且增加可可靠产生移植后骨髓 样更快速恢复的细胞的能力，都应能改进进行CBT的患者的总存活。可开发利用脐带血干/ 祖细胞离体扩增的策略以克服脐带血移植物中可用的细胞剂量较低，目的是增强CBT的造 血恢复和总存活。
[0018] 为了克服在用脐带血（CB)移植之后发生的嗜中性粒细胞恢复显著延迟，已经研 究了 Notch信号传导通路在调节造血干/祖细胞的离体扩增中的作用，以产生数量增加的 能够在体内快速再生的祖细胞。已经开发了使用工程化的Notch配体（δ 1)的临床上可行 的方法，该方法使得⑶34+细胞的绝对数量呈多对数增长（multi-log increase)并且产生 能够在体内快速再生的细胞疗法。
[0019] 与一个即时性组的29名用两种非操作性的CB单元进行相同治疗的患者所需的25 天的中值时间（P〈〇. 0001)相比，扩增的、HLA-部分匹配细胞的输注导致获得500/ml的初 始嗜中性粒细胞绝对计数（ANC)的中值时间显著降低至仅仅11天。尽管治疗的患者的数 量较少（即η = 14)，但就本方法的安全和临床可行性而言，仍表现出对骨髓样恢复时间具 有显著作用。
[0020] 尽管在三十多年间许多实验室投入了大量的资源，但在血红蛋白病的治疗方案开 发方面几乎未取得进展，主要归因于缺乏经鉴别的可药性靶和需要基因疗法载体能够以相 当高的水平持续表达而不引起插入诱变。尽管胎儿血红蛋白（HbF)的表达增加改善了这两 种血红蛋白病，但大量的研究并未基于此观察产生可行的新药剂。几个研究人员正在推行 使用整合慢病毒载体的造血干细胞（HSC)基因疗法。然而，HSC基因疗法需要高水平的持 续表达并且具有潜在的插入诱变和白血病的风险。
[0021] 本领域迫切需要的是展现出对治疗包括地中海贫血和镰状细胞病的血红蛋白病 有改进功效，同时克服现有治疗形式的安全顾虑的组合物和方法。


【发明内容】

[0022] 本公开尤其通过提供治疗血红蛋白病的组合物和方法，阐明了本领域的这些和其 它相关需求。本文公开的组合物和方法采用编码一种或多种内切核酸酶或内切核酸酶融合 蛋白的一种或多种多核苷酸，所述一种或多种内切核酸酶或内切核酸酶融合蛋白包括一种 或多种归巢内切核酸酶和/或归巢内切核酸酶融合蛋白和/或一种或多种CRISPR内切核 酸酶（即联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶）和/或CRISPR内切核酸酶融合 蛋白（即联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶融合蛋白）：(a)以破坏Bcllla编 码区或BclIla基因调节区；(b)以破坏HbF沉默DNA调节元件或通路，诸如BclIla调节的 HbF沉默区；（c)以突变一种或多种Y-球蛋白基因启动子来实现Y-球蛋白基因表达增 加；（d)以突变一种或多种δ-球蛋白基因启动子来实现δ-球蛋白基因表达增加；和/或 (e)以修正一种或多种β-球蛋白基因突变。
[0023] 在第一个实施方案中，本公开提供包含/包括编码一种或多种诸如归巢内切核酸 酶（HE)和/或CRISPR内切核酸酶（即联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶） 的内切核酸酶的多核苷酸的组合物和方法，以实现对Bcllla编码区或Bcllla基因调节区 内的序列的靶向破坏，从而将诸如Y-球蛋白基因或ε-球蛋白基因的内源基因的表达提 高至治疗水平。在相关的方面，这些实施方案的组合物包含编码一种或多种TALEN、一种或 多种TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸。
[0024] 在第二个实施方案中，本公开提供包含/包括多核苷酸的组合物和方法，所述多 核苷酸编码诸如归巢内切核酸酶（HE)或CRISPR内切核酸酶（即联合一种或多种RNA引导 链的Cas9内切核酸酶）的一种或多种内切核酸酶以实现对β-球蛋白基因基因座内的关 键调节序列的靶向破坏，从而将诸如Y-球蛋白基因或S-球蛋白基因的内源基因的表达 提高至治疗水平。在相关的方面中，这些实施方案的组合物包含编码一种或多种TALEN、一 种或多种TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸。
[0025] 在本实施方案的某些方面，提供靶向β_球蛋白基因基因座（于HG18中的 chrll:5212342-5215944)中的 3. 6kb 区（SEQ ID Ν0:1)的 HE 和 CRISPR 内切核酸酶，所述 3. 6kb区含有调节蛋白Bcllla的结合位点。
[0026] 本文描述的归巢内切核酸酶和CRISPR内切核酸酶与常规的基因靶向核酸酶相比 展现出独特的优势。因为无论基因型如何它们都广泛有效，故本文描述的联合一种或多种 RNA引导链的归巢和Cas9内切核酸酶并不具有患者特异性，它们在杂合的状态下提供了临 床益处并且避免载体序列插入。
[0027] 在第三个实施方案中，本公开提供了组合物和方法，以用于经由基因组编辑扼要 重述患者基因组中的一种或多种天然存在的突变，从而提供包括例如缺失或非缺失型遗传 性胎儿血红蛋白持续症（HPFH)的临床益处。更具体地，本公开提供通过基因组编辑实现地 中海贫血和/或镰状细胞病（SCD)突变的直接修正的组合物和方法。
[0028] 在本实施方案的某些方面，将一种或多种归巢内切核酸酶与正常或野生型多核苷 酸序列（修正模板）联用，以允许编辑和/或修复诸如β样球蛋白基因的一种或多种基 因序列。这些归巢内切核酸酶允许通过包含一种或多种天然存在的突变的多核苷酸的瞬 时表达，修饰基因座（在本文中以人β-球蛋白基因基因座为例）中的关键调节和/或编 码序列。在相关的方面，这些实施方案的组合物包含编码一种或多种TALEN、一种或多种 TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸。
