灭菌组合物的制作方法

灭菌组合物的制作方法
【专利摘要】一种经过了放射线灭菌的灭菌组合物，其含有蛋白质和含有该蛋白质的脂肪族聚酯。该灭菌组合物中，蛋白质的结构、机能(活性)得以维持。
【专利说明】
灭菌组合物

【技术领域】
[0001]本发明涉及通过包含于脂肪族聚酯而保持机能的蛋白质的灭菌组合物。

【背景技术】
[0002]近年来，天然和合成蛋白质作为药物其重要性增大。另外，用于医疗用途的情况下，必须对产品进行灭菌。作为灭菌方法，已知有利用高压釜的加热灭菌、利用Y射线、电子束的电离放射线灭菌、利用环氧乙烷气体的气体灭菌、利用过氧化氢的等离子体灭菌、使用戊二醛制剂而得的化学灭菌剂以及使用过滤器而成的分离灭菌等。但是，生理活性蛋白质等蛋白质由于利用热、放射线进行灭菌而活性降低。对于利用环氧乙烷的灭菌，不仅有可能由于化学反应而生成副产物，而且毒性强、残留气体有可能对人体等造成不良影响。对于利用化学灭菌剂的灭菌，存在需要考虑到蛋白质对于灭菌剂的耐发性、PH的变化、离子强度的变化或温度变化等问题。因此，制造含有、固定了蛋白质的药品、医疗品的情况的现状是，必须使制造工艺全部形成无菌状态来进行制造，需要巨大的制造成本。
[0003]另外，含有蛋白质的溶液通过过滤器来分离灭菌，但是难以适用于含有大的颗粒的组合物、或者固体或半固体组合物。
[0004]EP0437095号中公开了可以通过Y射线照射来对与肝素或肝素片段复合的中和氧化纤维素产物(nORC)进行灭菌。但是，该文献中没有公开对结合有蛋白质的ORC或n-ORC进行灭菌。
[0005]EP0562864号中公开了含有胶原海绵基质、第二生物体吸收性聚合物例如氧化再生纤维素(ORC)的分散纤维、和活性剂例如肽的复合创伤治疗物质。记载了活性剂可以含有于基质、生物体吸收性聚合物、或者它们两者中，可以将该复合海绵物质包装来进行灭菌。
[0006]US5730933号中公开了通过Y射线或电子束照射对生物学上活性的肽在不使其生物活性消失的情况下进行灭菌的方法。该方法是包括形成含有生物学上活性的肽和明胶等外来蛋白质的混合物、将该混合物冷冻或冷冻干燥、接着照射该混合物的工序的技术，记载了外来蛋白质的存在使肽稳定而防止肽的活性降低。
[0007]国际公开W02000/033893号记载了治疗肽，与选自由氧化再生纤维素、中和氧化再生纤维素和它们的混合物组成的组中的多糖的复合物。并且记载了在通过电离放射线进行灭菌之前，将肽与有效量的多糖一起制剂，由此即使通过电离放射线进行灭菌，肽治疗剂的生物学上的活性也不会消失而实现稳定化。
[0008]但是，这些文献没有暗示，脂肪族聚酯可以抑制通过电离放射线进行灭菌时产生的蛋白质的聚集等的结构变化、失活。
[0009]另一方面，日本特开2011-47089号公报中记载了酶活性优异的含有酶的纳米纤维的制造方法。该方法中，将含有酶和溶解于非水溶剂的聚合物的纺丝液通过静电纺丝法纺丝，形成酶前体纳米纤维后，赋予水并进行干燥。但是，该文献中没有关于对含有酶的纳米纤维进行灭菌的记载。


【发明内容】

[0010]本发明的目的在于，提供蛋白质的结构、机能得以维持的灭菌组合物。
[0011]本发明的发明人为了解决前述问题而进行深入研究，结果惊人地发现，通过将蛋白质含有在脂肪族聚酯中，可以抑制由于放射线灭菌所导致的蛋白质的结构变化、机能降低，以及在放射线灭菌后的保存所伴随的这些变化、降低中的任意一者或两者，从而完成了本发明。
[0012]S卩，本发明为一种经过了放射线灭菌的灭菌组合物，其含有蛋白质和含有该蛋白质的脂肪族聚酯。

【专利附图】

【附图说明】
