长效凝血因子和生产它们的方法

长效凝血因子和生产它们的方法
【专利摘要】本发明公开了多肽和编码它们的多核苷酸，所述多肽包含绒毛膜促性腺激素的至少一个羧基端肽(CTP)，所述羧基端肽连接至凝血因子的羧基端，但是没有连接至凝血因子的氨基端。还公开了包含本发明的多肽和多核苷酸的药物组合物以及使用和生产它们的方法。
【专利说明】长效凝血因子和生产它们的方法

【技术领域】
[0001] 公开了包含与凝血因子的羧基端连接的绒毛膜促性腺激素的至少一个羧基端肽 (CTP)的多肽和编码它们的多核苷酸。也公开包含本发明的多肽和多核苷酸的药物组合物 以及使用和生产它们的方法。

【背景技术】
[0002] 凝血因子补偿疗法的发展已经改变了许多具有血友病的个体的生活。血友病是一 组损害身体的控制血液凝固或凝结的能力的遗传性基因障碍。具有血友病的患者不会产生 足够量的有效血液凝固必需的因子VIII或因子IX蛋白。在严重的血友病患者中，即使微 小损伤可以导致持续数天或数周的失血，并且可能不会发生完全愈合，从而导致对关节和 其它器官的虚弱性永久损伤的可能性和过早死亡。
[0003] -类血友病（血友病B)是一种X-连接的由因子IX(FIX)基因中的突变所造成的 出血障碍，从而导致FIX的促凝活性的缺乏。血友病B患者具有自发的软组织出血和反复 的关节积血，经常导致摧毁性的关节病（arthopathy)。这些患者的目前治疗方法包括静脉 内施用重组FIX。但是，FIX的成本问题和从循环中相对快速清除的问题使得开发长效FIX 成为一项挑战性的任务。
[0004] FVIII和FIX的商业可用性已经导致危及生命的出血发作的改善控制。许多患者 接受预防性疗法，这会降低出血和它的有关并发症的风险。但是，高比例的患者（10-30%) 会发展针对外源性施用的FVIII和FIX的抑制性抗体。FVIIa(它是一种旁路产物）的施用 可以诱导体内稳态并提供对具有抑制性Ab的患者的有效治疗。
[0005] 重组FVIIa (NovoSeven?).是商购可得的，并且在1996年被批准用于治疗具有 抑制剂的血友病患者中的出血发作。但是，rFVIIa以2. 5小时的终末半衰期被快速地清 除。所以，患者通常需要多次频繁输注（以2-3小时间隔施用2-3剂）以在轻度至中度出 血后达到足够的体内稳态。结果，在开发长效形式的FVIIa中存在许多兴趣，所述长效形式 的FVIIa会延长单次剂量以后止血活性的持续时间并允许频率低得多的给药。长效FVIIa 也会增加长期预防性疗法的可行性。
[0006] 正在开发用于延长FVIIa的半衰期的不同技术。但是，挑战是，实现该蛋白的延长 的半衰期，同时保留它的生物活性并确保修饰不会诱导显著的免疫原性。


【发明内容】

[0007] 在一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多 肽和连接至所述CTP修饰的FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。
[0008] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的药 物组合物，所述CTP修饰的因子IX(FIX)多肽由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多 肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。
[0009] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述 CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧 基端肽（CTP)组成。
[0010] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码CTP修饰的多肽 的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的 3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。
[0011] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的细胞，所述表达载体包 含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所 述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。
[0012] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的组合物，所述表达载体 包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至 所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。
[0013] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的 方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多 肽的羧基端，由此延长所述FIX多肽的生物半衰期。
[0014] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种提高因子IX(FIX)多肽的曲线下面积 (AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所 述FIX多肽的羧基端，由此提高所述FIX多肽的AUC。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的施用频率的方 法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多肽 的羧基端，由此降低所述FIX多肽的施用频率。
[0016] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的清除率的方 法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多肽 的羧基端，由此降低所述FIX多肽的清除率。
[0017] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的方 法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多肽 的羧基端，由此生产CTP修饰的FIX多肽。