[0029] 更具体地，本公开提供用于基因组编辑的包含/包括各自编码HE和修正模板的一 种或多种多核苷酸的组合物和方法，其可用于在包括例如造血干细胞（HSC)、胚胎干（ES) 细胞和诱导多能干细胞（iPSC)的干细胞内产生天然存在的突变。可将基因组编辑的HSC、 ES和iPSC (包括自体HSC和iPSC)移植给患者以治疗诸如地中海贫血和/或镰状细胞病的 一种或多种血红蛋白病。
[0030] 本文公开的组合物和方法允许在不需要外源基因持续表达或插入的情况下，通过 编码HE (在有或没有靶向模板的情况下）、Cas9内切核酸酶和/或RNA引导链的多核苷酸 的瞬时表达，来有效修饰HSC、ES和iPSC，以在体内成熟的红系细胞和患者细胞中实现血红 蛋白病的改善。因为这些治疗方法不需要转基因的整合和/或持续表达，所以可消除与当 前可用的基因治疗技术有关的安全顾虑。
[0031] 在第四个实施方案中，本公开提供用于递送一种或多种归巢内切核酸酶和/或联 合一种或多种RNA引导链的一种或多种Cas9内切核酸酶的组合物和方法，所述酶的每一种 可在显示出临床益处的人靶区瞬时表达。本文描述的内切核酸酶编码序列可与TAL效应器 核酸酶（TALEN)编码序列联合或融合表达。本文中列举的是靶向影响胎儿血红蛋白产生的 关键基因组区域的TAL效应器-HE (TALE-HE)融合蛋白和编码那些TALE-HE融合蛋白的多 核苷酸。
[0032] 在这些实施方案的某些方面，将编码一种或多种的HE (在有或没有靶向模板的情 况下）、一种或多种Cas9内切核酸酶、一种或多种RNA引导链、一种或多种TALEN、一种或多 种TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸有效连接到病毒载体内的启 动子序列，以实现HE、Cas9、RNA引导链、TALEN、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2蛋白的递送 和瞬时表达。可较好用于递送HE、TALEN、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2蛋白的适合的病 毒载体可选自cocal假型化慢病毒载体、泡沫病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒（AAV)载 体。
[0033] 在第五个实施方案中，本公开提供包含/包括离体扩增修饰的造血干细胞（HSC) 的组合物和方法，其允许有效植入修正细胞并能够将诱导多能干细胞（iPSC)用于筛选和 临床应用。在这些实施方案的某些方面，提供用于有效扩增自体HSC、自体基因修饰的HSC、 iPSC-来源的HSC和ES细胞的组合物和方法。可采用脐带血扩增法，所述方法在补充有造 血生长因子的不含血清的培养基中采用S 1并使用从正常供体获得的动员的外周血CD34+ 细胞。这些组合物和方法可与一种或多种额外的试剂联用，以提高造血干/祖细胞的存活 率和促进增殖。在其它方面，这些组合物和方法可采用内皮细胞共培养物以促进长期再生 细胞（包括修正的iPSC-来源的HSC)的扩增。
[0034] 在第六个实施方案中，本公开提供用于提供支持性护理的组合物和方法，所述组 合物和方法包括消除移植后嗜中性白细胞减少症并改善基因-修正的自体HSC移植之后的 结果的现成细胞疗法。例如，可将离体扩增、低温保藏的脐带血（CB)干/祖细胞以支持性 护理的形式向正在用自体CD34+基因修正细胞进行清髓性HCT的患有地中海贫血和/或镰 状细胞病的患者施用。

【专利附图】

【附图说明】
[0035] 根据下图，将更好地理解本公开的某些方面：
[0036] 图1显示了在成人红系细胞组织中的增加球蛋白样基因表达的靶。展示了 调节胎儿表达形式（两个Y基因）转变为成人程序（S和β )所涉及的因子。（采用自 Wilber 等，Blood 117(15) :3945-3953 (2011))。
[0037] 图2描绘了三种示例性的罕见切割核酸酶技术。
[0038] 图3是显示在双份CBT接受者中非复发性死亡率的风险最高的图表。双份 CBT (DUCB)、匹配的不相关供体（MUD)、不匹配的不相关供体（MMUD)和匹配的相关供体 (SIB)移植之后的非复发性死亡率。
[0039] 图4显示在清髓性双份CBT情况下与δ 1--# -起进行的CB祖细胞的培养导致 嗜中性粒细胞恢复更快速。图中呈现了接受用两个非操作单元（"常规的"）对比用一个离 体扩增的单元和一个非操作单元（"扩增的"）进行的双份单元CBT的患者达到ANC > 500/ μ 1所需的个体时间和中值时间（实线）。
[0040] 图5是通过疾病迹象描绘每年进行的脐带血移植数量的柱形图。
[0041] 图6(SEQ ID Ν0:1)是3.6kb区的序列，HbF沉默区落入其中，跨越HG18中的 chrll:5212342-5215944。
[0042] 图7 (SEQ ID NO: 2)是350碱基对区，所述区域来自HbF沉默区中的重复元件（于 HG18中的chrl 1:5, 213, 912-5, 214, 261)，跨越通过已知可破坏HbF沉默区内的Bcllla占 据区的上游French HPHl拐点，并包含GATA-I结合基序，且由此设计本公开的示例性归巢 内切核酸酶（HE)。
[0043] 图8 (SEQ ID NO: 13)是来自帽上游Ikb处，通过聚腺苷酸位点的人β-球蛋白基 因，其跨越了 HG18 中的 chrl 1:5203272-5205877(反义链）。
