抗pdgf-c抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及与PDGF-C抗原结合并且能够抑制PDGF-C与PDGFRα受体结合并能够抑制通过PDGF-C的PDGFRα活化的抗体。本发明还公开了此类抗体的应用。所述应用包括癌症的治疗。
LMBP 9484CB
2012.03.15
LMBP 9485CB
2012.03.15
LMBP 9483CB
2012.03.15
LMBP 9486CB
2012.03.15
LMBP 9487CB
2012.03.15
【专利说明】抗PDGF-C抗体
【技术领域】
[0001] 本发明涉及与I3DGF-C抗原结合并且能够抑制roGF-C与TOGFRa受体结合并能够 抑制通过I 3DGF-C的TOGFRa活化的抗体。本发明还公开了此类抗体的应用。所述应用包 括癌症的治疗。
【背景技术】
[0002] 源自血小板的生长因子C(roGF-C)在人中是345个氨基酸的蛋白质，其作为 323 个氨基酸的蛋白质被分泌（Hamada 等人 2000, FEBS Lett475:97 - 102 ;Li&Eriksson 2003，Cytokine Growth Factor Rev 14,91-98)。它是由 PDGF-A、-B、-C 和-D 组成的源 自血小板的生长因子家族的成员（Li等人2000，Nat Cell Biol 2:302-309 ;Bergsten等人 2001，Nat Cell Biol3:512-516;La Rochelle等人2001，Nat Cell Biol, 3:517-521)。四种 TOGF特征性的半胱氨酸结基序是形成同二聚体或异二聚体（PDGF-AA、-AB、-BB、-CC、-DD) 的关键（La Rochelle等人2001，Nat Cell Biol 3:517-521 ;Bergsten等人2001，Nat Cell Biol 3:512-516)。
[0003] 除保守的半胱氨酸结基序之外，这四种生长因子显示序列同源性。四种roGF以 其单体形式是失活的。在I 3DGF-C的情况下，它作为潜伏生长因子被分泌，并且N末端CUB 结构域的蛋白酶解去除是与其受体结合并活化其受体所需的。虽然存在CUB结构域是生 物学活性的一些报道，但普遍的看法是它们作用于使分泌的TOGF-C定位并阻遏其活性 (Reigstad等人2005, FEBS J 272:5723-5741)。能够活化TOGF-C的蛋白酶包括纤溶酶和 组织纤溶酶原激活物（tPA) (Lei 等人2007, Invest Ophthalmol Vis Sci48:2335_2342;Lei 2008,Invest Ophthalmol Vis Sci 49:42-48. )〇
[0004] PDGF-C经由同二聚体PDGF受体a (PDGFRa)且可能经由异二聚体PDGFRa/3 来调节生物过程。该受体的细胞外区域由五个免疫球蛋白样结构域组成，而细胞内部分是 酪氨酸激酶结构域。TOGF-CC与其受体的结合加强酪氨酸激酶结构域的活性，并且从而起 始细胞内信号传导事件，所述细胞内信号传导事件触发细胞应答例如增殖、迁移、收缩和存 活（Li等人2000, Nat Cell Biol 2:302-309)。因此，I3DGF-C活化细胞内信号传导事件， 所述细胞内信号传导事件接合对于众多生物过程必需的许多细胞应答，所述生物过程是哺 乳动物发育和健康所需的。小鼠敲除研究显示TOGF-C是腭发生所需的（Fredriksson等 人 2004, Cytokine Growth Factors Rev 15:197-204 ;Reigstad 等人 2005, J Biol Chem 278:17114-17120)。由于TOGF和TOGFR的过表达在TOGF/PDGFR系统中的异常，例如TOGFR 激酶的组成型活化，TOGFR激酶的活化突变，自分泌信号传导，促成许多人类疾病，尤其是 恶性肿瘤包括骨肉瘤、肺癌、神经胶质瘤以及恶性星形细胞瘤和成髓细胞瘤（Locker等人 2002, Cancer Res 62:3729-3735 ;Ekman 等人 1999, Oncogene 18:2481-2488 ;Zwerner&May 2002, 0ncogene21:3847-3854)。TOGF-C是转化细胞因子并且经由几种机制促进肿瘤生长， 所述机制包括肿瘤细胞的存活和增殖、用于癌症相关成纤维细胞的趋化现象和肿瘤新生血 管形成。已证实I 3DGF-C在裸鼠中诱导肿瘤，活化锚定依赖性生长，并且是NIH/3T3细胞的有 力转化生长因子（Li等人2002, Oncogene 22:1501-1510)。体内肿瘤生成可部分通过I3DGFC 介导的VEGF表达加以解释，所述TOGFC介导的VEGF表达促进肿瘤血管生成的间接刺激。最 后，PDGF-C在对化学疗法抗性的癌症肿瘤中是上调的。在临床前癌症模型中，siRNA介导的 PDGF-C水平减少逆转对顺钼的抗性（Yamano等人2010, Int J Cancer 126:437-449)。
[0005] PDGF-C 曾经被称为 VEGF-E (W099/47677)或 ZVEGF3 (W000/34474)。尽管已提出 对抗I3DGF-C活性的抗体（或双特异性抗VEGF/抗TOGF-C抗体）的使用（W099/47677、 W000/34474、TO01/28586、TO2005/011742、TO00/18212、TO 2005/087812)，但仍未报道已证 实抗肿瘤生成或抗血管形成活性的任何特异性单克隆抗体。
【发明内容】
[0006] 本发明涉及分离的单克隆抗体，所述分离的单克隆抗体以高亲和力与抗原TOGF-C 结合，能够抑制I3DGF-C与TOGFRa的结合，并且能够抑制通过TOGF-C的TOGFRa活化。上 述抗体特别与通过SEQ ID N0:96限定的肽结合。
[0007] 示例性分离的抗体包括包含下述互补决定区（⑶R)氨基酸序列组合中的任一种 的抗体，所述分离的抗体以高亲和力与抗原I 3DGF-C结合，能够抑制TOGF-C与TOGFR a的结 合，并且能够抑制通过I3DGF-C的TOGFR a活化：
[0008] ⑴分别具有SEQ ID NO:26、24和25中限定的氨基酸序列的轻链⑶Rl至3 ;以及 分别具有SEQ ID NO:35至37中限定的氨基酸序列的重链⑶Rl至3 ;
[0009] (ii)具有SEQ ID NO:22或23中限定的氨基酸序列的轻链⑶R 1 ;分别具有SEQ ID NO: 24和25中限定的氨基酸序列的轻链CDR 2和3;具有SEQ ID NO: 27或28中限定的 氨基酸序列的重链⑶R 1 ;具有SEQ ID N0:29、30或31中限定的氨基酸序列的重链⑶R 2; 以及具有SEQ ID N0:32、33或34中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3;
[0010] (iii)分别具有SEQ ID NO: 22、24和25中限定的氨基酸序列的轻链CDR 1至3 ; 具有SEQ ID N0:27中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1;具有SEQ ID N0:29或30中限定的 氨基酸序列的重链⑶R 2;以及具有SEQ ID N0:32或33中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ；
[0011] (iv)分别具有SEQ ID NO:23至25中限定的氨基酸序列的轻链⑶R 1至3 ;具有 SEQ ID N0:28中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1 ;具有SEQ ID N0:31中限定的氨基酸序列 的重链⑶R 2 ;以及具有SEQ ID N0:34中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ;
[0012] (V)分别具有SEQ ID N0:38、24和25中限定的氨基酸序列的轻链CDRl至3 ;具有 SEQ ID NO: 27中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1 ;具有SEQ ID NO: 30中限定的氨基酸序列 的重链⑶R 2 ;以及具有SEQ ID N0:33中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ;或
[0013] (vi)⑴至（V)中任一种的亲和力成熟的抗体。
[0014] 上述抗体中的任一种均可以是哺乳动物抗体、人抗体或人源化抗体。此外，上述抗 体中的任一种均可以是单价抗体或多价抗体，并且进一步可以是单特异性或多特异性的， 条件是与抗原I 3DGF-C的结合和抑制通过TOGF-C的TOGFR a活化得到维持。
[0015] 本发明还包含上述抗体中的任一种的抗原结合片段。
[0016] 本发明还涉及编码上述抗体或抗原结合片段中的任一种的分离的核酸。
[0017] 上述抗体、抗原结合片段或编码其中任一种的核酸中的任一种均预期用作药剂。 此类用途可以是单一使用（单一疗法）或与另外的治疗剂组合使用（组合疗法）。为此，上 述抗体、抗原结合片段或编码其中任一种的核酸中的至少一种可在药物组合物中配制，所 述药物组合物还可包含药学可接受的载体和任选的另外的治疗剂。所述药剂预期用于治疗 癌症、眼科障碍和特征在于新生血管形成的障碍。
[0018] 包含上述核酸中的任一种的载体和包含此类载体和/或表达上述抗体或其抗原 结合片段中的任一种的宿主细胞是本发明的进一步部分，如同用于产生上述抗体或其抗原 结合片段中的任一种的方法一样。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图 1 示出了在PatMhimerK PDGFRa 测定中，5种抗人PDGF-C抗体2D3、5A2、5H7、 16B1和29H1对通过人TOGF-C的TOGFR a活化的抑制活性。激活物TOGF-C以其EC80值施 加（参见实例4)。还包括不含抗体（含或不含激活物）的对照。