[0018] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方 法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，所述CTP修饰的因子IX(FIX)多 肽包含FIX多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)， 由此治疗所述受试者中的血友病。
[0019] 在一个实施方案中，本发明提供了一种预防受试者中的血液凝固或凝结障碍的方 法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血 因子包含连接至所述FVII多肽的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此 预防所述受试者中的血友病。
[0020] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的方 法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血 因子包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此 预防所述受试者中的血友病。
[0021] 从下述详细描述实施例和附图将明白本发明的其它特征和优点。但是，应当理解， 所述详细描述和具体实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅仅通过例证给出， 因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1A.显示的条形图显示了在有g/ml维生素 K3存在下用FIX-CTP和 FIX-CTP-CTP变体有限稀释的、转染的和选择的细胞的收获物。使用人FIX ELISA试剂盒 (Affinity Biologicals;目录号FIX-AG RU0)定量FIX的水平,计算的蛋白质浓度Og/ ml)是两个独立运行的平均值。图IB显示了 FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。显 微照片A描绘了在蛋白质印迹中抗-FIX抗体的识别；显微照片B描绘了在蛋白质印迹中 抗-Y羧化抗体的识别。A-B中的泳道1加载了含有重组FIX的样品。A-B中的泳道2加 载了含有FIX-CTP收获物的样品。A-B中的泳道3加载了含有FIX-(CTP) 2收获物的样品。
[0023] 图 2?显不的图显不了与 rhFIX (American Diagnostics)相比的 FIX-CTP 和 FIX-(CTP)2收获物对比产色活性（通过EC5tl.浓度测量）。
[0024] 图3.显示的图显示了 rhFIX、FIX-CTP-CTP的收获物、和FIX-CTP收获物的PK谱。
[0025] 图4.显示的条形图显示了使用人FIX ELISA试剂盒（Affinity Biologicals ;目 录号FIX-AG RU0)确定的FIX-CTP收获物和FIX-CTP-CTP收获物和FIX-CTP-CTP纯化的蛋 白FIX抗原水平。计算的蛋白浓度（yg/ml)是两个独立运行的平均值。
[0026] 图5.显示了 FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。显微照片A描绘了考马斯 蓝染色；显微照片B描绘了蛋白质印迹中抗-FIX抗体的识别；显微照片C描绘了蛋白质印 迹中抗_ Y羧化抗体的识别。A-C中的泳道1加载了含有FIX- (CTP) 2的样品。A-C中的泳 道2加载了含有未结合的FIX-(CTP)2W样品。A-C中的泳道3加载了含有FIX-(CTP) 2的 浓缩洗脱液的样品。
[0027] 图6?显示的图显示了与人正常合并血楽和rhFIX(American Diagnostics)相比 的FIX-(CTP) 2产色活性（样品浓度/0. D.)。
[0028] 图 7?显示的图显示了纯化的FIX-CTP-CTP、rhFIX、FIX-CTP-CTP 收获物和FIX-CTP 收获物的PK谱。
[0029] 图8.显示了与3、4或5个CTP融合的FIX的抗-CTP和抗-Y羧化抗体蛋白质印 迹。使用 Precision plus 双色蛋白标志物（Bio-Rad)将 FIX-CTP3、FIX-CTPjP FIX-CTP 5收 获物加载上12% Tris-甘氨酸凝胶。使用抗-CTP多克隆Ab(Adar Biotech Production) 或抗-Gla Ab (American Diagnostica)通过蛋白免疫印迹进行SDS-PAGE分析。
[0030] 图 9.显示了 FIX-CTP3、FIX-CTPjP FIX-CTP 5的考马斯蓝检测。在利用 Jacalin 柱的纯化过程（糖基化蛋白的免疫亲和纯化）以后，使用Precision Plus双色蛋白标志物 (Bio-Rad)将 FIX-CTP3、FIX-CTPjP FIX-CTP 5加载上 12% Tris-甘氨酸凝胶。用考马斯蓝 染料进行SDS-PAGE染色用于样品检测。
[0031] 图10.显示了 FIX产色活性。使用商购可得的产色活性试验试剂盒 BI0PHEN (Hyphen BioMed 221802)进行完全纯化的（HA 柱）FIX-CTP3、FIX-CTP4和 FIX-CTP5相对于人血库正常血浆的体外效能的对比评估。将所有样品系列稀释，并通过将剂量响应 曲线与由正常人血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。
[0032] 图11.显示了 FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的对比药代动力学（PK)分布。使 用人FIX Elisa试剂盒（Affinity Biologicals)定量血浆样品中的FIX浓度。计算药代 动力学分布，为每个时间点3只动物的平均值。使用PK Solutions 2.0软件计算终末半衰 期。
[0033] 图 12.显示了 Fix-CtP3SDS-PAGE 分析-考马斯 SDS-PAGE。使用 Precision Plus 双色蛋白标志物（Bio-Rad)将FIX-CTP3 Y-羧化的富集的蛋白rhFIX和rFIXa(活化的 FIX)加载上12% Tris-甘氨酸凝胶。通过用考马斯蓝试剂（800ng蛋白）对凝胶染色，进行 SDS-PAGE考马斯分析（图12A)。使用IOOng蛋白用抗-人FIX多克隆Ab (图12B)、抗-人 Y羧化单克隆抗体（American Diagnostics目录号499, 3570)(图12C)、抗-FIX前肽多克 隆Ab (图12D)和抗-CTP多克隆Ab (图12E)进行蛋白免疫印迹。