[0044] 图9(SEQ ID N0:14)是人β-球蛋白的606bp区域，从启动子跨越到内含子2(于 HG18中的chrll:5204380-5204985)。该相当小的区域含有导致地中海贫血的大部分的突 变以及引起镰状细胞病的突变。该小区域容易进行导致基因修正的同源重组。
[0045] 图10(SEQIDN0:24)是人BclllacDNA(CCDS 1862·l)的cDNA序列。
[0046] 图11是质粒pET-21a(+)的限制性图谱。
[0047] 图 12 是质粒 pEndo 的限制性图谱（Doyon 等，J. Am. Chem. Soc. 128 (7)： 2477-2484(2006)〇
[0048] 图13是产生BCLllA基因-靶向内切核酸酶的定向进化的示意图。使构建的文库 进行在针对靶点的IVC中的选择，其一部分用BCLllA基因靶来替代。
[0049] 图14 (SEQ ID NO: 28)是I-HjeMI (用于BCLllA基因-靶向核苷酶的亲代酶）的 核苷酸序列，其作为用于在大肠杆菌中的表达所优化的密码子。
[0050] 图15 (SEQ ID NO: 29)是I-HjeMUBCLllA基因-靶向核苷酶的亲代酶）的核苷酸 序列，其作为用于在哺乳动物中的表达所优化的密码子。
[0051] 图16 (SEQ ID NO: 30)是归巢内切核酸酶I-HjeMI的氨基酸序列。
[0052] 图17 (SEQ ID NO: 31)是BCLllA基因靶向核苷酶（BclllAhje)的核苷酸序列，其 基于归巢内切核酸酶I-HjeMI (通过在IVC和细菌中的定向进化获得），其作为用于在大肠 杆菌中表达优化其密码子。
[0053] 图18 (SEQ ID NO: 32)是基于归巢内切核酸酶I-HjeMU通过在IVC和细菌中的定 向进化获得）的BCLllA基因靶向核苷酶的核苷酸序列，以在哺乳动物中表达优化其密码 子。
[0054] 图19 (SEQ ID NO: 33)是基于归巢内切核酸酶I-HjeMU通过在IVC和细菌中的定 向进化获得）的BCLllA基因靶向核苷酶的氨基酸序列。
[0055] 图20是显示BCLllA基因-靶向内切核酸酶和其亲代LHE I-HjeMI的氨基酸残 基分布差异的蛋白模型。在结合至其靶点（PDB ID:3UVF)的I-HjeMI的晶体结构上确定 BCLllA基因-靶向内切核酸酶经置换的残基。在变体内切核酸酶中缺失D161。
[0056] 图21是显示在双质粒切割测定中的BCLllA基因-靶向内切核酸酶活性的柱形 图。
[0057] 图22A(SEQ ID NO: 34)是I-OnuI归巢内切核酸酶（靶向HbF沉默区的归巢内切 核酸酶的亲代酶）的核苷酸序列，以在大肠杆菌中表达优化其密码子。
[0058] 图22B(SEQ ID NO: 15)是I-OnuI归巢内切核酸酶的氨基酸序列。
[0059] 图23是显示靶向HbF沉默区的I-OnuI归巢内切核酸酶的活性的琼脂糖凝胶。
[0060] 图24(SEQIDN0:35)是MegaTAL:5·5RVD+Y2I-AniI的核苷酸序列。
[0061] 图25(SEQIDN0:36)是MegaTAL:5·5RVD+Y2I-AniI的氨基酸序列。
[0062] 图26 (SEQ ID NO: 37)是Cas9内切核酸酶的核苷酸序列（来自Mali等， Science (2013))。
[0063] 图27 (SEQ ID NO: 38)是与Cas9内切核酸酶一起使用的RNA引导链的核苷酸序列 (来自 Mali 等，Science (2013))。
[0064] 图28 (SEQ ID NO: 62)是I-CpaMI归巢内切核酸酶的核苷酸序列（0RF，以在哺乳动 物表达中优化其密码子）。
[0065] 图29 (SEQ ID NO: 63)是I-CpaMI归巢内切核酸酶的氨基酸序列。
[0066] 图30是显示如实施例4检测所述的内源人BCLllA基因上的靶向诱变的琼脂糖凝 胶。
[0067] 图 31 是质粒 pCcdB wt6 的限制性图谱（Doyon 等，J. Am. Chem. Soc. 128 (7)： 2477-2484(2006))。
[0068] 图 32(SEQ ID N0:64)是BCLllA基因靶向核苷酶-编码质粒（pExodusBCLllAhje) 的核苷酸序列。
[0069] 图 33(SEQ ID N0:65)是 TREX2-编码质粒（pExodus CMV. Trex2)的核苷酸序列。
[0070] 图34是质粒pExodusBCLllAhje的限制性图谱。
[0071] 图35是质粒pExodus CMV. Trex2的限制性图谱。

【具体实施方式】
[0072] 本公开通常涉及通过瞬时或持续表达多核苷酸来治疗诸如血红蛋白病的遗传病 的组合物和方法，所述多核苷酸编码一种或多种内切核酸酶或内切核酸酶融合蛋白，包括 一种或多种归巢内切核酸酶和/或归巢内切核酸酶融合蛋白和/或联合一种或多种RNA 引导链联合的一种或多种Cas9内切核酸酶和/或Cas9内切核酸酶融合蛋白：（a)以破坏 BclIla编码区；(b)以破坏HbF沉默DNA调节元件或通路，诸如BclIla-调节的HbF沉默区； (c)以突变一种或多种Y-球蛋白基因启动子来实现Y-球蛋白基因表达的增加；（d)以突 变一种或多种S-球蛋白基因启动子来实现δ-球蛋白基因表达的增加；和/或（e)以修 正一种或多种β-球蛋白基因突变。本文公开的组合物和方法可用于治疗包括β-地中海 贫血和镰状细胞病的血红蛋白病。本文描述的组合物和方法可任选地包含/包括编码一种 或多种TALEN、一种或多种TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸。
[0073] 根据以下定义，将更好理解本公开：
[0074] 定义