[0013]图1将对于实施例1和2中得到的本发明的含有凝血酶的片状纤维成型体、实施例3中得到的本发明的含有凝血酶的膜、比较例I的含有凝血酶的颗粒以及比较例2中得到的对照含有凝血酶的片状纤维成型体各自测得的凝血酶活性以灭菌后的值和灭菌后保存一个月后的值相对于灭菌前的初始值的保持比率(保持率、％)示出。
[0014]图2对于未照射、灭菌后(OM)和灭菌后保存I个月后(IM)，示出对于实施例4中得到的本发明的含有纤维蛋白原的片状纤维成型体和比较例3的含有纤维蛋白原的颗粒各自测得的纤维蛋白原聚集体的量(%)。

【具体实施方式】
[0015]本发明为一种经过了放射线灭菌的灭菌组合物，其含有蛋白质和含有该蛋白质的脂肪族聚酯。
[0016]对本发明中使用的蛋白质没有特别限定。作为优选的蛋白质，可列举出例如，以纤维蛋白原、凝血酶为代表的止血性蛋白质；以天门冬酰胺酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶为代表的酶；以血红蛋白、血清白蛋白、低密度脂蛋白为代表的转运蛋白，以肌动蛋白、肌球蛋白为代表的肌肉蛋白质；以抗体、补体为代表的保护性蛋白；以白喉毒素、肉毒杆菌毒素、蛇毒为代表的毒蛋白；以胰岛素、生长因子、细胞因子为代表的蛋白激素；以卵白蛋白、铁蛋白为代表的储藏蛋白；以胶原蛋白、角蛋白为代表的结构蛋白；以表皮生长因子(Epidermal growth factor:EGF)、膜岛素样生长因子(Insulin-like growth factor:IGF)、转化生长因子(Transforming growth factor:TGF)、神经生长因子(Nerve growthfactor:NGF)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor:BDNF)、血管内皮细胞生长因子(Vesicular endothelial growth factor:VEGF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor:G_CSF)、粒细胞巨卩遼细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor:GM_CSF)、血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor:PDGF)、促红细胞生成素(Erythropoietin:EP0)、血小板生成素(Thrombopoietin:ΤΡ0)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor:bFGF 或 FGF2)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor:HGF)为代表的生长因子。其中，优选为酶、转运蛋白、肌肉蛋白质、保护性蛋白、毒蛋白、蛋白激素、储藏蛋白、结构蛋白、和生长因子。
[0017]本发明中使用的蛋白质可以源自动物或者通过基因重组技术制造。若源自动物则优选源自人类。另外，通过基因重组技术制作的蛋白质，若本质上的生物活性相同则可以为将氨基酸序列替代为另外的氨基酸序列而成的突变体。另外，也可以使用将这些蛋白质修饰而成的蛋白质以及它们的混合物。
[0018]另外，在本发明中使用的蛋白质中可以加入可药用的添加剂。作为这种添加剂的优选例子，可列举出选自由凝血第XIII因子、白蛋白、异亮氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、表面活性剂、氯化钠、糖醇(甘油、甘露醇等)、海藻糖、柠檬酸钠、抑肽酶和氯化钙组成的组中的一种以上。
[0019]本发明中使用的蛋白质或蛋白质和添加剂的混合物可以在脂肪族聚酯中各自以分子形式分散而存在，但是优选以各自分子聚集而成的颗粒(以下有时将与添加剂的混合颗粒包括在内记载为“蛋白质颗粒”)的形式分散而存在。