[0020] 图2示出了在PathFIume广^ PDGFRa测定中，抗人PDGF-C多克隆山羊IgG抗体 (来自R&D Systems的目录号AF1560)对通过人TOGF-C的TOGFRa活化的抑制活性。激活 物TOGF-C以其EC80值施加（参见实例4)。还包括不含抗体（含或不含激活物）的对照。
[0021] 图3示出了在PathHunter? PDGFRa测定中，重组人PDGFR a Fc嵌合体（来自R&D Systems的目录号6765-PR)对通过人I3DGF-C的I 3DGFR a活化的抑制活性。激活物TOGF-C 以其EC80值施加（参见实例4)。还包括不含受体（含或不含激活物）的对照。
[0022] 图4示出了如在竞争ELISA背景下测定的，抗TOGF-C单克隆抗体2D3、5A2、5H7、 16B1和29H1干扰TOGF-C与其受体的结合（参见实例5)。
【具体实施方式】
[0023] 术语"roGF-c"（源自血小板的生长因子C)在本文中用作一般术语，其因此还可被 称为PDGF-CC。鉴于PDGF-C指单体，PDGF-CC指PDGF-C的同二聚体形式。
[0024] 关于I3DGF-C作为治疗靶的工作导致一系列分离的单克隆抗体的发明，所述分离 的单克隆抗体以高亲和力与抗原I 3DGF-C结合（参见实例3和9)，并且能够抑制TOGF-C与 TOGFR a的结合（参见实例5)，并能够抑制通过TOGF-C的TOGFR a (PDGF受体a )活化（参 见实例4和9)。示例性抗体的治疗潜力通过成胶质细胞瘤肿瘤生长经由抗体的体内抑制得 到证实（参见实例7)。本领域仍明确存在具有此类治疗潜力的此类抗体的需要，因为目前 看起来无一可获得。
[0025] 示例性分离的抗体包括与具有通过SEQ ID N0:96限定的序列的肽结合的抗体，所 述分离的抗体以高亲和力与抗原I3DGF-C结合，能够抑制TOGF-C与TOGFRa的结合，并且 能够抑制通过I 3DGF-C的TOGFRa活化。特别地，这些抗体与SEQ ID N0:96的结合可经由 ELISA进行测定。在此类ELISA中，所述抗体与TOGF-C的结合的特征在于重复地高于或等 于3(三）的信号背景比。如本文使用的具体分析条件在实例6和表6的图例中概述。示 例性抗体对于I 3DGF-C的亲和力在纳摩尔范围内，特别是亲和力的特征在于IOnM或更低、 9nM或更低、8nM或更低、7nM或更低、6nM或更低、或5nM或更低的解离常数K D，例如0. 5nM至 2. 5nM、5nM或IOnM(即0? 5nM的下限和选自2. 5nM、5nM或IOnM的上限）的Kd ;或0? InM至 2. 5nM、5nM或IOnM(即0? InM的下限和选自2. 5nM、5nM或IOnM的上限）的KD。此类亲和 力可例如通过表面等离子体共振进行测定。如本文使用的具体分析条件在实例3中概述。
[0026] 示例性分离的抗体包括包含下述互补决定区（⑶R)氨基酸序列组合中的任一种 的抗体，所述分离的抗体以高亲和力与抗原I 3DGF-C结合，能够抑制TOGF-C与TOGFR a的结 合，并且能够抑制通过I3DGF-C的TOGFR a活化：
[0027] (i)分别具有SEQ ID NO:26、24和25中限定的氨基酸序列的轻链⑶Rl至3(即 CDRl 在 SEQ ID NO: 26 中限定，CDR2 在 SEQ ID NO: 24 中限定，并且 CDR3 在 SEQ ID NO: 25 中限定）；以及分别具有SEQ ID NO:35至37中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1至3 ;
[0028] (ii)具有SEQ ID NO:22或23中限定的氨基酸序列的轻链⑶R 1 ;分别具有SEQ ID NO: 24和25中限定的氨基酸序列的轻链CDR 2和3;具有SEQ ID NO: 27或28中限定的 氨基酸序列的重链⑶R 1 ;具有SEQ ID N0:29、30或31中限定的氨基酸序列的重链⑶R 2; 以及具有SEQ ID N0:32、33或34中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3;
[0029] (iii)分别具有SEQ ID NO: 22、24和25中限定的氨基酸序列的轻链CDR 1至3 ; 具有SEQ ID N0:27中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1;具有SEQ ID N0:29或30中限定的 氨基酸序列的重链⑶R 2;以及具有SEQ ID N0:32或33中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ；
[0030] (iv)分别具有SEQ ID NO:23至25中限定的氨基酸序列的轻链⑶R 1至3 ;具有 SEQ ID N0:28中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1 ;具有SEQ ID N0:31中限定的氨基酸序列 的重链⑶R 2 ;以及具有SEQ ID N0:34中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ;
[0031] (V)分别具有SEQ ID N0:38、24和25中限定的氨基酸序列的轻链CDRl至3 ;具有 SEQ ID NO: 27中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1 ;具有SEQ ID NO: 30中限定的氨基酸序列 的重链⑶R 2 ;以及具有SEQ ID N0:33中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ;或
[0032] (vi)⑴至（V)中任一种的亲和力成熟的抗体。
[0033] 上述抗体中的任一种均可以是哺乳动物抗体、人抗体或人源化抗体。此外，上述抗 体中的任一种均可以是单价抗体或多价抗体，并且进一步可以是单特异性或多特异性的， 条件是与抗原I 3DGF-C的结合和抑制通过TOGF-C的TOGFR a活化得到维持。
[0034] 本发明还包含上述抗体中的任一种的抗原结合片段。
[0035] 如本文使用的术语"抗体"指其产生通过免疫系统诱导的任何天然存在的抗体或 抗原结合蛋白质（免疫球蛋白或IgG)。"常规"抗体包含通过二硫键连接在一起的两条重 链和两条轻链，一条轻链通过二硫键与重链各自连接。每条重链具有在其一个末端处的可 变结构域（VH)，随后为多个恒定结构域（三个或四个恒定结构域，CHI、CH2、CH3和CH4， 取决于抗体种类）。每条轻链具有在其一个末端处的可变结构域（VL)和在其另一个末端 处的恒定结构域（CL);轻链的恒定结构域各自与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可 变结构域各自与重链的可变结构域对齐。这类抗体连同由仅两条重链组成并且由此缺乏 轻链的"非常规"天然存在类型的抗体一起存在于骆骑、单峰骆驼和美洲驼中。其他"非常 规"天然存在的抗体存在于护士S (绞口S科（Ginglymostomatidae))和须藍（须藍科 (Orectolobidae))的血清中。这后面一种抗体被称为Ig新抗原受体（IgNAR)。它们是由五 个恒定结构域（CNAR)和一个可变结构域（VNAR)组成的二硫键键合的同二聚体。不存在轻 链，并且个别可变结构域在溶液中是独立的，并且看起来跨越疏水界面不结合（Greenberg 等人 1995, Nature 374, 168-173 ;Nuttall 等人 2001，Mol Immunol38, 313-326 ;Diaz 等人 2002, Immunogenetics 54, 501-512 ;Nuttall 等人 2003, Eur J Biochem 270, 3543-3554)。 由于骆驼科和鲨鱼抗体特征性的重链二聚体结构，这些有时被称为"重链微型抗 体"（mnHCAb)或简单地"微型抗体"（mnAb)(Holliger&Hudson 2005, Nature Biotechnol 23, 1126-1136)。骆驼抗体和鲨鱼抗体的互补决定区3 (⑶R3)通常长（分别包含约16-21个 氨基酸和约16-27个氨基酸）于小鼠 VH区的⑶R3 (包含约9个氨基酸）（Muyldermans等 人1994,Prot Eng 7, 1129-1135 ;Dooley&Flajnik 2005,Eur J Immunol 35,936-945)。不 含轻链，这些重链抗体通过一个单个结构域与其抗原结合，所述一个单个结构域是重链免 疫球蛋白的可变抗原结合结构域，被称为Vab (骆驼科抗体）或V-NAR (鲨鱼抗体）。这些 最小的完整和独立的功能抗原结合片段Vab被称为纳米抗体或纳体（Muyldermans 2001，J Biotechnol 74, 277-302)。在一些情况下，由于其潜在高细胞摄取和保留，多价（二价、三 价、四价和五价等）Vab和/或V-NAR结构域可以是优选的，并且可通过重组技术或通过化 学方法例如WO 2010/033913中所述进行制备。轻链和/或重链的可变结构域直接涉及抗体 与抗原的结合。天然存在的轻链和重链的可变结构域具有相同的一般结构：通过三个互补 决定区（⑶R)连接的四个构架区（FR)(参见例如Kabat等人1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD)。轻链或重链中的CDR通过FR保持紧密接近，并且促成抗原结合位 点的形成。