[0075] 如本文所用，术语"血红蛋白病"是指一类导致血红蛋白分子的一条或多条球蛋白 链的结构异常、功能异常或表达改变的遗传缺陷。血红蛋白病是遗传性单基因病。常见的 血红蛋白病包括地中海贫血和镰状细胞病。
[0076] 如本文所用，术语"地中海贫血"是指一种由于α样与β样球蛋白多肽链的比率 改变导致正常血红蛋白四聚体蛋白产生不足和游离或未配对的α-链或链自然增长而 产生的血红蛋白病。
[0077] 如本文所用，术语"镰状细胞病"是指一组常染色体隐性遗传性血液病，其由球蛋 白基因突变所导致且特征为呈现出异常、僵硬镰刀状的红细胞。它们由其中谷氨酸被缬氨 酸在肽的第6位氨基酸处置换的编码β -球蛋白链变体的β S-基因和具有使得HbS结晶 从而产生临床表型的突变的第二β-基因的存在所定义。术语"镰状细胞贫血"是指对于引 起HbS的突变是杂合的患者中的一种特定形式的镰状细胞病。其它常见形式的镰状细胞病 包括HbS/ β -地中海贫血、HbS/HbC和HbS/HbD。表1公开了编码野生型和镰状细胞β -球 蛋白链的初始氨基酸的核苷酸序列。
[0078] 表 1
[0079]

【权利要求】
1. 一种用于治疗血红蛋白病的组合物，包含选自归巢内切核酸酶（HE)和CRISPR内切 核酸酶中的一种或多种内切核酸酶，其中每种所述内切核酸酶结合至选自Bcllla编码区、 Bcllla基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白（HbF)沉默区、Bcllla-调节的 HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、δ-球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点中 的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述内切核酸酶是结合至所述Bcllla编码区或 所述Bcllla基因调节区的HE。
3. 根据权利要求2所述的组合物，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI 归巢内切核酸酶和I-〇nuI归巢内切核酸酶。
4. 根据权利要求3所述的组合物，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中 所述氨基酸置换选自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、 E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、 N159、D162、D163、1166、I168、S168、D170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
7. 根据权利要求6所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至 Bell la编码区。
8. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述内切核酸酶是CRISPR内切核酸酶，其中所 述CRISPR包含RNA引导链和Cas9内切核酸酶，其中所述RNA引导链介导所述Cas9内切核 酸酶与胎儿血红蛋白（HbF)沉默区的结合。
9. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述RNA引导链包含选自SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 中 的核苷酸序列。
10. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述Cas9内切核酸酶由编码功能性Cas9内切 核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其变体编码。
11. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至胎儿血 红蛋白（HbF)沉默区的HE。
12. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、 I-CpaMI归巢内切核酸酶和Ι-Onul归巢内切核酸酶。
13. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述HE是I-Onul归巢内切核酸酶。
14. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含编码 Ι-Onul归巢内切核酸酶的SEQ ID N0:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述 I-Onul归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白（HbF)沉默区。
15. 根据权利要求14所述的组合物，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选 自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
16. 根据权利要求15所述的组合物，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换 选自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
17. 根据权利要求1所述的组合物，其还包含TAL效应器核酸酶（TALEN)、TAL-HE或 TREX2蛋白。
