病毒样颗粒组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供包含多肽和至少一种抗原的颗粒，和包含它们的组合物。
【专利说明】病毒样颗粒组合物
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请要求于2012年2月16日申请的美国临时专利申请号61/599, 746的权益，其全 部内容都通过引用结合到本文中。 技术背景
[0002] 本发明涉及包含多肽和至少一种抗原的颗粒，和包含它们的组合物。
[0003] 背景 病毒样颗粒（VLP)是多蛋白结构，其模拟真实的天然病毒的组织和构造但缺少病毒基 因组，可能产生更安全和更便宜的疫苗候选物。一部分预防性的基于VLP的疫苗目前在全 球范围内已商业化：葛兰素史克公司的Engerix? (乙肝病毒）和Cervarix? (人乳头瘤病 毒），以及默克公司（Merck&Co.,Inc.)的RecombivaxHB? (乙肝病毒）和Gardasil? (人乳头瘤病毒）就是一些实例。其它基于VLP的疫苗候选物处于临床试验中或正在进行 临床前评价，例如，流感病毒、细小病毒、Norwalk和各种嵌合VLP。许多其它的仍仅限于小 规模基础研究，尽管它们在临床前试验中是成功的。关于大规模VLP生产，在工艺控制、监 测和优化的背景下讨论。因此鉴定和讨论了主要的上下游技术挑战。对于治疗性或预防性 的疫苗接种，伴随最新的临床试验结果和近来基于嵌合VLP技术的进展，暂时呈现出成功 的基于VLP的疫苗的突起。（ExpertRev.Vaccines9(10)，1149-1176，2010)。
[0004] 自从基孔肯雅病毒（CHIKV)于2004年自肯尼亚再度出现以来，这种甲病毒已经感 染了非洲、欧洲和亚洲的几百万人。由于缺乏疫苗或抗病毒治疗，该疾病的严重性和该流行 性病毒的传播带来了严重的公共健康威胁。据报道针对流行性基孔肯雅病毒的VLP疫苗保 护非人类灵长类动物免于感染（NatMed. 2010March; 16(3) : 334-338)。美国专利公布号 2012/0003266公开了包含一种或多种基孔肯雅病毒结构多肽的病毒样颗粒（VLP)，其可用 于配制针对基孔肯雅的疫苗或抗原组合物，其诱导针对感染或其至少一种症状的免疫力。W02012/106356公开了修饰的甲病毒或黄病毒病毒样颗粒（VLP)和用于增强修饰的VLP的 生产的方法，用于预防或治疗甲病毒和黄病毒-介导的疾病。（这些引用的参考文献通过引 用结合到本文中）。
[0005] 发明概述 在第一方面，本发明提供能够自我装配的颗粒，其包含多肽和至少一种抗原，其中所述 多肽包含至少一个第一附着位点和所述至少一种抗原包含至少一个第二附着位点，和其中 所述多肽和所述抗原通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点而连接。
[0006] 在第二方面，本发明提供核酸分子，其包含编码在本发明第一方面中提供的颗粒 的核苷酸序列。
[0007] 在第三方面，本发明提供组合物，其包含在本发明第一方面中提供的颗粒和/或 在本发明第二方面中提供的核酸分子。
[0008] 在第四方面，本发明提供产生抗体的方法，包括使在本发明第一方面中提供的颗 粒和/或在本发明第二方面中提供的核酸分子与哺乳动物接触。
[0009] 在第五方面，本发明提供免疫调节的方法，治疗自身免疫性疾病的方法，在哺乳动 物中诱导和/或增强针对抗原的免疫应答的方法，和治疗癌症的方法，包括将在本发明第 三方面中提供的组合物给予哺乳动物。
[0010] 在第六方面，本发明提供被动免疫的方法，包括将在本发明第四方面中提供的抗 体给予哺乳动物。
[0011] 在第七方面，本发明提供在巨噬细胞上呈递抗原的方法，包括使在本发明第一方 面中提供的颗粒和/或在本发明第二方面中提供的核酸分子与哺乳动物接触。
[0012] 在第八方面，本发明提供用于产生在本发明第一方面中提供的颗粒的方法，包括： 制备包含编码所述颗粒的核苷酸序列的基因；培养已用所述基因转染的细胞，以表达所述 颗粒；和回收所述颗粒。
[0013] 附图简述 图1显示待插入到委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV)结构多肽中的TNFa序列的修饰。
[0014] 图2显示蛋白质印迹结果，表明TNFa缀合的VLP已表达。
[0015]图 3 显示VLP_CHI512 载体。