[0034] 图13:显示了 色活性。使用商购可得的产色活性试验试剂盒 BI0PHEN(Hyphen BioMed 221802)进行？1乂-〇?3收获物和 FIX-CTP3 Y-羧化的富集的蛋白 相对于人血库正常血浆的体外效能的对比评估。将获物和蛋白系列稀释，并通 过将剂量响应曲线与由正常人血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。
[0035] 图14:显示了对比凝固时间。进行了将FIX-CTP3的凝血活性与BeneFIX进行对 比的体外aPTT (活化的部分凝血酶时间测定）。将蛋白系列稀释，并掺入除去FIX的人血浆 中，并评价凝固时间。
[0036] 图 15.显示了 FIX-CTP3对比 PK 谱。使用人 FIX ELISA 试剂盒（Affinity Biologicals;目录号FIX-AG RU0)定量FIX浓度。计算每种蛋白的药代动力学分布，为每 个时间点3只动物的平均值。
[0037] 图16.显示了活性谱参数。与PK取样平行地，通过aPTT测定来评价施用了 BeneFIX?或FIX-CTP3的FIX-缺陷型动物的柠檬酸盐化的血浆样品的凝血活性，将其转 换为活性百分比。将在每个收集点的活性百分比计算为当前凝固时间/正常血库小鼠血浆 的凝固时间*100。
[0038] 图17.显示了第一次攻击出血参数。给Fix-缺陷型小鼠施用lOOIU/Kg BeneFIX?或rFix-CTP3的单次静脉内注射。在给药后48小时稍微剪断尾静脉，并评价 尾静脉出血时间（TVBT)和出血强度（血红蛋白0D)。在达到体内稳态以后15分钟进行第 二次出血攻击，并测量相同的参数。
[0039] 图18.显示了第二次攻击出血参数。在图19的说明中描述的第一次出血自发地 或手工地停止以后，在第一次出血以后15分钟进行第二次出血攻击，并重新测量时间和 出血强度。
[0040] 图19.显示了的简图解释了 rFVII-CTP构建体（A)、rFVII-CTP-CTP构建体（B)、 rFIX-CTP 构建体（C)和 rFIX-CTP-CTP 构建体（D)。
[0041] 图20A.显示的条形图显示了在有5iig/ml维生素 K3存在下用FVII-CTP变体有 限稀释的、克隆转染的和选择的细胞的收获物。使用FVII ELlSA(AssayPr0)定量FVII水 平。
[0042] 图20B.显示的条形图显示了在有5 iig维生素 K3存在下用FVII-CTP变体有限 稀释的、转染的和选择的细胞的收获物.活性.使用FVII产色活性测定（AssayPro)定量 FVII活性。
[0043] 图20C.显示的条形图显示了在有5 ii g维生素 K3存在下用FVII-CTP变体有限稀 释的、转染的和选择的细胞的收获物。通过将活性值除以收获物FVII浓度，为每种形式计 算FVII的比活性。
[0044] 图20D.显示的图显示了 FVII、FVII-CTP-CTP和FVII-CTP收获物的PK谱。
[0045] 图21.显示了使用抗-FVII、抗-CTP和抗-Y羧化抗体检测的与3、4和5个CTP融 合的FVII的蛋白质印迹。使用Precision plus双色蛋白标志物（Bio-Rad)将FVII_CTP3、 FVII-CTPJP FVII-CTP 5收获物加载上 12% Tris-甘氨酸凝胶（expedeon)。使用抗-FVII Ab、抗-CTP 多克隆 Ab (Adar Biotech Production)或抗-Gla Ab (American Diagnostica) 通过蛋白免疫印迹进行SDS-PAGE分析。
[0046] 图22.显示了 FVII活性-产色活性。使用商购可得的产色活性试验试剂盒 BI0PHEN(Hyphen BioMed 221304)，进行 HA 纯化的（高度 Y 羧化的级分）FVII-CTP3、 FVII-CTPJP FVII-CTP 5相对于正常人合并血浆的体外效能的对比评估。将所有样品系列 稀释，并通过将剂量响应曲线与由正常人血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。
[0047] 图23.显示了第一对比药代动力学（PK)分布-FVII 3、4和5个CTP。以250 ii g/ kg体重的剂量将FVII-CTP3、FVII-CTP# FVII-CTP 5 (分别是组A、B和C)在单次静脉内注 射中施用给Sprague Dawley大鼠（6只大鼠/治疗）。可替代地在给药后0. 083、0. 5、2、5、 8、24、48、72和96小时从3只大鼠在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的 血浆（0. 38% )，并在分析之前在-20°C储存。FVII-CTP5表现出与其它2种形式相比优越 的特性。
[0048] 图24.显示了第二对比PK谱-FVII 3、4和5个CTP。以29. 45iig/kg体重的剂 量将FVII选择和HA纯化过程以后的FVII-CTP3、FVII-CTPJP FVII-CTP 5(分别是组A、B 和C)在单次静脉内注射中施用给Sprague Dawley大鼠（每种物质3只大鼠）。在给药后 0. 083、0. 5、2、8、24、48和72小时在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血 浆（0. 38% )，并在分析之前在-20°C储存。
[0049] 图25.显示了 FVII-CTPji^t过程的示意图。生产了批次31用于PK/H)研究。生 产了批次38用于存活研究。
[0050] 图26.显示了最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白质印迹。将IOiig(批次 31)或5 ii g (批次38)加载进考马斯染色的SDS-PAGE的每个泳道中。将I ii g蛋白加载进 蛋白质印迹的每个泳道中。LFVn-CTP3多肽；2.重链，包括3x CTP ;3.轻链。所有3种抗 体都检测FVII。a -CTP检测FVIIa重链，a -FVII和a -Gla检测轻链。
[0051] 图 27?表明，由于在 Ceramic Hydroxyapatite(HA)柱上的纯化，增强了 FVII-CTP3产色活性。使用商购可得的产色活性试验试剂盒BI0PHEN(Hyphen BioMed 221304)，进行 FVII-CTP3收获物、过程中级分和纯化的FVII-CTP 3相对于人血库正常血浆的体外效能的对 比评估。将FVII-CtIV^获物和蛋白系列稀释，并通过将剂量响应曲线与正常人血浆的参 考制剂进行对比来评估效能。