18. -种用于治疗血红蛋白病的组合物，所述组合物包含编码选自归巢内切核酸酶 (HE)和Cas9内切核酸酶中的一种或多种内切核酸酶的一种或多种多核苷酸，其中每种所 述内切核酸酶结合至选自Bcllla编码区、Bcllla基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎 儿血红蛋白（HbF)沉默区、Bcllla-调节的HbF沉默区、γ -球蛋白基因启动子、δ -球蛋白 基因启动子和β-球蛋白基因突变点中的核苷酸序列。
19. 根据权利要求18所述的组合物，其中所述内切核酸酶是结合至所述Bcllla编码区 或所述Bel 11a基因调节区的HE。
20. 根据权利要求19所述的组合物，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、 I-CpaMI归巢内切核酸酶和Ι-Onul归巢内切核酸酶。
21. 根据权利要求20所述的组合物，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
22. 根据权利要求21所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中 所述氨基酸置换选自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、 E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、 N159、D162、D163、1166、I168、S168、D170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。
23. 根据权利要求22所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
24. 根据权利要求23所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至 Bell la编码区。
25. 根据权利要求24所述的组合物，其中所述内切核酸酶是CRISPR内切核酸酶，其中 所述CRISPR包含RNA引导链和Cas9内切核酸酶，其中所述RNA引导链介导所述Cas9内切 核酸酶与胎儿血红蛋白（HbF)沉默区的结合。
26. 根据权利要求25所述的组合物，其中所述RNA引导链包括选自SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 中 的核苷酸序列。
27. 根据权利要求26所述的组合物，其中所述Cas9内切核酸酶由编码功能性Cas9内 切核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其变体编码。
28. 根据权利要求18所述的组合物，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至胎儿血 红蛋白（HbF)沉默区的HE。
29. 根据权利要求28所述的组合物，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、 I-CpaMI归巢内切核酸酶和Ι-Onul归巢内切核酸酶。
30. 根据权利要求29所述的组合物，其中所述HE是Ι-Onul归巢内切核酸酶。
31. 根据权利要求30所述的组合物，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由编码 I-Onul归巢内切核酸酶的SEQ ID N0:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述 I-Onul归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白（HbF)沉默区。
32. 根据权利要求31所述的组合物，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换 选自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
33. 根据权利要求31所述的组合物，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换 选自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
34. 根据权利要求18所述的组合物，还包含编码TAL效应器核酸酶（TALEN)、TALE-HE 融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
35. -种编码选自归巢内切核酸酶（HE)和CRISPR内切核酸酶中的内切核酸酶的多核 苷酸，其中所述内切核酸酶结合至选自Bcllla编码区、Bcllla基因调节区、成人β-球蛋白 基因座、胎儿血红蛋白（HbF)沉默区、Bcllla-调节的HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、 S-球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点中的核苷酸序列。
36. 根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述内切核酸酶是结合至所述Bcllla编码 区或所述Bel 11a基因调节区的HE。
37. 根据权利要求36所述的多核苷酸，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、 I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-Onul归巢内切核酸酶。