[0016]图 4 显示VLP_CHI532 载体。
[0017]图 5 显示VLP_CHI520 载体。
[0018]图 6 显示VLP_VEEVVLP518 载体。
[0019]图 7 显示VLP_VEEVVLP519 载体。
[0020] 图 8 显示VLP_VEEVVLP538 载体。
[0021] 图9显示由TNFa衍生的肽-缀合的病毒样颗粒所诱导的抗TNFa抗体的检测。
[0022] 图10显示由⑶20衍生的肽-缀合的病毒样颗粒所诱导的抗人⑶20抗体的检测。
[0023] 图11显示由⑶20衍生的肽-缀合的病毒样颗粒所诱导的抗小鼠⑶20抗体的检 测。
[0024] 发明详述 (1)何含多狀和至小一种抗原的颗粒 在第一方面，本发明提供能够自我装配的颗粒，其包含多肽和至少一种抗原，其中所述 多肽包含至少一个第一附着位点和所述至少一种抗原包含至少一个第二附着位点，和其中 所述多肽和所述抗原通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点而连接。
[0025] 如本文所用，"能够自我装配的颗粒"是指由至少一种自发装配的组分构成的颗 粒。所述组分可以是多肽或非肽化合物。在一个实施方案中，"能够自我装配的颗粒"可以 是包含至少一种多肽或由其组成的颗粒。所述至少一种多肽由一种或多种类型的肽组成。 在一个实施方案中，所述颗粒的直径为至少l〇nm，例如至少20nm，优选地至少50nm。在一个 实施方案中，所述颗粒的分子量为100kDa至100,OOOkDa，优选400kDa至30,OOOkDa。
[0026] 用于本发明的多肽并未被限定，只要它自发装配。所述多肽可以是病毒结构多肽。 因此，本发明提供的颗粒可以是病毒样颗粒。
[0027] 病毒结构多肽可以是天然存在的病毒多肽或其修饰的多肽。在一个实施方案中， 所述修饰的多肽与包括衣壳和被膜蛋白在内的天然存在的病毒结构多肽具有至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%或98%氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述修饰的多肽是突 变体，其中至多10%的氨基酸被缺失、置换和/或添加到包括衣壳和被膜蛋白在内的天然存 在的病毒结构多肽。
[0028] 在一个实施方案中，用于本发明的病毒结构多肽包含衣壳和/或被膜蛋白或其片 段或由其组成。例如，被膜蛋白包含选自E3、E2、6K和E1的至少一种。用于本发明的病毒 结构多肽可衍生自甲病毒或黄病毒。因此，本发明提供的颗粒可以是衍生自甲病毒或黄病 毒的病毒样颗粒。
[0029]甲病毒和黄病毒的实例包括但不限于奥拉病毒（Auravirus)、Babanki病毒、BarmahForest病毒（BFV)、Bebaru病毒、Cabassou病毒、基孔肯雅病毒（CHIKV)、东方马 脑炎病毒（EEEV)、埃拉特病毒（Eilatvirus)、沼泽地病毒（Evergladesvirus)、摩根堡病 毒（FortMorganvirus)、盖塔病毒（Getahvirus)、高地J病毒（HighlandsJvirus)、Kyzylagach病毒、马雅罗病毒（Mayarovirus)、MeTri病毒、米德尔堡病毒（Middelburg virus)、MossodasPedras病毒、Mucambo病毒、恩杜姆病毒（Ndumuvirus)、奥续续病毒 (O'nyong-nyongvirus)、Pixuna病毒、RioNegro病毒、罗斯河病毒（Rossrivervirus,RRV)、娃鱼膜腺病病毒（Salmonpancreasdiseasevirus)、SemlikiForest病毒、辛德 比斯病毒（Sindbisvirus)、南方象海豹病毒（Southernelephantsealvirus)、Tonate病毒、Trocara病毒、Una病毒、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV)、西方马脑炎病毒（WEEV)、Whataroa病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、蝶传脑炎病毒和黄热病病毒。