[0052] 图28.显示了 FVIII-缺陷型小鼠中FVIIa-CTP3相对于NovoSeven⑧的PK谱。 在FVII选择、HA纯化过程和活化以后，生产FVIIa-CTP3。将FVIIa-CTP^ NoVoSeven?. 在单次静脉内注射中施用给FVIII-/-血友病小鼠。在给药后0. 083、0. 5、2、8、24、48和72 小时，在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆（0.38%)，并在分析之 前在-20°C储存，并使用STACLOT商业试剂盒基于FVIIa凝血活性来建立PK谱。
[0053] 图29.表明，在FVII选择、HA纯化过程和活化以后生产FVIIa-CTP3。 将 FVIIa-CTP3* NovoSeven?.在单次静脉内注射中施用给FVIII-/-血友病小鼠。在给药 后0. 083、0. 5、2、8、24、48和72小时在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备朽1橡酸盐化 的血浆（0. 38% )，并在分析之前在-20°C储存。在PK实验过程中评价凝血酶产生参数，并 评价包括达到峰值的最大量、达到时间点的凝血酶的量和凝血酶产生速率在内的参数。
[0054] 图30.显示了尾静脉横断（TVT)以后的血友病小鼠存活曲线。在给药后⑷15min、 (B) 24小时或（C) 48小时进行TVT。在TVT以后观察小鼠存活24小时，并对于前12小时中 的每个小时和24小时以后进行记录。图33D总结了 TVT后24小时记录的小鼠存活。对照 组数据（媒介物）是使用5只小鼠/实验的3个实验的总和。
[0055] 图31.显示了 FVII-3-CTP和FVII-5CTP免疫印迹：A)针对GLA的印迹。B)针对 FVIIa的印迹。C)针对CTP的印迹。
[0056] 图32?显示了得自选择和HA柱纯化（FVIIS相对于FVII HA)的对比PK谱（FVII 3个和5个CTP)。
[0057] 图33.显示了第二个研究（静脉内相对于皮下）的对比PK谱（FVII 3个和5个 CTP)。
[0058] 图34.显示了尾静脉横断（TVT)以后的血友病小鼠存活曲线。在皮下施用后12 小时进行TVT。在TVT以后观察小鼠存活24小时，并对于前12小时中的每个小时和24小 时以后进行记录。
[0059] 图35?显示了静脉内或皮下施用以后mod-5014相对于NovoSeven?的PK谱。 A)显示了静脉内施用；B)显示了皮下施用。
[0060] 图36.显示了单次皮下施用以后M0D-5014(克隆61#75、#81)相对于 NovoSeven? 的 PK 谱。

【具体实施方式】
[0061] 在一个实施方案中，本发明提供了长效凝血因子以及生产和使用它们的方法。在 另一个实施方案中，长效凝血因子包含羧基端肽（CTP，也被称作CTP单元）。在另一个实施 方案中，包含凝血因子的长效多肽还包含人绒毛膜促性腺激素（hCG)的羧基端肽（CTP)。在 另一个实施方案中，CTP充当对抗凝血因子降解的保护剂。在另一个实施方案中，CTP会延 长凝血因子的Cmax。在另一个实施方案中，CTP会延长凝血因子的Tmax。在另一个实施方案 中，CTP会延长凝血因子的循环半衰期。在某些实施方案中，CTP会增强凝血因子的效能。 [0062] 在另一个实施方案中，本文提供了一种延长凝血因子的生物半衰期的方法，所述 方法包括下述步骤：将1-10个CTP连接至所述凝血因子的羧基端，由此延长所述凝血因子 的生物半衰期。在另一个实施方案中，本文提供了一种延长凝血因子的生物半衰期的方法， 所述方法包括下述步骤：将1-5个CTP连接至所述凝血因子的羧基端，由此延长所述凝血因 子的生物半衰期。在另一个实施方案中，本发明提供了一种延长凝血因子的循环半衰期的 方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种增加凝血因子的半衰期的方法。在另一个 实施方案中，本发明提供了一种延长凝血因子的半衰期的方法。
[0063] 凝血因子VII (FVII)是作为无活性前酶由肝细胞分泌进血流中的444个氨基酸的 糖蛋白（50KDa)。在组织损害和暴露于循环血液以后，FVII会与组织因子（TF)形成复合 物，所述组织因子是FVII的真实受体蛋白且由位于血管壁的深层中的不同细胞表达。该 FVII-TF复合物的形成会导致FVII的活化。活化的FVII (FVIIa)会通过活化因子IX和因 子X启动外因性凝血途径。
[0064] FVII属于一群与凝血系统有关的维生素 K依赖性的糖蛋白。除了 FVII以外，该群 由因子IX、因子X、蛋白C和凝血酶原组成。这些蛋白具有类似的结构域组构，并且被合成 为具有N-端前肽和随后的成熟氨基酸序列的前体。所述前肽含有Y羧化酶的停泊位点， 所述Y羧化酶将谷氨酸（Glu)转化成Y羧基谷氨酸（Gla)。该结构域后面是2个表皮生 长因子样（EGF)结构域、连接区域（CR)和C-端丝氨酸蛋白酶结构域。在分泌之前，FVII前 肽被切割从而形成406个氨基酸的单链酶原FVII糖蛋白。在分泌之后，所述蛋白可以通过 在CR中的切割活化成二硫键连接的双链异源二聚体FVIIa。FVII的血浆浓度是10nM，且大 约1 %在健康个体中以活性形式循环。
[0065] 因子IX(FIX)是一种415个氨基酸（55KDa)的糖蛋白；它属于一群维生素 K依赖 性的与凝血系统有关的糖蛋白。FIX具有与因子FVII、因子X、蛋白C和凝血酶原（它们合 成为具有N-端前肽和随后的成熟氨基酸序列的前体）类似的结构域组构。
[0066] FIX被分泌为经历复杂的转录后修饰的单链分子，其中的许多修饰对于它的生化 和药代动力学性质而言是关键性的。在所有的转录后修饰中，在FIX的氨基端附近的12个 谷氨酸残基（其被维生素 K依赖性的Y羧化酶Y羧化）是最关键的残基。羧化是FIX与 磷脂表面的相互作用和最佳FIX活性所必需的。所述氨基端前肽充当Y羧化酶的识别位 点，并因此在Y羧化之后由被称作成对的碱性氨基酸裂解酶（PACE/弗林蛋白酶）的高尔 基体丝氨酸蛋白酶裂解除去。在高尔基体处可能发生四个额外的转录后修饰：酪氨酸155 的硫酸化、丝氨酸158的磷酸化、Ser 63和61上的0-糖基化、以及最后在Asn 157和16上 的N-糖基化，但是被证实不是FIX的适当活性所必需的。
[0067] FIX作为单链无活性酶原在血浆中循环（5 ii g/ml的平均浓度）。在一种或两种生 理激活物FVIIa-TF复合物或FIXa在两个肽键Arg 145和Argl80处发生蛋白水解性裂解 以后，活化肽被除去，从而将FIX转化成由单个二硫键保持在一起的轻链和重链组成的完 全活性的酶。所述N-端轻链含有非催化性的Y羧基谷氨酸（Gla)和两个表皮生长因子样 结构域，而C-端重链含有该分子的胰蛋白酶样催化结构域。单独的FIXa的特征在于较差 的催化活性。但是，当与FVIII形成复合物时，它对于它的天然底物FX的蛋白水解活性增 加了 4-5个数量级。