[0036] 如本文使用的术语"互补决定区"或"⑶R" 一般指经典4链抗体的轻链和重链的 高变区，并且如通过Kabat规则、更特别地如在http://www. bioinf. org. uk/abs/上可获得 的Kabat规则、并更特别地在"如何通过查看序列来鉴定⑶R(How to identify the Q)Rs by looking at a sequence)"部分中限定的。用于测定⑶R区域的可替代规则在Chothia 系统（Chothia&Lesk 1987, J Mol Biol 196,901-917)中限定。进一步的替代方案遵循如 通过例如 Lefranc 1997 (Immunology Today 18, 509)提出的统一 Q)R 测定系统。
[0037] 抗体已通过几种方法进行修饰以便增加其抗原结合效价，所述方法包括通过在 2个IgG之间引入硫醚键的化学同二聚体化（例如Ghetie等人1997, Proc Natl Acad Sci USA 94,7509-7514 ;W0 99/02567 ;Wolff 等人 1993,Cancer Res 53,2560-2565)， 在将一个或多个半胱氨酸改造到重链羧基末端内之后经由分子间二硫键键合的二聚化 或聚合（例如 Shopes 1992, J Immunol 148, 2918-2922 ;W091/19515 ;Smith&Morrison 1994, BioTechnology 12, 683-688)。
[0038] 已使用基于两个不同杂交瘤细胞系的体细胞融合的四源杂交瘤（quadroma)技术 产生双特异性或双功能抗体，所述两个不同杂交瘤细胞系表达具有双特异性抗体的所需特 异性的鼠单克隆抗体（Milstein&Cuello 1983, Nature 305, 537-540)。作为另外一种选择， 双特异性或双功能抗体可通过两个不同的mAb或Ab片段的化学缀合而产生（Staerz等人 1985, Nature 314, 628-631 ;Brennan 等人 1985, Science 229, 81-83)。此外，重组双特异性 或双功能抗体形式已得到开发（Kriangkum等人2001，Biomol Eng 18, 31-40)。在其中有从 识别不同抗原的两个单链Fv(scFv)片段开始的串联单链Fv分子和双体（参见Economides 等人2003, Nat Med 9,47-52)。在串联scFv分子（taFv)中，将具有另外的肽接头的两个 scFv分子简单地连接在一起。各种接头可用于连接两个scFv片段和长度高达63个残基 的接头（Nakanishi 等人 2001，Annu Rev Immunol 19, 423-474)。使用极短的 Ala3 接头 或富含甘氨酸/丝氨酸的长接头，已实现可溶性串联scFv分子在细菌中的表达（Leung等 人 2000, J Immunol 164, 6495-6502 ;Ito 等人 2003, J Immunol 170, 4802-4809 ;Karni 等 人2002, J Neuroimmunol 125, 134-140)，并且对其优选的接头可以是如由Arndt&Krauss 2003, Methods Mol Biol 207,305-321)描述的接头。
[0039] 双体通过使连接VH和VL结构域的接头长度减少至大约5个残基由scFv片段产 生（Peipp&Valerius 2002, Biochem Soc Trans 30, 507-511)。该接头大小的减少促进通过 VH和VL结构域的交换配对的两条多肽链的二聚化。双特异性双体通过在相同细胞内表达 具有结构VHA-VLB和VHB-VLA (VH-VL配置）或VLA-VHB和VLB-VHA (VL-VH配置）的两条多 肽链来产生。还存在多价"体（abody)"例如三体和四体。
[0040] 为了避免失活同二聚体形成的问题，一种迫使双特异性双体生成的方法是结 进洞（knob-into-hole)双体的产生（Holliger 等人 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448)。通过氨基酸改变，在VH结构域中改造大结，并且在VL结构域中改造互补 洞。
[0041] 单链双体（scDb)代表改善双特异性双体样分子形成的可替代策略 (HoiIiger&ffinter 1997,Cancer Immunol Immunother 45, 128-130 ；ffu 等人 1996, Immunotechnology 2, 21-36)。双特异性单链双体通过用另外的中间接头连接两个双 体形成多肽链而产生，所述中间接头具有大约15个氨基酸残基的长度。随后，具有对应于 单体单链双体的分子量（50_60kDa)的所有分子均为双特异性的。
[0042] 双体可融合至Fe,以生成更Ig样的分子，命名为双双体（didiabody) (Lu等人 2004, J Biol Chem 279,2856-2865)。另外，在IgG的重链中包含两个Fab重复并能够结 合四个抗原分子的多价抗体构建体已得到描述（参见W00177342A1和Miller等人2003, J Tmmun〇1 170, 4854-4861)。
[0043] 术语"抗体片段"指包含抗体（亲本抗体）的一个或多个片段（通常为一个或多 个CDR)的任何分子，使得它结合亲本抗体与之结合的相同抗原。抗体片段包括Fv、Fab、 Fab'、Fab' -SH、单链抗体分子（例如scFv)、F (ab'）2、单可变VH结构域和单可变VL结 构域（Holliger&Hudson 2005, Nature Biotechnol 23,1126-1136)。该术语还包括微抗 体，即通常仅包含一个⑶R的亲本抗体的最小识别单元（Heap等人2005, J Gen Virol 86, 1791-1800)。片段中的任一种均可掺入多价和/或多特异性较大分子中，例如单特异 性或双特异性Fab2、单特异性或三特异性Fab 3、双scFv(单特异性或双特异性）、双体（单 特异性或双特异性）、三体（例如三价单特异性）、四体（例如四价单特异性）、微体等等 (Holliger&Hudson 2005, Nature Biotechnol 23, 1126-1136)。片段中的任一种还均可惨 入例如鲨鱼抗体的V-NAR结构域或骆驼科抗体的VhH结构域中（纳体）。所有这些均包括 在术语"抗体片段"中。
[0044] 术语"单克隆抗体"指基本上同质的抗体群体。与通常包括针对不同决定簇（表 位）的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比，每个单克隆抗体针对在抗原上的单一决定 簇。修饰词"单克隆"不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待依照本发明 使用的单克隆抗体可通过首先由KSll丨er&Milstein 1975，Nature 256,495-497)描述的 杂交瘤法进行制备，或可通过重组DNA方法（例如US 4, 816, 567)进行制备。单克隆抗体 还可使用例如 Clackson 等人 1991，Nature 352, 624-628 或 Marks 等人 1991，J Mol Biol 222, 581-597中描述的技术或者通过另外其他技术从噬菌体抗体文库中分离。
[0045] 术语"嵌合抗体"指与源自相同物种（例如不同种类的抗体）或不同物种的抗体 的一部分接在一起的抗体，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所需生物活性（例如US 4,816,567 ;Morrison 等人 1984, Proc Natl Acad Sci USA81, 6851-6855)。例如，非人（例 如鼠）抗体"人源化"形式是含有源自非人免疫球蛋白的最低限度序列的嵌合抗体。对于大 部分，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受体的高变区的残基替换为具有 所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种（供体抗体）的高变区的残基，所述非人物种例 如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区（FR)残基替换 为相应的非人残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。作 出这些修饰以进一步改进抗体性能。
[0046] 本发明抗体的示例性人源化形式可包括下述中的至少一种：
[0047] ⑴携带在⑶R外的区域中的最多至16个突变，如SEQ ID NO: 18至21中的任何 一个中给出的可变重链；
[0048] (ii)携带在⑶R外的区域中的最多至9个突变，如SEQ ID NO: 14至17中的任何 一个中给出的可变轻链；
[0049] (iii)携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID NO: 18中给出的可变重链： Val5Leu> AsplOGly> Lysl3Gln> Lysl9Arg> Asp42Gly> Arg44Gly> Ser74Asn> Ser84Asn> Lys87Arg、Ser88Ala、Met93Val 和 / 或 Thrll4Leu ;
[0050] (iv)携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID N0:20中给出的可变重链： Val5Leu> AsplOGly> Lysl3Gln> Lysl9Arg> Asp42Gly> Arg44Gly> Phe80Tyr> Ser84Asn> Lys87Arg、Ser88Ala、Ile93Val、Val97Ala 和 / 或 Thrll4Leu ;