[0030] 本文所用的术语"抗原"是指如果被MHC分子呈递，能够被抗体或T细胞受体（TCR) 结合的分子。术语"抗原"，如本文使用，也包括T细胞表位。在存在于除红细胞外的机体所 有细胞上的MHCI类的情况下，或在存在于免疫细胞和尤其是抗原呈递细胞上的MHCII类 的情况下，T细胞表位被T细胞受体识别。这样的识别事件导致T细胞活化和随后的效应器 机制，例如T细胞的增殖、细胞因子的分泌、穿孔素的分泌等。抗原还能被免疫系统识别和/ 或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B-和/或T-淋巴细胞的活化。然而， 至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或者连接于TH细胞表位，并且包含于佐剂中。一种抗原可能包含一种或多种表位（B和T表位）。上面提到的特异性反应指抗原优选地通常 以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的许多其它抗体 或TCR反应。本文所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。抗原，如本文所用，包括但 不限于变应原、自体抗原、半抗原、癌抗原（即肿瘤抗原）和感染性疾病抗原以及有机小分 子例如滥用的药物（例如烟碱）及其片段和衍生物。此外，用于本发明的抗原可以是肽、蛋 白质、结构域、碳水化合物、生物碱、脂质或小分子例如留体激素及其片段和衍生物、自身抗 体和细胞因子本身。
[0031]细胞因子的实例包括但不限于：白介素（IL)，包括超过30个种类，例如IL-1a、IL-13、IL-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11 至-37;干扰素（IFN)，例如IFN-a、IFN-0和正^?;肿瘤坏死因子（TNF)，例如TNF-a和TNF-0;转化生长因子（TGF)，例如TGF-a和TGF- @ ;集落刺激因子（CSF)，例如粒细胞-集落刺激因子（G-CSF)、粒细胞-巨 噬细胞-集落刺激因子（GM-CSF)、巨噬细胞-集落刺激因子（M-CSF)、红细胞生成素（EP0)、 干细胞因子（SCF)和单核细胞趋化和活化因子（MCAF);生长因子（GF)例如表皮生长因子 (EGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、胰岛素样生长因子（IGF)、神经生长因子（NGF)、脑衍 生的神经营养因子（BDNF)、血小板衍生的生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、肝 细胞生长因子（HGF)、角质细胞生长因子（KGF)、血小板生成素（TP0)、和骨形态发生蛋白 (BMP);和其它多肽因子，包括LIF、kit配体（KL)、MPO(髓过氧化物酶）和CRP(C-反应 蛋白）；C0X(环加氧酶），例如C0X-l、C0X-2和COX-3 ;N0S(-氧化氮合酶）例如N0S-1、N0S-2 和N0S-3;等等。
[0032] 细胞因子还包括趋化因子，其是诱导趋化性的细胞因子。有两个主要类型的趋化 因子，CXC和CC。CXC趋化因子，例如嗜中性粒细胞-活化蛋白-2 (NAP-2)和黑素瘤生长 刺激活性蛋白（MGSA)，主要对于嗜中性粒细胞和T淋巴细胞是趋化性的，而CC趋化因子，例 如RANTES、巨噬细胞炎性蛋白（MIP)包括MIP-la和MIP-1P、角质细胞-衍生的趋化因子 (KC)、单核细胞趋化蛋白（MCP-l、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5)和嗜酸性粒细胞趋化因子 (-1和-2)，对于其它细胞类型中的巨噬细胞、T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树 突细胞和嗜碱性粒细胞是趋化性的。还存在趋化因子淋巴细胞趋化蛋白-1、淋巴细胞趋化 蛋白-2 (两者都是C趋化因子）和fractalkine(-种CX3C趋化因子），这些未落入主要 趋化因子亚家族的任何一类中。
[0033] 本文所用的术语"抗原决定簇"是指被B或T-淋巴细胞特异性识别的抗原部分。B-淋巴细胞经由抗体产生而响应外源抗原决定簇，而T淋巴细胞是细胞免疫的介质。因此， 抗原决定簇或表位是由抗体识别的抗原部分，或者是在MHC的情况下由T细胞受体识别的 抗原部分。抗原决定簇含有一个或多个表位。