[0068] 在另一个实施方案中，本文提供了一种延长凝血因子的生物半衰期的方法或提高 曲线下面积（AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP连接至所述凝血因子的 羧基端，由此延长所述凝血因子的生物半衰期或提高AUC。在另一个实施方案中，本文提供 了一种延长凝血因子的生物半衰期的方法或提高曲线下面积（AUC)的方法，所述方法包括 下述步骤：将1-5个CTP连接至所述凝血因子的羧基端，由此延长所述凝血因子的生物半衰 期或提高AUC。在另一个实施方案中，本文提供了一种延长FIX的生物半衰期的方法或提 高曲线下面积（AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将1-5个CTP连接至FIX的羧基端， 由此延长生物半衰期或提高FIX的AUC。在另一个实施方案中，本文提供了一种延长FVII 或FVIIa的生物半衰期的方法或提高曲线下面积（AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将 1-5个CTP连接至FVII或FVIIa的羧基端，由此延长生物半衰期或提高FVII或FVIIa的 AUC。
[0069] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的 方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多 肽的羧基端，由此延长所述FIX多肽的生物半衰期。在另一个实施方案中，本发明另外提供 了一种延长因子Vila (FVIIa)多肽的生物半衰期的方法，所述方法包括下述步骤：将至多5 个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此延长所述FVIIa 多肽的生物半衰期。在一个实施方案中，将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至 所述FVIIa多肽的羧基端。在另一个实施方案中，将4个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP) 连接至所述FVIIa多肽的羧基端。在另一个实施方案中，将5个绒毛膜促性腺激素羧基端 肽（CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端。
[0070] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种提高因子IX(FIX)多肽的曲线下面积 (AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所 述FIX多肽的羧基端，由此提高所述FIX多肽的AUC。在另一个实施方案中，本发明提供了 一种提高因子Vila(FVIIa)多肽的曲线下面积（AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将至 多5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此提高所述 FVIIa多肽的AUC。在一个实施方案中，将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所 述FVIIa多肽的羧基端。在另一个实施方案中，将4个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP) 连接至所述FVIIa多肽的羧基端。在另一个实施方案中，将5个绒毛膜促性腺激素羧基端 肽（CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端。
[0071] 在另一个实施方案中，本发明的凝血因子是蛋白。在另一个实施方案中，本发明 的凝血因子是肽。在另一个实施方案中，本发明的凝血因子是多肽。在另一个实施方案中， 所述凝血因子是酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是丝氨酸蛋白酶。在另一个实施 方案中，所述凝血因子是糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是转谷氨酰胺酶。在 另一个实施方案中，所述凝血因子是无活性酶原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是本 领域技术人员已知的任意凝血因子。
[0072] 在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子VIII (FVIII)。在另一个实施方案中， 所述凝血因子是因子V(FV)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子XIII(FXIII)。在 另一个实施方案中，所述凝血因子是因子X (FX)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是纤 维蛋白。
[0073] 在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子VIIa(FVIIa)。在另一个实施方案中， 所述凝血因子是因子VII (FVII)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子IX (FIX)。在 另一个实施方案中，所述凝血因子是因子X (FX)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因 子XIa(FXIa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子XII (FXII)。在另一个实施方案 中，所述凝血因子是因子Xa(FXa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子Va(FVa)。 在另一个实施方案中，所述凝血因子是凝血酶原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是 凝血酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子XI (FXI)。