38. 根据权利要求37所述的多核苷酸，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
39. 根据权利要求38所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换， 其中所述氨基酸置换选自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、 N64、E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、 1^158、附59、0162、0163、1166、1168、5168、0170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。25.根据 权利要求24所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或 SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
40. 根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至 Bell la编码区。
41. 根据权利要求40所述的多核苷酸，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至胎儿 血红蛋白（HbF)沉默区的HE。
42. 根据权利要求41所述的多核苷酸，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、 I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-Onul归巢内切核酸酶。
43. 根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述HE是I-Onul归巢内切核酸酶。
44. 根据权利要求43所述的多核苷酸，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由编 码I-Onul归巢内切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述 I-Onul归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白（HbF)沉默区。
45. 根据权利要求44所述的多核苷酸，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中每种所述氨基 酸置换选自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
46. 根据权利要求45所述的多核苷酸，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置 换选自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
47. 根据权利要求35所述的多核苷酸，还包括编码TAL效应器核酸酶（TALEN)、 TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
48. -种编码RNA引导链的多核苷酸，所述RNA引导链介导Cas9内切核酸酶与 Bcllla编码区、Bcllla基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白（HbF)沉默区、 Bcllla-调节的HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、δ-球蛋白基因启动子和β-球蛋白 基因突变位点的结合。
49. 根据权利要求48所述的多核苷酸，其中所述RNA引导链介导Cas9内切核酸酶与胎 儿血红蛋白（HbF)沉默区的特异性结合。
50. 根据权利要求49所述的多核苷酸，其中所述胎儿血红蛋白（HbF)沉默区包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
51. 根据权利要求50所述的多核苷酸，其中所述胎儿血红蛋白（HbF)沉默区包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
52. 根据权利要求50或权利要求51所述的多核苷酸，其中所述RNA引导链包含选自 SEQ ID N0:48,SEQ ID N0:49,SEQ ID N0:50,SEQ ID N0:5USEQ ID N0:52,SEQ ID N0:53 和SEQ ID NO :54中的核苷酸序列。
53. -种包含载体和编码选自归巢内切核酸酶（HE)和CRISPR内切核酸酶中的内切核 酸酶的多核苷酸的载体体系，其中所述内切核酸酶结合至选自Bcllla编码区、Bcllla基因 调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白（HbF)沉默区、Bcllla-调节的HbF沉默区、 球蛋白基因启动子、球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点中的核苷酸序 列。
54. 根据权利要求53所述的载体体系，其中所述载体选自AA V6、经修饰的腺病毒载 体、整合缺陷型慢病毒载体（IDLV)和整合缺陷型泡沫病毒载体（IDFV)。
55. 根据权利要求53所述的载体体系，其中所述内切核酸酶是结合至所述Bcllla编码 区或所述Bcllla基因调节区的HE。
56. 根据权利要求55所述的载体体系，其中所述HE选自I-HjeM归巢内切核酸酶、 I-CpaMI归巢内切核酸酶和Ι-Onul归巢内切核酸酶。