[0051] (v)携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID N0:21中给出的可变重链： Val5Leu> AsplOGly> Lysl3Gln> Lysl9Arg> Asp42Gly> Arg44Gly> Ser74Asn> Ser77Asn> Ser84Asn、Ser88Ala、Ile93Val 和 / 或 Thrll4Leu ;
[0052] (vi)携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID N0:15中给出的可变轻链： Leu3Val、Thr7Ser、Se;rl4Th;r、Aspl7Gln、Glnl8P;ro、Lys50Arg、Leu88Val 和 / 或 Glyl05Gln ;
[0053] (vii)携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID NO: 16中给出的可变轻链： Leu3Val、Thr7Ser、Serl4Thr、Aspl7Gln、Glnl8Pro、Ala45Pro、Lys50Arg、Leu88Val 和 / 或 Glyl05Gln ;或
[0054] (viii)携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID NO: 17中给出的可变轻链： Leu3Val、Thr7Ser、Se;rl4Th;r、Aspl7Gln、Glnl8P;ro、Asn50Arg、Leu88Val 和 / 或 Glyl05Gln。
[0055] 本发明抗体的人源化形式的特定例子包含（i)通过SEQ ID NO: 102限定的可变重 链和如通过SEQ ID NO: 103限定的可变轻链，或（ii)通过SEQ ID NO: 104限定的可变重链 和如通过SEQ ID NO: 105限定的可变轻链，或（iii)通过SEQ ID NO: 106限定的可变重链 和如通过SEQ ID NO: 107限定的可变轻链。这些人源化抗体中任一种的抗原结合片段也是 本发明的主题。
[0056] "人抗体"是通过人产生的抗体和/或已使用用于制备人抗体的任何一种技术 制备的抗体。人抗体可使用本领域已知的各种技术例如通过从表达人抗体的噬菌体文 库中选择而产生（例如 Vaughan 等人 1996, Nature Biotechnol 14, 309-314(1996); Sheets 等人 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 6157-6162 ;Hoogenboom&Winter 1991，J Mol Biol 227, 381-388 ;Marks 等人 1991，J Mol Biol 222,581-597)。人抗体还可通 过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物内进行制备，所述转基因动物例如其中内源 免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠。在攻击后，观察到人抗体产生（例如US 5, 545, 807；US 5, 545, 806 ；US 5, 569, 825 ；US 5, 625, 126 ；US 5, 633, 425 ；US 5,661,016； Marks 等人 1992, BioTechnology 10, 779-783 ;Lonberg 等人 1994, Nature 368, 856-859 ; Morrisonl994,Nature 368,812-813 ;Fishwild 等人 1996,Nature Biotechnol 14, 845-851 ；Lonberg&Huszar 1995, Internat Rev ImMinoI 13, 65-93)。作为另外一种选 择，人抗体可经由产生针对靶抗原的抗体的人淋巴细胞的永生化进行制备，其中此类淋巴 细胞可从个体中回收或可在体外免疫接种（例如Cole等人1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,第 77 页；Boerner 等人 1991，J Immunol 147, 86-95 ; US 5, 750, 373)。
[0057] 如本文使用的术语"通过SEQ ID NO:X/在SEQ ID NO:X中限定"指由SEQ ID NO:X 中给出的氨基酸或核苷酸序列组成的生物序列。例如，在SEQ ID N0:X中/通过SEQ ID NO:X 限定的抗原由SEQ ID N0:X中给出的氨基酸序列组成。进一步例子是包含SEQ ID N0:X的 氨基酸序列，其指长于SEQ ID N0:X中给出的氨基酸序列、但完全包含SEQ ID N0:X中给出 的氨基酸序列的氨基酸序列（其中SEQ ID N0:X中给出的氨基酸序列可位于更长氨基酸序 列的N末端或C末端，或可嵌入更长的氨基酸序列中），或指由SEQ ID NO:X中给出的氨基 酸序列组成的氨基酸序列。
[0058] 本发明还包括用于选择对抗原I3DGF-C具有增加的亲和力的抗体的方法，所述方 法包括步骤（i)对上文描述抗体中的任一种实施亲和力成熟的过程，和（ii)选择对抗原 TOGF-C具有增加的亲和力的抗体。
[0059] "亲和力成熟的抗体"是对亲本抗体施加亲和力成熟过程的结果。亲和力成熟的抗 体通常在一个或多个氨基酸位置中、包括在一个或多个CDR区中不同于其亲本抗体，所述 差异导致与亲本抗体对于抗原的亲和力相比较，亲和力成熟的抗体对于相同抗原改善的亲 和力。亲和力成熟过程包括如例如通过Marks等人1992, BioTechnology 10, 779-783描述 的过程（通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟）。CDR和/或构架残基的随机诱变通过 例如 Barbas 等人 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91，3809-3813 ;Schier 等人 1996, Gene 169:147-155 ;Yelton等人 1995, J ImMinoI 155, 1994-2004 ;Jackson等人 1995, J ImMinoI 154, 3310-3319 ;Hawkins 等人 1992, J Mol Biol 226, 889-896 描述。
[0060] 本发明抗体或所述抗体的抗原结合片段的衍生物包括但不限于由适当标记进行 标记的抗体或其片段，所述标记可例如具有酶促、比色、化学发光、荧光或放射性类型。本发 明抗体的衍生物一般包括起因于所述抗体或其片段与另一种化合物缀合的所有分子。此类 其他化合物可例如用于增加抗体或抗体片段的稳定性（例如半衰期）和/或可溶性；可以 是能够将前体药物转换为其活性形式（例如用于化学疗法中）的酶；或自身可具有细胞生 长抑制和/或细胞毒性特性。示例性衍生化修饰包括聚乙二醇化、在抗体或抗体片段主链 中引入（通过插入或突变）非天然存在的半胱氨酸（以制备交联位点）、糖基化（合成或经 由重组方法）等等。衍生化的进一步例子涉及下述的连接：细胞毒性剂（抑制或防止细胞 功能和/或引起细胞破坏的物质），例如放射性同位素（例如At211、I131、I125、Y 9°、Re186、Re188、 Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素）、化学治疗剂、以及细菌、真菌、植物或动物起源的毒 素例如小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体。本发明抗体的其他衍生物包 括双特异性抗体。此类抗体一方面对于TOGF-C蛋白质特异性（如上所述），并且另一方面 对于第二抗原特异性。第二抗原可以例如是任何领域公认的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗 原。此类I 3DGF-C和肿瘤抗原双特异性抗体可增加杀死TOGF-C表达细胞的效率。通常，双 特异性抗体的TOGF-C特异性通过引入本发明抗体的轻链或重链可变结构域中的一个或多 个或者轻链和/或重链可变结构域的CDR中的一个或多个而获得。
[0061] 本发明还涉及编码上述roGF-c结合抗体或其抗原结合片段中的任一种的分离的 核酸。多少熟悉遗传密码的任何人均能够将任何蛋白质序列翻译成核苷酸序列。此外，进行 此类"逆翻译"或"回译"的工具可广泛获得，例如http://www. bioinformatics. org/sms2/ rev trans. html 或 http://arbl. cvmbs. colostate. edu/molkit/rtranslate/index. html 或 http://www. entelechon. com/2008/10/backtranslation_tool/。需要时，使核苷酸序 列适应给定物种，即密码子使用的适应以优化在给定物种中的表达，在今天也是常识，并且 同样可免费获取的网站工具是可获得的，例如在http://www. kazusa. or. jp/codon/或例 如http://genomes, urv. es/OPTIMIZER/(超过150个原核生物物种）上的密码子使用数据 库。
[0062] 上述抗体、抗原结合片段或编码其中任一种的核酸中的任一种均预期用作药剂。 此类用途可以是单一使用（单一疗法）或与另外的治疗剂组合使用（组合疗法）。为此，上 述抗体、抗原结合片段或编码其中任一种的核酸中的至少一种可在药物组合物中配制，所 述药物组合物还可包含药学可接受的载体和任选的另外的治疗剂。