[0034] 本文所用的术语"抗体"是指能够结合表位或抗原决定簇的分子。该术语意指包括 完整抗体及其抗原结合片段，包括单链抗体。这样的抗体包括人抗原结合抗体片段和包括 但不限于Fab、Fab'和F(ab'）2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv) 和包含VL或VH结构域的片段。抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选 地，抗体是哺乳动物抗体，所述哺乳动物例如人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马等，或是其它合 适的动物（例如鸡）。如本文所用，"人"抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体， 并包括分离自人免疫球蛋白文库或一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物（其不表达内 源免疫球蛋白）的抗体，例如描述于美国专利号5, 939, 598,其公开内容通过引用全部结合 到本文中。
[0035] 抗原可以是并非源自病毒（例如基孔肯雅病毒、委内瑞拉马脑炎病毒）的一种物 质（例如蛋白）。
[0036] 在一个实施方案中，用于本发明的抗原是表1所列举的至少一个靶标或源自它们 的多肽。
【权利要求】
1. 能够自我装配的颗粒，其包含多肽和至少一种抗原，其中所述多肽包含至少一个第 一附着位点和所述至少一种抗原包含至少一个第二附着位点，和其中所述多肽和所述抗原 通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点而连接，和其中当在抗原或含有所述 抗原的天然存在的蛋白或源自其的修饰的蛋白的晶体中测定距离时，所述抗原的N-末端 残基和C-末端残基之间的空间距离为30人或更小。
2. 权利要求1的颗粒，其中所述颗粒是病毒样颗粒。
3. 包含病毒结构多肽和至少一种抗原的颗粒，其中所述病毒结构多肽包含至少一个第 一附着位点和所述至少一种抗原包含至少一个第二附着位点，和其中所述病毒结构多肽和 所述抗原通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点而连接，和其中所述颗粒是 病毒样颗粒。
4. 权利要求2或3的颗粒，其中所述病毒样颗粒衍生自甲病毒或黄病毒。
5. 权利要求4的颗粒，其中所述甲病毒或黄病毒选自奥拉病毒、Babanki病毒、Barmah Forest病毒（BFV)、Bebaru病毒、Cabassou病毒、基孔肯雅病毒（CHIKV)、东方马脑炎病毒 (EEEV)、埃拉特病毒、沼泽地病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、商地J病毒、Kyzylagach病毒、马 雅罗病毒、MeTri病毒、米德尔堡病毒、MossodasPedras病毒、Mucambo病毒、恩杜姆病毒、 奥绒绒病毒、Pixuna病毒、RioNegro病毒、罗斯河病毒（RRV)、鲑鱼胰腺病病毒、Semliki Forest病毒、辛德比斯病毒、南方象海豹病毒、Tonate病毒、Trocara病毒、Una病毒、委内瑞 拉马脑炎病毒（VEEV)、西方马脑炎病毒（WEEV)、Whataroa病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、 蝶传脑炎病毒和黄热病病毒。
6. 权利要求5的颗粒，其中所述甲病毒是基孔肯雅病毒（CHIKV)或委内瑞拉马脑炎病 毒（VEEV)。
7. 权利要求2-6中任一项的颗粒，其中所述多肽是包含被膜蛋白的病毒结构多肽。
8. 权利要求2-7中任一项的颗粒，其中所述多肽是包含衣壳和/或被膜蛋白E3、E2、6K和El的病毒结构多肽。
9. 权利要求8的颗粒，其中将所述至少一种抗原插入到被膜蛋白的E2。
10. 权利要求1-9中任一项的颗粒，其中所述抗原是选自自身抗原和癌抗原的至少一 种。
11. 权利要求1-10中任一项的颗粒，其中所述抗原是衍生自TNF-a、⑶20或CTLA4的 多肽。
12. 权利要求1-11中任一项的颗粒，其中所述多肽是衍生自基孔肯雅病毒（CHIKV)或 委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV)的多肽。