[0020]本发明中使用的脂肪族聚酯优选为生物体吸收性或生物降解性聚合物。作为生物吸收性聚合物的具体例，可例示出聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚乳酸-聚己内酯共聚物、聚癸二酸丙三醇酯、聚羟基脂肪酸酯(t F 口力>酸)、聚丁二酸丁二醇酯、以及它们的衍生物。
[0021]它们之中，优选选自由聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯、和它们的共聚物、以及它们的混合物组成的组，最优选为聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物。例如可以使用聚-L-乳酸和聚-D-乳酸的立构复合物。
[0022]另外，本发明中使用的脂肪族聚酯的分子量为1父103?5父106，优选为IXlO4?I X 106，更优选为5X104?5X105。另外，聚合物的末端结构、聚合聚合物的催化剂可以任意选择。
[0023]本发明的灭菌组合物中，在不损害其目的的范围内，可以组合使用其它聚合物、其它化合物。例如为聚合物共聚、聚合物共混、化合物混合。
[0024]本发明中使用的脂肪族聚酯优选纯度高，特别优选脂肪族聚酯中含有的添加剂、增塑剂、残留催化剂、残留单体、成型加工或后加工中使用的残留溶剂等残留物少。特别是用于医疗的情况下，需要抑制到低于安全性的基准值。
[0025]本发明中，“含有蛋白质”指的是蛋白质的至少一部分进入脂肪族聚酯内部的状态。是与蛋白质存在于组合物表面、组合物的空隙的利用冷冻干燥得到的复合物相区别的状态。
[0026]对于本发明的灭菌组合物的形状没有特别限定，可列举出例如纤维、膜、片、板状体、管状体、线状体、棒状体、缓冲材料、发泡体、多孔质体等。制造成型品时的成型方法只要为蛋白质的结构变化、活性降低得到抑制的方法即可，没有特别限制，例如可以采用挤出成型、注射成型、压延成型、压缩成型、吹塑成型、真空成型、粉末成型、流延成型、铸塑成型等适当的成型方法。其中，对于本发明的灭菌组合物而言，纤维和膜形状是合适的，制造它们时，也可以采用塑料纤维或膜制造中以往采用的任意的方法，可列举出例如吹胀挤出成型法、T模头挤出成型法等挤出成型法、压延法、流延法(铸塑法)等。前述成型可以通过熔融成型来进行，也可以通过溶液成型来进行，但是为了容易地分散蛋白质以防止蛋白质的机能降低，优选溶液成型。
[0027]在此，纤维形状指的是将所得到的一根或多根纤维层叠、机织、针织，或者通过其它手法形成的三维成型体。作为具体的纤维形态，可列举出例如非织造织物。进而，基于此加工而成的管、网状物等也包含于纤维形状中。
[0028]本发明的具有纤维形状的灭菌组合物的平均纤维直径例如为0.01?50 μ m，但是本领域技术人员可以根据使用目的而适当确定。
[0029]另外，本发明的具有纤维形状的灭菌组合物可以是长纤维的形式。长纤维具体而言指的是从纺丝开始起到加工为纤维成型体的工序中，不施加切断纤维的工序而形成的纤维，可以通过静电纺丝法、纺粘法、熔喷法等来形成。它们之中，优选使用静电纺丝法。
[0030]静电纺丝法是通过对溶解有聚合物的液体施加高电压、而在电极上得到纤维成型体的方法。作为工序，包括制造溶解有聚合物的纺丝液的工序、对该溶液施加高电压的工序、喷出该溶液的工序、由所喷出的溶液蒸发溶剂而形成纤维成型体的工序、作为可任选实施的工序的使所形成的纤维成型体的电荷消失的工序、和通过电荷消失而累积纤维成型体的工序。
[0031]以下以静电纺丝法为例，对本发明中具有纤维形状或非织造织物形状的灭菌组合物的制造方法进行说明。