在另一个实施方案中，所 述凝血因子是Von Willebrand因子（vWF)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子 Villa(FVIIIa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是B删除的结构域FVIII (FVIIIBDD)。 在另一个实施方案中，所述凝血因子是B结构域删除的FVIII (FVIIIBDD)。在另一个实施 方案中，所述凝血因子是P结构域删除的FVIII(FVIIIBDD)。在另一个实施方案中，所述 凝血因子是因子IXa(FIXa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是前激肽释放酶。在另 一个实施方案中，所述凝血因子是激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子 XIIa(FXIIa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是纤维蛋白原。在另一个实施方案中， 所述凝血因子是血栓调节蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子II (FII)。
[0074] 在另一个实施方案中，所述凝血因子是糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因 子是维生素 K依赖性的糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是维生素 K非依赖性 的糖蛋白。
[0075] 在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血 因子是重组糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组糖蛋白FV。在另一个实施 方案中，所述凝血因子是重组FVI。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVII。在另 一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVIII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组 FIX。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FX。在另一个实施方案中，所述凝血因子 是重组FXI。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXII。在另一个实施方案中，所述 凝血因子是重组FvW。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FII。在另一个实施方案 中，所述凝血因子是重组FIXa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXIa。在另一 个实施方案中，所述凝血因子是重组纤维蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组 FVIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXa。在另一个实施方案中，所述凝血因 子是重组FVa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组凝血酶原。在另一个实施方案 中，所述凝血因子是重组凝血酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVIIIa。在另 一个实施方案中，所述凝血因子是重组前激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子 是重组激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXIIa。在另一个实施方案 中，所述凝血因子是任意已知的重组凝血因子。在另一个实施方案中，所述包含信号肽的凝 血因子是任意已知的重组凝血因子。
[0076] 在另一个实施方案中，凝血因子包含1-10个连接至C-端的CTP重复且不包含连 接至N-端的CTP。在另一个实施方案中，凝血因子包含至少一个连接至C-端的CTP且不 包含连接至N-端的CTP。在另一个实施方案中，包含1-10个连接至C-端的CTP重复且不 包含连接至N-端的CTP的凝血因子是经工程改造的凝血因子。在另一个实施方案中，包含 至少一个连接至C-端的CTP且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是经工程改造的凝 血因子。在另一个实施方案中，包含1-10个连接至C-端的CTP重复且不包含连接至N-端 的CTP的凝血因子是缀合的凝血因子。在另一个实施方案中，包含至少一个连接至C-端的 CTP且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是缀合的凝血因子。
[0077] 在一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多 肽和连接至所述CTP修饰的FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。
[0078] 在另一个实施方案中，本发明另外提供了一种CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽， 其由FVIIa多肽和连接至所述FVIIa的羧基端的5个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。
[0079] 在另一个实施方案中，所述凝血因子是包含与FIX、FVII、因子X、蛋白C或凝血酶 原的结构域组构类似或相同的结构域组构的凝血因子。在另一个实施方案中，所述凝血因 子被合成为具有N-端前肽的前体。在另一个实施方案中，本文中使用的凝血因子是呈无活 性的前酶形式。在另一个实施方案中，所述凝血因子是在肝细胞中产生。在另一个实施方 案中，所述凝血因子包含Y羧化酶的停泊位点，所述Y羧化酶将谷氨酸（Glu)转化成Y 羧基谷氨酸（Gla)。在另一个实施方案中，本文中使用的凝血因子是商购可得的凝血因子。
[0080] 在一个实施方案中，编码因子VII的核酸序列包含下述核酸序列：

【权利要求】