[0063] 以无论何种形式或制剂的上述抗体、抗原结合片段或编码其中任一种的核酸中的 任一种均可制备为试剂盒的一部分。通常，此类试剂盒可含有另一种组分或其他组分，其中 并非全部都需要是药物组合物。非药物组分可以例如是含有关于上述抗体、抗原结合片段 或编码其中任一种的核酸的信息的传单。试剂盒还可包括组合疗法的不同活性物质（参见 下文）。
[0064] 所述药剂预期用于例如预防、抑制或治疗良性肿瘤、恶化前肿瘤或恶性肿瘤、眼科 障碍和特征在于新生血管形成的障碍。
[0065] "癌症"指恶性赘生性肿瘤，并且包括癌（在皮肤或者衬里或覆盖内脏的组织中开 始；包括皮肤癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和卵巢癌，以及上皮细胞癌、鳞状细胞癌和基底细胞 癌、黑素瘤、乳头状瘤和腺瘤）；肉瘤（在骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或者其他结缔组织或支 持组织中开始；包括骨癌和软组织癌以及骨肉瘤、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉 瘤和纤维肉瘤）、白血病（在血液形成组织例如骨髓中开始并促使大量异常血细胞产生并 进入血液；包括白血病、成淋巴细胞白血病（ALL和CLL)、髓性白血病（AML和CML)、T细胞 白血病和多毛细胞性白血病）、淋巴瘤和骨髓瘤（在免疫系统的细胞中开始；包括淋巴瘤、T 细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤和淋巴组织增生淋巴瘤）、中枢 神经系统癌症（在脑和脊髓的组织中开始；包括脑肿瘤和脊髓肿瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤、 垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤和原始神经外胚瘤）和转移性癌（通常起于上 文列出的细胞类型并且目前存在于癌细胞最初未发展的组织中）。癌症的特定例子是不表 达雌激素受体（ER)、孕酮受体（PR)或Her2/neU)的基因的三重阴性乳腺癌。
[0066] "眼科障碍"包括糖尿病视网膜病变（非增殖性或增殖性）、年龄相关性黄斑水肿、 虹膜发红（在虹膜中新的异常血管生长）、脉络膜新生血管形成（CNV ;眼的脉络膜层中的新 血管生长）、退化性黄斑病变、角膜新生血管形成、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病变、 玻璃体增生综合症。
[0067] 特征在于新生血管形成、新生血管生成或病理性血管生成（全部可互换使用） 的障碍指特征在于不寻常部位中的新血管形成（毛细管向内生长和内皮增殖）的障碍或 疾病，所谓的"血管生成疾病"的典型发现。特征在于新生血管形成的障碍的广泛列表在 Carmeliet 2003(Nature Medicine 9,653-660)的表1中给出，并且除肿瘤和眼科障碍之 外还包括：传染病、自身免疫障碍、血管畸形、迪格奥尔格综合征（DiGeorge syndrome)、 HHT、海绵状血管瘤、动脉粥样硬化、移植动脉病变、肥胖、牛皮癣、疣、变应性皮炎、瘢痕疙 瘩、化脓性肉芽肿、起泡性疾病、肺动脉高压、哮喘、鼻息肉、炎性肠病和牙周病、腹水、腹膜 粘连、子宫内膜异位症、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢过度刺激、关节炎、滑膜炎、骨髓炎和骨赘 形成。
[0068] 如本文使用的术语"组合疗法"指任何类型的组合。如果技术上可行和临床上有意 义，则两种或更多种不同活性物质，一种是根据本发明的抗TOGF-C抗体或其片段或编码其 中任一种的核酸，可在单一药剂或制剂中组合。作为另外一种选择，两种或更多种不同的活 性物质作为在开出的给药方案中待施用于患者的个别药剂提供（其中不含根据本发明的 抗TOGF-C抗体或其片段或编码其中任一种的核酸的药剂仍可以是两种或更多种其他活性 物质的组合），所述给药方案可涉及序贯和/或同时施用。很可能需要其他活性物质的多重 施用，所述其他活性物质之一可与根据本发明的抗TOGF-C抗体或其片段或编码其中任一 种的核酸的施用同时。如果所述其他活性物质的药物代谢动力学完全不同于根据本发明的 抗TOGF-C抗体或其片段或编码其中任一种的核酸的药物代谢动力学，可尤其是这种情况。 抗体例如事实上具有在它们具有相对长半衰期的意义上的有利药物代谢动力学的优点。两 种药剂的序贯施用意指根据本发明的抗TOGF-C抗体或其片段或编码其中任一种的核酸的 施用在其他活性物质或药剂的至少一次施用之前或之后。明确的是，上述中的任一种还应 用于其中需要根据本发明的抗TOGF-C抗体或其片段或编码其中任一种的核酸的多重施用 的情况。
[0069] 另外的活性物质或试剂可以是本领域公认为可用于预防、抑制或治疗预期疾病或 障碍的任何试剂。一般而言，另外的活性物质或试剂可以例如是化学试剂（例如靶向酶或 蛋白质、DNA或RNA，包括合成适体、siRNA、反义RNA等等）或化学治疗剂（例如一般的细胞 生长抑制剂或细胞毒素剂）、生物试剂（例如抗体或其片段或基于蛋白质支架的分子）、抗 炎剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、抗组胺药、麻醉剂、诱导 瞳孔散大的试剂和诱导睫状肌麻痹的试剂。另外的活性物质或试剂还可以是照射疗法（例 如在一些癌症的治疗中）或激光疗法（例如在一些眼疾病的治疗中）。
[0070] 抗血管生成剂的例子包括抗体（或其片段）例如抗VEGF(血管内皮生长因子） 或抗PlGF (胎盘生长因子）抗体和试剂，例如macugen (哌加他尼钠），色氨酰tRNA合成酶 (TrpRS)，乙酸阿奈可他，康普瑞汀A4前体药物，AdPEDF(能够表达源自色素上皮的因子的 腺病毒载体），VEGF受体-2抑制剂，VEGF、PlGF或TGF- P抑制剂，西罗莫司（雷伯霉素） 和内皮他丁。
[0071] 批准用于治疗癌症或眼科障碍的生物试剂的例子包括贝伐珠单抗（抗VEGF)、雷 珠单抗（抗VEGF)、阿柏西普（或VEGF阱-眼）、利妥昔单抗和替伊莫单抗（抗CD20)、曲妥 珠单抗（抗Her2)、吉姆单抗奥唑米星（抗CD33)和阿仑珠单抗（抗CD52)。
[0072] 可用于治疗癌症的化学治疗剂的例子包括烷基化剂例如噻替派和环磷酰 胺（CYTOXAN?);烷基磺酸盐例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶例如苯佐替派 (benzodopa)、卡波醌、美妥替哌（meturedopa)和乌瑞替派（uredopa);乙烯亚胺和甲基 三聚氰胺（methylamelamine)包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙 基硫代磷酰胺和三轻甲基蜜胺（trimethylolomelamine);乙酸配质（acetogenin)(例 如布拉它辛和布拉它辛酮）；喜树碱（包括合成类似物托泊替康）；苔藓抑素；海绵聚酮 (callystatin) ;CC_1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物）；隐藻素（特 别是隐藻素 I和隐藻素8);多拉司他汀；多卡米星（包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI); 艾槽塞洛素（eleutherobin);水鬼蕉碱（pancratistatin) ;sarcodictyin;海绵抑制素； 氮芥（nitrogen mustard)例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺（cholophosphamide)、雌莫 司汀、异环磷酰胺、氮芥（mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、 泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司 汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类例如烯二炔抗生素类（例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素 Y I1 和卡奇霉素 Q I1 (例如 Nicolaou 等人 1994, Angew Chem Intl Ed Engl 33,183-186); 达内霉素（dynemicin)包括达内霉素 A ;埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色 蛋白烯二炔抗生素生色团）、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素（authramycin)、偶氮丝氨 酸、博来霉素、放线菌素 C(cactinomycin)、卡柔比星（carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、 色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星（包 括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星）、 表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛 霉素、泊非霉素（potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结 核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶（5-FU); 