57. 根据权利要求56所述的载体体系，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
58. 根据权利要求57所述的载体体系，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换， 其中所述氨基酸置换选自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、 N64、E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、 1^158、附59、0162、0163、1166、1168、5168、0170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。25.根据 权利要求24所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由所述SEQ ID N0:31 或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
59. 根据权利要求58所述的载体体系，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由所述 SEQ ID N0:31或SEQ ID N0:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
60. 根据权利要求59所述的载体体系，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至 Bell la编码区。
61. 根据权利要求53所述的载体体系，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至胎儿 血红蛋白（HbF)沉默区的HE。
62. 根据权利要求61所述的载体体系，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、 I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-Onul归巢内切核酸酶。
63. 根据权利要求62所述的载体体系，其中所述HE是I-Onul归巢内切核酸酶。
64. 根据权利要求63所述的载体体系，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由编 码I-Onul归巢内切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述 I-Onul归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白（HbF)沉默区。
65. 根据权利要求64所述的载体体系，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID N0:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置 换选自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
66. 根据权利要求64所述的载体体系，其中所述I-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID N0:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置 换选自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
67. 根据权利要求53所述的载体体系，还包含编码TAL效应器核酸酶（TALEN)、 TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
68. -种包含载体和编码RNA引导链的多核苷酸的载体体系，所述RNA引导链介导 Cas9内切核酸酶与选自Bcllla编码区、Bcllla基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿 血红蛋白（HbF)沉默区、Bcllla-调节的HbF沉默区、γ -球蛋白基因启动子、δ -球蛋白基 因启动子和β-球蛋白基因突变位点中的核苷酸序列的结合。
69. 根据权利要求68所述的载体体系，其中在成人β-球蛋白基因座中的所述核苷酸 序列是胎儿血红蛋白（HbF)沉默区。
70. 根据权利要求69所述的载体体系，其中所述胎儿血红蛋白（HbF)沉默区包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
71. 根据权利要求69所述的载体体系，其中所述胎儿血红蛋白（HbF)沉默区包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
72. 根据权利要求70或权利要求71所述的载体体系，其中所述RNA引导链包含选自 SEQ ID N0:48,SEQ ID N0:49,SEQ ID N0:50,SEQ ID N0:5USEQ ID N0:52,SEQ ID N0:53 和SEQ ID NO :54中的核苷酸序列。
73. -种包含编码选自归巢内切核酸酶（HE)和CRISPR内切核酸酶中的一种或多种内 切核酸酶的多核苷酸的细胞，其中每种所述内切核酸酶结合至选自Bcllla编码区、Bcllla 基因调节区、成人β -球蛋白基因座、胎儿血红蛋白HbF沉默区、Bcllla-调节的HbF沉默 区、球蛋白基因启动子、球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点中的核苷酸 序列。