[0032]对静电纺丝法中的制造纺丝液的阶段进行说明。对本发明中的纺丝液没有特别限定，例如可以使用包含脂肪族聚酯的有机溶剂溶液和蛋白质的水溶液的乳液、包含脂肪族聚酯的有机溶剂溶液和蛋白质颗粒的悬浮液、溶解有脂肪族聚酯和蛋白质的有机溶剂溶液，但是优选使用包含脂肪族聚酯的有机溶剂溶液和蛋白质颗粒的悬浮液。
[0033]脂肪族聚酯溶液中的脂肪族聚酯的浓度优选为I?30重量％。若脂肪族聚酯的浓度低于I重量％，则难以形成纤维成型体，所以不优选。另外，若高于30重量％，则所得到的纤维成型体的纤维直径增大，所以不优选。更优选的有机溶剂溶液中的脂肪族聚酯的浓度为2?20重量％。
[0034]脂肪族聚酯的溶剂只要是能够溶解脂肪族聚酯、在纺丝的阶段蒸发、能够形成纤维的溶剂即可，没有特别限定，可以单独使用一种也可以组合多种溶剂。可列举出例如氯仿、2-丙醇、甲苯、苯、苯甲醇、二氯甲烷、四氯化碳、环己烷、环己酮、三氯乙烷、甲基乙基酮、乙酸乙酯、以及它们的混合溶剂。另外，在形成乳液的范围内，可以含有丙酮、乙醇、甲醇、四氢呋喃、1，4-二B,惡烧、1-丙醇、苯酌.、卩比卩定、乙酸、甲酸、六氟-2-丙醇、六氟丙酮、N, N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、乙腈、N-甲基-2-吡咯烷酮、N-甲基吗啉-N-氧化物、1，3-二氧戊环等溶剂。它们之中，从操作性、物性的观点考虑，优选使用二氯甲烷、乙醇。
[0035]本发明中的蛋白质可以以固体、液体或溶液的任意状态添加、混合于脂肪族聚酯的有机溶剂溶液中。
[0036]本发明中，使用包含脂肪族聚酯的有机溶剂溶液和蛋白质的水溶液的乳液作为纺丝液的情况下，蛋白质的水性溶剂只要是能够溶解蛋白质、并且与脂肪族聚酯的有机溶剂溶液形成乳液、在纺丝的阶段蒸发、能够形成纤维的溶剂即可，没有特别限定。例如可以使用生理盐水、各种缓冲液。进而，可以加入蛋白质的稳定剂、添加剂。其中，优选使用磷酸缓冲液、生理盐水。
[0037]对本发明中使用的蛋白质的水溶液中的蛋白质的浓度没有特别限定，根据蛋白质的特性适当确定，例如为0.5?50重量％。
[0038]由脂肪族聚酯的有机溶剂溶液和蛋白质的水溶液制备乳液的情况下，作为两者的混合比例，只要可形成稳定的乳液即可，没有特别限定，例如(蛋白质的水溶液)/(脂肪族聚酯的有机溶剂溶液)(体积比)为1/100?1/2。若该值大于1/2则乳液不稳定，所以不优选。
[0039]作为将脂肪族聚酯的有机溶剂溶液和蛋白质的水溶液混合、制备乳液的方法，没有特别限定，可以使用超声波、各种搅拌方法。作为搅拌方法，可以使用均化器这样的高速搅拌、磨碎机、球磨机等搅拌方法。其中，优选为利用超声波处理的分散方法。
[0040]另外，也可以在通过有机溶剂和蛋白质的水溶液形成乳液后，添加脂肪族聚酯来制备纺丝液。
[0041]本发明中，使用包含脂肪族聚酯的有机溶剂溶液和蛋白质的悬浮液作为纺丝液的情况下，对蛋白质颗粒的尺寸没有特别限定，优选为0.01?10ym的范围。制作小于0.0lym的蛋白质颗粒在技术上是困难的，若大于100 μ m则分散性差、灭菌组合物变得脆弱，所以不优选。
[0042]作为将脂肪族聚酯的有机溶剂溶液和蛋白质颗粒混合、制备悬浮液的方法，没有特别限定，可以使用超声波、各种搅拌方法。作为搅拌方法，可以使用均化器这样的高速搅拌、磨碎机、球磨机等搅拌方法。其中，优选为利用超声波处理的分散方法。
[0043]另外，也可以在通过有机溶剂和蛋白质颗粒形成悬浮液后、添加脂肪族聚酯来制备纺丝液。
[0044]另外，在制备悬浮液之前可以对蛋白质颗粒进行微细处理。作为微细处理，有干式粉碎和湿式粉碎，本发明中，可以采用任意的方式，也可以将两者组合。