叶酸类似物例如二甲叶酸、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪 嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双 脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU;雄激素类例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、 环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂例 如亚叶酸（frolinic acid);乙葡醒内酯；醒磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖陡；贝他 布昔（bestrabucil);比生群；依达曲沙（edatraxate);地磷酰胺（defofamine);秋水仙 胺；地吖醌；依氟鸟氨酸（elfornithine);依利乙铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基 脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类例如美坦生和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达 醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；批柔比星；鬼日酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK?; 雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2, 2'，2〃-三氯三乙胺；单 端孢霉烯类（尤其是T-2毒素 、verracurin A、杆孢菌素 A和蛇形菌素）；乌拉坦；长春 地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烧；gacytosine ;阿糖 胞苷（"Ara-C"）；环磷酰胺；紫杉烧例如紫杉醇（TAXOL ? Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)和多西紫杉醇（TAXOTERE?，Rhone-Poulenc Rorer, Antony, 法国）；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；钼类似物例如顺钼和卡钼；长春碱； 钼；依托泊苷（VP-16);异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替 尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11 ;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ; 二氟甲基鸟氨酸（DMFO);维甲酸；卡培他滨；以及上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生 物。还包括的是作用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，例如抗雌激素药，包括例 如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、盐酸雷洛 昔芬（keoxifene)、LY117018,奥那司酮和托瑞米芬（法乐通）；以及抗雄激素药，例如氟他 胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍 生物。
[0073] 抗炎剂的例子包括甾体抗炎剂（例如泼尼松龙、甲基泼尼松龙、可的松、氢 化可的松、泼尼松、曲安西龙、地塞米松）和非留体抗炎剂（NSAID ;例如乙酰胺苯酚 (acetaminophren)、布洛芬、阿司匹林）。
[0074] 抗病毒剂的例子包括曲氟尿苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦和去氧 尿苷。
[0075] 抗菌剂或抗生素的例子包括氨节青霉素、青霉素、四环素、土霉素、新霉素 b、加替 沙星、庆大霉素、妥布霉素、杆困肤、新霉素和多粘困素。
[0076] 抗霉菌剂/抑制真菌剂/抗真菌剂的例子包括氟康唑、两性霉素、克霉唑、益康唑、 伊曲康唑、咪康唑、5-氟胞嘧啶、酮康唑和纳他霉素。
[0077] 抗有丝分裂剂的例子包括丝裂霉素 C和5-氟尿嘧啶。
[0078] 抗组胺药的例子包括酮替芬延胡索酸酯和马来酸非尼拉敏。
[0079] 麻醉剂的例子包括苯佐卡因、氨苯丁酯、地布卡因、利多卡因、奥布卡因、普莫卡 因、丙对卡因、丙美卡因、丁卡因和阿美索卡因。
[0080] 对于眼科应用或用途，其他辅助试剂或药物可与根据本发明的抗roGF-c抗体或 其片段或编码其中任一种的核酸结合使用，包括诱导瞳孔散大/瞳孔扩大的试剂（例如东 莨菪碱、阿托品或托吡卡胺）和/或诱导睫状肌麻痹（眼聚焦肌肉的麻痹）的试剂。在眼 科背景下还可能需要润滑剂，此种包括丙二醇、甘油、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、大 豆卵磷脂、聚乙烯醇、白凡士林、矿物油、聚维酮、卡波普980、聚山梨醇酯80和右旋糖酐70。 此外，根据本发明的抗TOGF-C抗体或其片段或编码其中任一种的核酸可与能够诱导玻璃 体后脱离（PVD)的试剂组合使用。眼新生血管生成的抑制事实上已显示在诱导PVD后更有 效（Lee和Koh 2011，Ophthalmology 118, 101-110)。能够诱导PVD的试剂包括纤溶酶和微 纤溶酶（US 5, 304, 118 ;W02004/052228)。
[0081] 在治疗或抑制新生血管性青光眼的情况下，用于控制眼内压的试剂还可与根据本 发明的抗roGF-c抗体或其片段或编码其中任一种的核酸结合使用。此类药剂包括肾上腺 素能阻滞剂阻滞剂或交感神经阻滞药例如倍他洛尔、卡替洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔 和噻吗洛尔）、肾上腺素能刺激药物（拟交感神经药例如安普乐定、肾上腺素、羟苯丙胺、苯 肾上腺素、萘甲唑啉和四氢唑啉）、碳酸酐酶抑制剂（例如全身乙酰唑胺以及局部布林佐胺 和多佐胺）、缩瞳药（胆碱能刺激剂，拟副交感神经药例如卡巴胆碱和匹鲁卡品）、渗透剂 (例如甘油和甘露醇）、前列腺素和前列腺素类似物（前列腺酰胺、比马前列素、异丙基乌诺 前列酮、曲伏前列素、拉坦前列素、天然前列腺素、前列腺素 F2 a和FP前列腺素类受体激动 剂）。
[0082] 根据本发明的抗roGF-c抗体或其片段或编码其中任一种的核酸可用于制造药 齐IJ。因此，活性物质可能需要被配制成"药学可接受的制剂"。此类制剂一般是包含与待 配制的一种或多种活性成分相容的载体、稀释剂或佐剂的组合物，整个制剂与预期组织或 器官等中的预期用途相容。药学可接受的制剂的例子以及用于制备其的方法可例如在 RemingtonJ s Pharmaceutical Sciences (例如第 20 版；Lippincott, Williams&Wilkins， 2000)或任何药典手册（例如美国药典、欧洲药典或国际药典）中找到。
[0083] "稀释剂、载体或佐剂"是任何合适的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂，其单独不诱 导产生对接受组合物的个体有害的抗体。通常，药学可接受的化合物（例如稀释剂、载体和 佐剂）可例如在药典手册（例如美国药典、欧洲药典或国际药典）中找到。
[0084] "稀释剂"或更具体地"药学可接受的稀释剂"包括稀释剂例如水、盐水、生理学盐 溶液、甘油、乙醇等。辅助物质例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质、防腐剂可包括在此类稀 释剂中。
[0085] 例如通过提供根据本发明的抗体或其片段经过延长时间段的持续释放（缓慢释 放制剂），（药学可接受的）载体或佐剂可增强通过根据本发明的抗体或其片段引发的应 答。术语"佐剂"通常指药理学或免疫学试剂，所述药理学或免疫学试剂修饰（优选增加） 其他试剂（例如药物、疫苗）的效应，同时具有更少的当单独给予时的直接效应（如果存 在的话）。作为佐剂的一个例子，给出本发明的活性化合物或成分可与之吸附的氢氧化铝 (明矾）。此外，许多其他佐剂是本领域已知的，并且可使用。术语"药学可接受的载体"意 指活性成分与之一起配制的任何材料或物质，以便例如通过使所述组合物溶解、分散或扩 散，促进其对待治疗部位的施加或散布，和/或促进其贮存、转运或处理，而不损害其有效 性。它们可包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂（例如山梨酸或三氯 叔丁醇）、等渗剂（例如糖或氯化钠）等等，条件是这些与药学实践一致，即载体和添加剂不 产生对接受载体的受试者的永久性损伤。可包括另外的成分，以便控制组合物中的活性成 分的作用持续时间。药学可接受的载体可以是已压缩用于形成液体的固体或液体或气体， 即本发明的组合物可适当地用作浓缩剂、乳状剂、溶液、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、气溶胶、悬浮 液、软膏、乳膏、片剂、丸剂或粉末。用于所述药物组合物及其制剂中的合适的药学载体是本 领域技术人员众所周知的，并且对其在本发明内的选择不存在具体限制。本发明的药物组 合物可以任何已知方式制备，例如通过在一步或多步操作中使活性成分与所选载体材料和 (适当的）其他添加剂例如表面活性试剂均匀混合、涂布和/或磨碎。它们还可通过微粉化 进行制备，例如以便获得以通常具有约1至10 y m直径的微球体形式的制剂，即用于制造活 性成分的控制释放或持续释放的微胶囊。