74. 根据权利要求73所述的细胞，其中所述细胞是干细胞。
75. 根据权利要求73所述的细胞，其中所述细胞是选自造血干细胞（HSC)、诱导多能干 细胞（iPSC)、胚胎干（ES)细胞和红系祖细胞中的干细胞。
76. 根据权利要求73所述的细胞，其中所述细胞是选自造血干细胞（HSC)、诱导多能干 细胞（iPSC)和红系祖细胞中的干细胞。
77. 根据权利要求73所述的细胞，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至所述 Bcllla编码区的HE。
78. 根据权利要求77所述的细胞，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI 归巢内切核酸酶和I-〇nuI归巢内切核酸酶。
79. 根据权利要求78所述的细胞，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
80. 根据权利要求79所述的细胞，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中 所述氨基酸置换选自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、 E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、 附59、0162、0163、1166、1168、5168、0170、1193、1^195、1?202、1(204和了206.25。
81. 根据权利要求80所述的细胞，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
82. 根据权利要求81所述的细胞，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至 Bell la编码区。
83. 根据权利要求73所述的细胞，其中所述CRJSPR内切核酸酶包含Cas9内切核酸酶 和RNA引导链，其中所述RNA引导链介导所述Cas9内切核酸酶与胎儿血红蛋白（HbF)沉默 区的结合。
84. 根据权利要求83所述的细胞，其中所述RNA引导链包含选自SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 中 的核苷酸序列。
85. 根据权利要求84所述的细胞，其中所述Cas9内切核酸酶由编码功能性Cas9内切 核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其变体所编码。
86. 根据权利要求73所述的细胞，其中所述内切核酸酶是结合至胎儿血红蛋白（HbF) 沉默区的HE。
87. 根据权利要求86所述的细胞，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI 归巢内切核酸酶和I-〇nuI归巢内切核酸酶。
88. 根据权利要求87所述的细胞，其中所述HE是Ι-Onul归巢内切核酸酶。
89. 根据权利要求88所述的细胞，其中所述Ι-Onul归巢内切核酸酶包含由编码 Ι-Onul归巢内切核酸酶的SEQ ID N0:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述 I-Onul归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白（HbF)沉默区。
90. 根据权利要求89所述的细胞，其中所述Ι-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO: 34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换 选自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
91. 根据权利要求89所述的细胞，其中所述Ι-Onul归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO: 34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换 选自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
92. 根据权利要求73所述的细胞，还包含编码TAL效应器核酸酶（TALEN)、TALE-HE融 合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
93. -种基因组编辑的干细胞，其中所述基因组编辑的干细胞通过引入归巢内切核酸 酶和修正模板产生。
94. 根据权利要求93所述的基因组编辑的干细胞，其中所述修正模板包含允许在球蛋 白基因基因座中修饰关键调控序列或编码序列的核苷酸序列。
95. 根据权利要求93所述的基因组编辑的干细胞，其中所述干细胞选自造血干细胞 (HSC)、诱导多能干细胞（iPSC)、胚胎干（ES)细胞和红系祖细胞。
96. 根据权利要求93所述的基因组编辑的干细胞，其中所述干细胞选自造血干细胞 (HSC)、诱导多能干细胞（iPSC)和红系祖细胞。
【文档编号】A61K38/00GK104284669SQ201380017193
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月24日
【发明者】迈克尔·A·本德尔, 马克·T·格劳迪尼, 巴里·L·斯托达德, 亮武内 申请人:弗雷德哈钦森癌症研究中心