1. 一种CTP修饰的因子IX (FIX)多肽，其由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多 肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。
2. 根据权利要求1所述的CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氛基酸序列编码。
3. 根据权利要求1-2中的任一项所述的CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP被糖 基化。
4. 根据权利要求1-3中的任一项所述的CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP被截 短。
5. 根据权利要求1-4中的任一项所述的CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP经由 接头连接至所述FIX多肽。
6. 根据权利要求5所述的CTP修饰的FIX多肽，其中所述接头是肽键。
7. -种药物组合物，其包含根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的FIX多肽。
8. -种多核苷酸，其编码根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的多肽。
9. 一种表达载体，其包含根据权利要求8所述的多核苷酸。
10. -种细胞，其包含根据权利要求9所述的表达载体。
11. 一种组合物,其包含根据权利要求9所述的表达载体。
12. -种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给受试者施用根据权利要求 1-6中的任一项所述的CTP修饰的因子IX(FIX)多肽。
13. 根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的因子IX(FIX)多肽在制备用于治 疗受试者中的血友病的组合物中的用途。
14. 根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的因子IX(FIX)多肽用于治疗受试 者中的血友病的用途。
15. -种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期、提高曲线下面积（AUC)、降低施用频率 或降低清除率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连 接至所述FIX多肽的羧基端，由此延长所述FIX多肽的生物半衰期、提高曲线下面积（AUC)、 降低施用频率或降低清除率。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。
17. 根据权利要求15-16中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被糖基化。
18. 根据权利要求15-17中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被截短。
19. 根据权利要求15-18中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所 述FIX多肽。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述接头是肽键。
21. 根据权利要求15所述的方法，其中所述CTP修饰的FIX多肽的序列是在SEQ ID NO: 31中阐述的序列。
22. -种生产CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒 毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此生产CTP修饰的FIX 多肽。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述CTP修饰的FIX多肽的序列是在SEQ ID NO :31中阐述的序列。
24. 根据权利要求22-23中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氛基酸序列编码。
25. 根据权利要求22-24中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被糖基化。
26. 根据权利要求22-25中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被截短。
27. 根据权利要求22-26中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所 述FIX多肽。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述接头是肽键。
29. -种预防受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括下述步骤：给所 述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血因子包含连接至所述凝血因子的 羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此预防所述受试者中的血液凝固或 凝结障碍。
30. 包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修饰的凝血因子在制备药物中的用途，所述药物用于预防受试者中的血液凝固或凝结 障碍。
31. 包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修饰的凝血因子在预防受试者中的血液凝固或凝结障碍中的用途。
32. -种治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括下述步骤：给所 述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血因子包含连接至所述凝血因子的 羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此治疗所述受试者中的血液凝固或 凝结障碍。
33. 包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修饰的凝血因子在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的血液凝固或凝结 障碍。