[0086] 根据本发明的药剂可制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。注射可以是皮下、 肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、真皮内、表皮内的。在对眼的局部施用的情况下，可进 行玻璃体内注射、注射到前房内或结膜下注射。该组合物还可进行制备，以使得它适合于其 他类型的施用，例如植入、栓剂、经口摄取、肠应用、吸入、气溶胶化、滴眼剂、鼻腔喷雾剂或 滴鼻剂、或通过医疗装置例如支架的施用。还可制备适合于在注射前在液体媒介物中溶解 或悬浮的固体形式。该制剂还可在脂质体中乳化或封装用于增强其效应。该制剂可作为推 注剂量或通过连续输注施用于受试者。该制剂还可例如经由渗透微型泵连续施用。
[0087] 为了治疗、预防或抑制预期疾病或障碍的目的，以及在用于治疗、预防或抑制预期 疾病或障碍的方法中，将有效量的根据本发明的抗TOGF-C抗体或其片段或编码其中任一 种的核酸施用于有此需要的受试者。组合物中活性物质的"有效量"是在预防或治疗或减 少预期或靶向医学适应症中所需并足以引发足够应答的所述物质的量。对于技术人员明确 的是，此类应答可能需要组合物的相继（按时）施用作为施用方案或时间表的一部分。有 效量可取决于下述而变：待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄（例如对于婴 儿的给药可低于对于成人的）、待治疗个体的分类群（例如人、非人灵长类动物、灵长类动 物等）、个体的系统有效响应的能力、所需应答的程度、活性物质的制剂、主治医师的评价及 其他相关因子。有效量还可取决于它是在单一疗法中还是在组合疗法中使用而变。预期本 发明的活性物质（抗TOGF-C抗体或其片段或其衍生物或编码其中任一种的核酸）的有效 量将落入可通过例行试验测定的相对广泛的范围内。通常，该量将从〇. 01到1000 U g/剂 量不等，更特别地从〇. 1到100 U g/剂量不等。作为另外一种选择，活性物质可以I U g/kg 体重至l〇mg/kg体重、或10 y g/kg体重至5mg/kg体重、或100 y g/kg体重至2mg/kg体重 的剂量施用。剂量治疗可以是单剂量时间表或多剂量时间表。如果活性物质连续施用，则 施用的剂量可以为1至100 U g/kg/分钟、1至50 ii g/kg/分钟、5至50 ii g/kg/分钟、或5 至 20 ii g/kg/ 分钟。
[0088] (有效量的）根据本发明的抗roGF-c抗体或其片段或编码其中任一种的核酸的预 防施用可用于例如眼科背景下。事实上，在响应用根据本发明的抗roGF-c抗体或其片段或 编码其中任一种的核酸治疗的眼科疾病或障碍的情况下，受试者可患有在单只眼中的此类 疾病或障碍。然而，本领域已知在此类情况下，相同受试者的另一只眼对发展相同疾病或障 碍敏感。在此类情况下，未受累的眼可用根据本发明的抗roGF-c抗体或其片段或编码其中 任一种的核酸进行预防治疗。
[0089] "治疗"指与未经治疗时疾病或障碍的进展或预期进展相比较，疾病或障碍进展的 任何减少或迟缓速率。更希望地，治疗导致疾病或障碍的无/零进展（即"抑制"）或者甚 至导致已发展的疾病或障碍的任何消退速率。
[0090] 本发明还涉及用作诊断工具的根据本发明的抗体或其片段或其中任一种的衍生 物。其中可使用根据本发明的抗体（或其中任一种的片段或衍生物）的一种示例性诊断方 法是检测怀疑为肿瘤细胞的分离的细胞（例如通过例如活组织检查分离的）中的I 3DGF-C 蛋白质。在分离的细胞中roGF-c的存在（尤其是如果过表达的话）随后可用作在用于根 除肿瘤细胞的治疗中施加抗roGF-c抗体的标准。
[0091] 编码根据本发明的抗roGF-c抗体或其片段的分离的核酸可包含在重组载体特别 是表达载体中。
[0092] 本发明的进一步方面涉及表达根据本发明的抗roGF-c抗体或其片段的分离 的细胞系或重组宿主细胞。所述宿主细胞可以是能够表达所述抗体或其片段的任何 细胞。合适的宿主细胞包括但不限于培养的哺乳动物细胞（例如J1EK293)或昆虫细 胞、培养的植物细胞或转基因植物、酵母例如酵母菌属（Saccharomyces)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属（Pichia)、汉逊酵母属（Hansenula)、球拟酵母属 (Torulopsis)和细菌细胞。本发明抗体或其功能等价片段的表达可以是瞬时或组成型的。 特别地，宿主细胞是杂交瘤细胞系例如上文描述的细胞系。
[0093] 本发明的另一个方面涵盖表达本发明抗体的杂交瘤细胞系，特别是具有下述 生物保藏登记号中的任一个的杂交瘤细胞系：LMBP 9483CB (抗TOGF-C抗体2D3)、LMBP 9484CB (抗 PDGF-C 抗体 5A2)、LMBP M85CB (抗 PDGF-C 抗体 5H7)、LMBP M86CB (抗 TOGF-C抗体16B1)或LMBP9487CB (抗TOGF-C抗体29H1)。这些保藏根据布达佩斯条 约条款于2012年3月15日在比利时微生物协作保藏中心/分子生物学实验室质粒 保藏中心(Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms/Laboratory of Molecular Biology-Plasmid collection) (BCCM/LMBP),Technologiepark 927, 9052Gent (Zwijnaarde)，比利时完成。
[0094] 产生上述I3DGF-C结合抗体或其抗原结合片段的方法构成本发明的整体方面。特 别地，此类方法可包括下述步骤：
[0095] (i)借助于所述抗体或抗体片段的重组表达，或者借助于所述抗体或抗体片段的 化学合成，获得所述抗体或抗体片段的粗制备物；
[0096] (ii)从（i)中获得的粗制备物中纯化所述抗体或抗体片段。
[0097] 作为另外一种选择，与TOGF-C结合的本发明抗体的抗原结合片段可通过包括下 述步骤的方法获得或产生：
[0098] (i)借助于所述抗体的重组表达，或借助于所述抗体的化学合成，获得包含所述片 段的抗体的粗制备物；
[0099] (ii)从⑴中获得的粗制备物中纯化所述抗体。
[0100] (iii)从（ii)中纯化的抗体中分离抗原结合片段。
[0101] 实例
[0102] 下文包括的实例证实本发明并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
[0103] 实例1.用TOGF-C免疫接种以及杂交瘤生成和选择。
[0104] 雌性Balb/c小鼠用重组人TOGF-C进行免疫接种（2次抗原皮下注射，各50 iig，第 一次在完全弗氏佐剂中，第二次在不完全弗氏佐剂中）。
[0105] 从小鼠尾部收集血样，并且通过ELISA就抗人TOGF-C抗体的存在测试血清。简 言之，将96孔ELISA板用在PBS中的I ii g/ml人TOGF-C涂布过夜（100 iil/孔，4°C )。板 用1% BSA在室温下封闭1小时，将血清样品（100 iil/孔）加入板中（以范围为1/500至 1/32000的稀释度），并且允许抗体在室温下结合2小时。结合的抗体用HRP标记的山羊抗 鼠 IgG (Sigma，100 iil/孔，在室温下1小时）进行检测，随后与OPD反应。
[0106] 在第二次皮下注射后九个月，小鼠接受在不完全弗氏佐剂中的50i! g抗原的 第三次皮下注射，并且在第三次皮下注射后7周，小鼠接受在盐水缓冲液中的50 y g抗 原的末次i.P.注射，并且进行融合。将小鼠处死，并且根据Galfr6&Milstein(Methods Enzymol. 73, 3-46, 1981)的操作，使脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。在HAT (次黄嘌呤、氨 基蝶呤、胸苷）培养基中选择后，通过经由如上所述的ELISA筛选培养上清液来选择阳性克 隆。
[0107] 将阳性克隆扩增，并且通过蛋白A色谱法纯化抗体以允许进一步表征。
[0108] 实例2.编码鼠单克隆抗TOGF-C抗体的Vh和 '链的cDNA克隆
[0109] 使用来自Qiagen (Venlo,荷兰）的RNeasy Mini Kit,从5-10x IO6个杂交瘤细胞 中分离 RNA，并且使用来自 Qiagen (Venlo,荷兰）的 QuantiTect Reverse Transcription Kit制备cDNA。用分别对于前导序列和恒定区特异性的引物进行PCR。因此，可变区包含在 PCR产物中，但不包括引物序列。如表1中给出的引物组合用于杂交瘤2D3、5A2、5H7、16B1、 29H1中的每一种。
[0110] 表1.用于扩增轻链和重链可变区编码cDNA的PCR引物组合
【权利要求】
1. 一种分离的单克隆抗体，所述分离的单克隆抗体与抗原I3DGF-C结合，抑制roGF-c与 I3DGFRa的结合，并且抑制通过TOGF-C的I3DGFRa活化。
2. 根据权利要求1所述的分离的抗体，所述分离的抗体与通过SEQ ID N0:96限定的肽 结合。