[0045]作为干式粉碎处理，可列举出例如使用了球磨机的处理，使用了行星式磨机、振动磨机的处理，使用研钵通过研磨棒进行研碎的处理，使用介质搅拌型粉碎机、喷射研磨机、石磨进行粉碎的处理等。
[0046]另一方面，作为湿式粉碎处理，可列举出以在适当的分散介质中分散蛋白质颗粒的状态，通过高剪切力的搅拌装置、混炼装置等进行搅拌的处理；分散于介质中的状态下的球磨机、珠磨机处理等。进而，也可以使用通过喷雾干燥器制作的蛋白质颗粒。
[0047]本发明中使用的灭菌方法为放射线灭菌。作为所使用的放射线，可列举出例如α射线、β射线、Y射线、中子射线、电子束和X射线。其中，优选为Y射线或电子束，最优选为电子束。对这些灭菌方法没有特别限定，作为放射线的照射量，为10?80kGy，优选为20?30kGy。作为温度条件，没有特别限定，为-80?40°C，优选为-80?30°C。
[0048]α射线、阳电子束、Y射线、中子射线、电子束、X射线等放射线若照射到物质，则由构成物质的分子、原子夺取电子。此时，分子键断裂，产生反应性高的自由基等，与周边物质二次性地化学反应。
[0049]熟知蛋白质容易由于放射线照射而失去机能(活性)。认为这是因为，由于照射而发生分子键断裂，作为机能表现的根源的“高级结构”被破坏。进而，如本申请说明书的比较例所示，蛋白质也会由于照射放射线后的保存而发生结构破坏、失活。但是，本发明中的脂肪族聚酯中含有的蛋白质即使照射放射线，结构破坏、机能降低也得到抑制，由于照射后的保存所导致的进一步的结构破坏、机能降低也得到抑制。这意味着本组合物中，性蛋白质的高级结构得到保持，无论蛋白质的种类如何，这是共通的效果。这种效果从所透过的脂肪族聚酯的厚度考虑，不认为是由于屏蔽实现的，其抑制机理尚不明确。
[0050]本发明中的放射线灭菌前的含有蛋白质的脂肪族聚酯，进而可以含有电子\离子捕获剂、能量转移剂、自由基捕获剂、抗氧化剂、增塑剂。作为电子\离子捕获剂，可列举出例如N，N’-四甲基苯二胺、联苯基二胺、芘、醌等。作为能量转移剂，可列举出例如苊。作为自由基捕获剂，可列举出例如硫醇、八氢菲、单烷基二苯基醚、生育酚、柠檬酸、丁基化羟基茴香醚、丁基化甲酚、叔丁基对苯二酚、没食子酸丙酯、抗坏血酸衍生物等。作为抗氧化剂，可列举出BHT、亚磷酸三酯、酚系抗老剂、有机硫代酸盐类等。其中，优选为通常认为对于用于食品、药品而言安全的添加剂。对添加剂的量没有特别限定，例如相对于灭菌组合物中的脂肪族聚酯，可以含有0.01?10重量％的添加剂。
[0051]灭菌工序中的含有蛋白质的脂肪族聚酯优选不含有水分。水分率优选为10重量％以下，更优选为4重量％以下，进一步优选为实质上无水。
[0052]另外，含有蛋白质的脂肪族聚酯也可以包装于包装材料来进行放射线灭菌。作为上述包装材料，优选使用铝这种阻气性高的材料。另外，可以与脱氧剂、干燥剂一起密封包装、也可以在脱气后填充了惰性气体的状态下进行包装、或者这两者都可以进行。上述脱氧剂和干燥剂优选为对人体无害、照射放射线时不会失活的物质。
[0053]本发明的灭菌组合物例如可以用作要求蛋白质机能和灭菌性的医疗用材料。
实施例
[0054]以下通过实施例对本发明的实施方式进行说明，但是它们不限制本发明的范围。
[0055]1.凝血酶活性测定
向 7 r > 2 > 社制 2008 管加入试样 20 μ L 和 50mM Tris-HCl (pH8.5) + 50mM NaCl 缓冲液60yL、0.1% PLURONIC F-68 20 μ L，37°C下培养3分钟。作为标准品，使用源自人类血浆的纯化α -凝血酶(由?卜口f夕7 口 y'—社购进:HCT-0020)用相同的缓冲液稀释到5、2.5、1.25、0.625、0.3125U/mL而成的稀释物。向该反应液中添加卜午一仏显色基质S-2238 (ImM:第一化学药品工业)100 μ L并进行搅拌混合，37°C下反应5分钟后，加入0.1M柠檬酸溶液800 μ L停止反应。将反应液200 μ L转移到96孔板，测定0D405/650。