34. 包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修饰的凝血因子用于治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的用途。
35. 根据权利要求29-34中的任一项所述的方法或用途，其中所述CTP修饰的凝血因子 的序列选自：SEQ ID NO:25、27或29。
36. 根据权利要求29-35中的任一项所述的方法或用途，其中至少一个CTP是由选自 SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2的氨基酸序列编码。
37. 根据权利要求29-36中的任一项所述的方法或用途，其中至少一个CTP被糖基化。
38. 根据权利要求29-37中的任一项所述的方法或用途，其中至少一个CTP被截短。
39. 根据权利要求29-38中的任一项所述的方法或用途，其中至少一个CTP经由接头连 接至所述凝血因子。
40. 根据权利要求39所述的方法或用途，其中所述接头是肽键。
41. 根据权利要求29-40中的任一项所述的方法或用途，其中所述凝血因子是FVII。
42. 根据权利要求41所述的方法或用途，其中所述FVII是活化的FVII (FVIIa)。
43. 根据权利要求29-42中的任一项所述的方法或用途，其中所述障碍是血友病。
44. 根据权利要求29-43中的任一项所述的方法或用途，其中所述受试者是儿童。
45. 根据权利要求29、32或35-44中的任一项所述的方法，其中所述施用是经由皮下途 径。
46. -种延长因子VII (FVII)多肽的生物半衰期、提高曲线下面积（AUC)、降低施用 频率或降低清除率的方法，所述方法包括下述步骤：将3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)连接至所述FVII多肽的羧基端，由此延长所述FVII多肽的生物半衰期、提高曲线下 面积（AUC)、降低施用频率或降低清除率。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。
48. 根据权利要求46-47中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被糖基化。
49. 根据权利要求46-48中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被截短。
50. 根据权利要求46-49中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所 述FVII多肽。
51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述接头是肽键。
52. 根据权利要求46-51中的任一项所述的方法，其中所述FVII是活化的 FVII(FVIIa)。
53. -种生产CTP修饰的因子VII (FVII)多肽的方法，所述方法包括下述步骤：将3个 绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FVII多肽的羧基端，由此生产CTP修饰的 FVII多肽。
54. 根据权利要求53所述的方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。
55. 根据权利要求53-54中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被糖基化。
56. 根据权利要求53-55中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被截短。
57. 根据权利要求53-56中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所 述FVII多肽。
58. 根据权利要求57所述的方法，其中所述接头是肽键。
59. 根据权利要求53-58中的任一项所述的方法，其中所述FVII是活化的 FVII(FVIIa)。
60. -种CTP修饰的因子VII (FVII)多肽，其由FVII多肽和连接至所述CTP修饰的 FVII多肽的羧基端的3-5个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。
61. 根据权利要求60所述的CTP修饰的FVII多肽，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氛基酸序列编码。
62. 根据权利要求60-61中的任一项所述的CTP修饰的FVII多肽，其中至少一个CTP 被糖基化。
63. 根据权利要求60-62中的任一项所述的CTP修饰的FVII多肽，其中至少一个CTP 被截短。
64. 根据权利要求60-63中的任一项所述的CTP修饰的FVII多肽，其中至少一个CTP 经由接头连接至所述FVII多肽。
65. 根据权利要求64所述的CTP修饰的FVII多肽，其中所述接头是肽键。
66. -种药物组合物，其包含根据权利要求60-76中的任一项所述的CTP修饰的FVII 多肽。
67. -种多核苷酸，其编码根据权利要求60-65中的任一项所述的CTP修饰的多肽。
68. -种表达载体，其包含根据权利要求67所述的多核苷酸。
69. -种细胞，其包含根据权利要求68所述的表达载体。
70. -种组合物，其包含根据权利要求68所述的表达载体。
71. -种治疗或预防受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括：给受试 者施用根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的因子IX(FIX)多肽。
72. 根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的因子IX(FIX)多肽在制备组合物 中的用途，所述组合物用于治疗或预防受试者中的血液凝固或凝结障碍。
73. 根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的因子IX(FIX)多肽用于治疗或预 防受试者中的血液凝固或凝结障碍的用途。
74. 根据权利要求71-73中的任一项所述的方法或用途，其中所述障碍是血友病。
【文档编号】A61K38/24GK104427994SQ201380019660
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2012年2月14日
【发明者】U·E·菲马, G·哈特 申请人:奥普科生物制品有限公司