3. 根据权利要求1或2所述的分离的抗体，所述分离的抗体的进一步特征在于它包含 下述互补决定区（CDR)氨基酸序列组合中的一种： (i) 分别具有SEQ ID N0:26、24和25中限定的氨基酸序列的轻链⑶Rl至3;以及分别 具有SEQ ID NO:35至37中限定的氨基酸序列的重链⑶Rl至3 ; (ii) 具有SEQ ID NO:22或23中限定的氨基酸序列的轻链⑶R 1;分别具有SEQ ID NO:24和25中限定的氨基酸序列的轻链⑶R 2和3 ;具有SEQ ID NO:27或28中限定的氨 基酸序列的重链⑶R 1;具有SEQ ID N0:29、30或31中限定的氨基酸序列的重链⑶R 2;以 及具有SEQ ID NO:32、33或34中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ; (iii) 分别具有SEQ ID NO: 22、24和25中限定的氨基酸序列的轻链CDR 1至3 ;具有 SEQ ID N0:27中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1;具有SEQ ID N0:29或30中限定的氨基 酸序列的重链⑶R 2 ;以及具有SEQ ID NO: 32或33中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ; (iv) 分别具有SEQ ID NO:23至25中限定的氨基酸序列的轻链⑶R 1至3 ;具有SEQ ID N0:28中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1 ;具有SEQ ID N0:31中限定的氨基酸序列的重 链⑶R 2 ;以及具有SEQ ID N0:34中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ; (V)分别具有SEQ ID N0:38、24和25中限定的氨基酸序列的轻链CDRl至3 ;具有SEQ ID NO: 27中限定的氨基酸序列的重链⑶R 1 ;具有SEQ ID NO: 30中限定的氨基酸序列的重 链⑶R 2 ;以及具有SEQ ID N0:33中限定的氨基酸序列的重链⑶R 3 ;或 (vi)⑴至（V)中任一种的亲和力成熟的抗体。
4. 根据权利要求1或3所述的抗体，所述抗体是哺乳动物抗体、人抗体或人源化抗体。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，所述抗体是单价抗体或多价抗体，进一步 是单特异性或多特异性的，条件是与所述抗原的结合特异性得到维持。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的抗体的抗原结合片段。
7. -种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1-5所述的抗体或编码根据权 利要求6所述的抗原结合片段。
8. 用作药剂的根据权利要求1-5所述的抗体、根据权利要求6所述的抗原结合片段或 根据权利要求7所述的核酸。
9. 用作与另外的治疗剂组合的药剂的根据权利要求1-5所述的抗体、根据权利要求6 所述的抗原结合片段或根据权利要求7所述的核酸。
10. -种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-5所述的抗体、根据权利要 求6所述的抗原结合片段或根据权利要求7所述的核酸中的至少一种，并且还包含药学可 接受的稀释剂、载体或佐剂中的至少一种。
11. 根据权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物还包含另外的治疗剂。
12. 用于治疗或抑制良性肿瘤、恶化前肿瘤或恶性肿瘤的根据权利要求1-5所述的抗 体、根据权利要求6所述的抗原结合片段或根据权利要求7所述的核酸。
13. 用于预防、治疗或抑制眼科障碍的根据权利要求1-5所述的抗体、根据权利要求6 所述的抗原结合片段或根据权利要求7所述的核酸。
14. 用于预防、治疗或抑制特征在于新生血管形成的障碍的根据权利要求1-5所述的 抗体、根据权利要求6所述的抗原结合片段或根据权利要求7所述的核酸。
15. 用作药剂的根据权利要求1-5所述的抗体、根据权利要求6所述的抗原结合片段或 根据权利要求7所述的核酸，所述药剂是具有另外的治疗剂的组合疗法的一部分。
16. -种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据权利要求7所述的分离的核 酸。
17. -种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞表达根据权利要求1-5所述的抗体或 根据权利要求6所述的抗原结合片段。
18. -种产生根据权利要求1-5所述的抗体或根据权利要求6所述的抗原结合片段的 方法，所述方法包括下述步骤： (i) 借助于所述抗体或抗体片段的重组表达，或者借助于所述抗体或抗体片段的化学 合成，获得所述抗体或抗体片段的粗制备物； (ii) 从（i)中获得的所述粗制备物中纯化所述抗体或抗体片段。
19. 一种产生根据权利要求1-5所述的抗体或根据权利要求6所述的抗原结合片段的 方法，所述方法包括下述步骤： (i) 借助于所述抗体的重组表达，或借助于所述抗体的化学合成，获得包含所述片段的 抗体的粗制备物； (ii) 从（i)中获得的所述粗制备物中纯化所述抗体； (iii) 从（ii)中纯化的所述抗体中分离所述抗原结合片段。
20. -种根据权利要求1-5所述的抗体或根据权利要求6所述的抗原结合片段的衍生 物。
21. 根据权利要求1-5所述的抗体、根据权利要求6所述的抗原结合片段或根据权利要 求7所述的核酸在药剂制造中的用途。
22. 根据权利要求4所述的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段包含下述 中的至少一种： (i) 携带在所述CDR外的区域中的最多至16个突变，如SEQ ID NO: 18至21中的任何 一个中给出的可变重链； (ii) 携带在所述⑶R外的区域中的最多至9个突变，如SEQ ID NO: 14至17中的任何 一个中给出的可变轻链； (iii) 携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID N0:18中给出的可变重链：Val5Leu、 AsplOGly> Lysl3Gln> Lysl9Arg> Asp42Gly> Arg44Gly> Ser74Asn> Ser84Asn> Lys87Arg> Ser88Ala、Met93Val 和 / 或 ThrlHLeu ; (iv) 携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID N0:20中给出的可变重链：Val5Leu、 AsplOGly> Lysl3Gln> Lysl9Arg> Asp42Gly> Arg44Gly> Phe80Tyr> Ser84Asn> Lys87Arg> Ser88Ala、Ile93Val、Val97Ala和 / 或ThrlHLeu ; (V)携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID N0:21中给出的可变重链：Val5Leu、 AsplOGly、Lysl3Gln、Lysl9Arg、Asp42Gly、Arg44Gly、Ser74Asn、Ser77Asn、Ser84Asn、 Ser88Ala、Ile93Val 和 / 或 ThrlHLeu ; (Vi)携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID N0:15中给出的可变轻链：Leu3Val、 Thr7Ser、Serl4Thr、Aspl7Gln、Glnl8Pro、Lys50Arg、Leu88Val 和 / 或 Glyl05Gln ; (vii) 携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID N0:16中给出的可变轻链：Leu3Val、 Thr7Ser、Serl4Th;r、Aspl7Gln、Glnl8P;ro、Ala45P;ro、Lys50Arg、Leu88Val 和 / 或 Glyl05Gln ; 或 (viii) 携带下述突变中的一个或多个，如SEQ ID N0:17中给出的可变轻链：Leu3Val、 Thr7Ser、Serl4Th;r、Aspl7Gln、Glnl8P;ro、Asn50Arg、Leu88Val 和 / 或Glyl05Gln。
23. 根据权利要求22所述的人源化抗体或其片段，或其片段，所述人源化抗体或其片 段包含通过SEQ ID NO: 102限定的可变重链和如通过SEQ ID NO: 103限定的可变轻链。
24. 根据权利要求22所述的人源化抗体或其片段，或其片段，所述人源化抗体或其片 段包含通过SEQ ID NO: 104限定的可变重链和如通过SEQ ID NO: 105限定的可变轻链。
25. 根据权利要求22所述的人源化抗体或其片段，或其片段，所述人源化抗体或其片 段包含通过SEQ ID NO: 106限定的可变重链和如通过SEQ ID NO: 107限定的可变轻链。
26. 根据权利要求1-5所述的抗体或根据权利要求6所述的抗原结合片段，所述抗体或 抗原结合片段以特征在于10 nM或更低的解离常数的高亲和力与TOGF-C结合。
27. 根据权利要求17所述的分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞是作为LMBP 9483CB (抗 PDGF-C 抗体 2D3)、LMBP 9484CB (抗 PDGF-C 抗体 5A2)、LMBP 9485CB (抗 PDGF-C 抗体 5H7)、LMBP 9486CB (抗 PDGF-C 抗体 16B1)或 LMBP 9487CB (抗 PDGF-C 抗体 29H1)保 藏的杂交瘤细胞。
【文档编号】A61P35/00GK104321343SQ201380021028
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2012年4月24日
【发明者】C·弗罗蒙德, H·T·恩戈, R·瓦尔, S·诺特巴尔特 申请人:斯鲁姆博詹尼克斯公司