[0056]需要说明的是，除了实施例5?7和比较例4以外，用以下的方法进行测定。向BD公司制聚苯乙烯管加入试样20 μ L和活性测定用稀释溶液(0.01% F-68、50mmol/L NaCl,50mmol/L Tris_HCl、pH8.4) 80 μ L，37°C下培养3分钟。作为标准品，使用重组凝血酶(JPUThrombin Standard 400U/mL 或 WHO/US Thrombin Standard、IlOIU/mL)用相同的缓冲液，在JPU的情况下稀释到4、2、1、0.5,0.25U/mL，在IU的情况下稀释到6、3、1.5,0.75、
0.375IU/mL而成的稀释物。向该反应液添加^ ^卜子一 ^显色基质S-2238 (ImM:第一化学药品工业)100 μ L并进行搅拌混合，37°C下反应7分钟后，加入0.1M柠檬酸溶液800 μ L停止反应。将反应液200 μ L转移到96孔板，测定0D405/650。
[0057]2.纤维蛋白原聚集体的量的测定
将片切出Olcm后，通过稀释液抽提纤维蛋白原，用高效液相色谱测定其聚集体的量。
[0058]〈试验条件〉
检测器:紫外吸光光度计(测定波长:280m)
色谱柱:B1 Sep-SEC_s4000 (7.8 X 300mm、Phenomenex)
柱温:25°C 取样器温度:6°C
流动相:0.5mol/L Arg-HCl/50mmol/L 磷酸缓冲液流量:lmL/min 分析时间:20min
3.厚度
对于成型体，使用高精密度数字测长仪(株式会社$ >卜3:商品名“9 4卜7 f 〃夕VL-50”)通过测定力0.0lN以n=15测定成型体的膜厚，算出平均值作为成型体的厚度。需要说明的是，本测定中，测定仪器以能够使用的最小的测定力进行测定。
[0059]4.单位面积重量
将成形体切成50mmX 10mm并测定其重量，进行换算，由此算出成型体的单位面积重量。
[0060]5.堆密度
由上述测得的厚度和单位面积重量的值算出成型体的堆密度。
[0061]6.凝血酶ELISA测定
在 ELISA 板(NUNC 468667)以 5 μ g/mL 固定化抗人凝血酶抗体(Affinity B1logical公司、Νο.SAHT-AP)。用含有 0.05% Tween20 的 PBS 洗涤后，将 7' 口 ？夕工一 7 (DS 7 r —/W " r ^力^ UK-B80)添加到各孔，进行掩蔽。用含有0.05% Tween20的PBS洗涤后，添加受试体。作为标准品，使用人类凝血酶(、卜a ^ f ^ 7 a —社:HCT-0020)，制成标准曲线。用含有0.05% Tween20的PBS洗涤后，以0.1 μ g/mL添加HRP标记抗人凝血酶抗体((Affinity B1logical 公司、N0.SAHT-HRP)。反应后，用含有 0.05% Tween20 的PBS洗涤，添加TMB试剂(DaKo S1599)，静置10分钟进行显色。加入IN H2S04g止显色，用酶标仪测定0D450-650nm。
[0062]7.脂肪酶及β -葡糖苷酶的酶活性测定
(1)抽提率测定
将成型体切成2cmX2cm，浸溃于ImL的生理盐水3分钟或3小时，溶出固定化了的酶。以n=3测定前后的重量变化，求出通过下式算出的抽提率的平均值。固定化酶理论重量由组合物的重量、装入酶粉末重量％算出。
[0063]抽提比率=重量減少(mg)/固定化酶理论重量(mg)
(2)酶活性测定