13. 权利要求中1-12任一项的颗粒，其中所述多肽和所述至少一种抗原是 i) 衍生自基孔肯雅病毒（CHIKV)的多肽和TNF-a的多肽； ii) 衍生自基孔肯雅病毒（CHIKV)的多肽和⑶20的多肽； iii) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV)的多肽和TNF-a的多肽；或 iv) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV)的多肽和CD20的多肽 v) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV)的多肽和CTLA4的多肽。
14. 权利要求1-13中任一项的颗粒，其中所述至少一种抗原和所述多肽表达为融合蛋
15. 权利要求14的颗粒，其中所述多肽和所述至少一种抗原直接融合。
16. 权利要求14的颗粒，其中所述至少一种抗原与所述多肽融合，其中一个或两个接 头插入在所述抗原的N-末端残基和所述多肽之间和/或在所述抗原的C-末端残基和所述 多肽之间。
17. 权利要求15或16的颗粒，其中所述至少一种抗原插入在SEQIDNo. 1或2的残基 519和520之间、SEQIDNo. 1或2的残基530和531之间、SEQIDNo. 1或2的残基531 和532之间或SEQIDNo. 1或2的残基532和533之间。
18. 权利要求14-17中任一项的颗粒，其中所述融合蛋白是由SEQIDNo. 4、5、6、7或 8所示的氨基酸序列组成的蛋白。
19. 权利要求14-17中任一项的颗粒，其中所述融合蛋白衍生自以下蛋白质：所述蛋白 质由与SEQIDNo. 4、5、6、7或8所示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性的氨基 酸序列组成。
20. 权利要求1-13中任一项的颗粒，其中所述至少一种抗原以化学交联方式与所述多 肽连接。
21. 分离的核酸分子，包含编码权利要求1-20中任一项的颗粒的核苷酸序列。
22. 分尚的核酸分子，由SEQIDNo. 13、14、15、16或17所不的核苷酸序列组成。
23. 分离的核酸分子，由与SEQIDNo. 13、14、15、16或17所示的核苷酸序列具有90% 或更高的序列同一性的核苷酸序列组成。
24. 包含权利要求23的核酸分子的载体，其中所述载体任选包含与所述核酸分子操作 性连接的表达控制序列。
25. 组合物，包含权利要求1-20中任一项的颗粒和/或权利要求21-24中任一项的核 酸分子。
26. 药物组合物，包含： (a) 权利要求1-20中任一项的颗粒和/或权利要求21-24中任一项的核酸分子；和 (b) 药学上可接受的载体。
27. 疫苗组合物，包含权利要求1-20中任一项的颗粒。 28. DNA疫苗组合物，包含权利要求21-24中任一项的核酸分子。
29. 产生抗体的方法，包括使权利要求1-20中任一项的颗粒和/或权利要求21-24中 任一项的核酸分子与哺乳动物接触。
30. 权利要求29的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
31. 免疫调节的方法，包括将免疫有效量的权利要求25-28中任一项的组合物给予哺 乳动物。
32. 治疗自身免疫性疾病的方法，包括将免疫有效量的权利要求25-28中任一项的组 合物给予哺乳动物。
33. 在哺乳动物中诱导和/或增强针对抗原的免疫应答的方法，包括将有效量的权利 要求25-28中任一项的组合物给予所述哺乳动物。
34. 治疗癌症的方法，包括将有效量的权利要求25-28中任一项的组合物给予哺乳动 物。
35. 被动免疫的方法，包括将通过权利要求29或30的方法所获得的抗体给予哺乳动 物。
36. 权利要求35的方法，用于治疗癌症。
37. 权利要求34-36中任一项的方法，其中所述至少一种抗原是癌抗原。
38. 权利要求34-36中任一项的方法，其中所述至少一种抗原是一种或多种癌抗原。
39. 在巨噬细胞上呈递抗原的方法，包括使权利要求1-20中任一项的颗粒和/或权利 要求21-24中任一项的核酸分子与哺乳动物接触。
40. 产生权利要求14-19中任一项的颗粒的方法，包括：制备包含编码所述颗粒的核苷 酸序列的基因；培养已用所述基因转染的细胞，以表达所述颗粒；和回收所述颗粒。
【文档编号】A61P35/00GK104220462SQ201380020165
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年2月15日 优先权日:2012年2月16日
【发明者】上野隆司, 赤畑涉 申请人:Vlp治疗有限责任公司