月旨肪酶的活性测定使用Continuous Fluorometric Lipase Test试剂盒(PR0GENB10TECHNIK GMBH制)。通过下式算出活性回收率。活性酶量由活性值进行浓度换算来算出。每单位面积的固定化酶理论重量由装入酶粉末重量％和组合物的单位面积重量算出。
[0064]活性回收率(%) = {活性酶量(mg/cm2) /(每单位面积的固定化酶理论重量(mg/cm2) X抽提比率)} X100
β -葡糖苷酶的活性测定通过使用了 Tokyogreen(注册商标、以下相同)-β Glu(積水^ rM力&株式会社)的荧光测定来进行。通过下式算出活性回收率。固定化酶理论重量由装入酶粉末重量％和组合物的重量算出。
[0065]活性回收率(%) = {活性酶量(mg) / (固定化酶理论重量(mg) X抽提比率)} X 100 通过下式算出活性保持率活性保持率(%) = {灭菌后的活性回收率(%)/灭菌前的活性回收率(%)}χιοο
实施例1
在乙醇中分散含有凝血酶的颗粒(将含有重组体凝血酶lmg/mL、氯化钠、柠檬酸钠、氯化钙和甘露醇的PH 7的水溶液冷冻干燥而成)后，加入二氯甲烷，以形成10重量％的方式溶解聚乙醇酸-聚乳酸共聚物(Purasorb F1DLGSO10、Purac公司制)，制备含有凝血酶的颗粒/聚乙醇酸-聚乳酸共聚物=100(以凝血酶计为1.69)/100(w/w)的纺丝液。通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。所得到的纤维成型体的厚度为131 μ m、单位面积重量为1.44mg/cm2、堆密度为lllmg/cm3。将所得到的片切成直径1cm，用200 μ L的生理盐水抽提蛋白质并实施活性测定。其结果为，活性测定值为26.7U/cm2。对于所得到的片，照射20kGy的电子束进行灭菌后，在40°C /75%RH下保存，测定一个月后的凝血酶活性。将灭菌前的凝血酶活性记为100%时，刚照射电子束之后的凝血酶活性为79%的保持率。一个月后的活性保持率为78%，保存中没有发现凝血酶活性降低。
[0066]实施例2
在乙醇中分散含有凝血酶的颗粒(将含有重组体凝血酶lmg/mL、氯化钠、柠檬酸钠、氯化钙和甘露醇的PH 7的水溶液冷冻干燥而成)和奎札因绿(々二 V」> 'J - > )SS (东京化成)后，加入二氯甲烷，以形成10重量％的方式溶解聚乙醇酸-聚乳酸共聚物(Purasorb PDLG5010> Purac公司制)，制备含有凝血酶的颗粒/聚乙醇酸-聚乳酸共聚物=100(以凝血酶计为1.69)/100(w/w)的纺丝液。通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。将包含所得到的纤维成形体(平均厚度:129μπκ单位面积重量:1.49mg/cm2、堆密度:124mg/cm3)的片切成直径1cm，用200 μ L的生理盐水抽提蛋白质并实施凝血酶活性测定。其结果为，活性测定值为40.2IU/cm2。对于所得到的片，照射30kGy的电子束进行灭菌后，在40°C /75%RH下保存，测定一个月后的凝血酶活性。将灭菌前的凝血酶活性记为100%时，刚照射电子束之后的凝血酶活性为70%的保持率。一个月后的活性保持率为74%，保存中没有发现凝血酶活性降低。
[0067]实施例3
在乙醇中分散含有凝血酶的颗粒(将含有重组体凝血酶lmg/mL、氯化钠、柠檬酸钠、氯化钙和甘露醇的PH 7的水溶液冷冻干燥而成)后，加入二氯甲烷，以形成10重量％的方式溶解聚乙醇酸-聚乳酸共聚物(Purasorb PDLG5010>Purac公司制)，制备含有凝血酶的颗粒/聚乙醇酸-聚乳酸共聚物=100(以凝血酶计为1.69)/100(w/w)的纺丝原液。使用所得到的纺丝原液通过流延法制作膜。涂布间隔为127 μ m、涂布速度为30.Wsec0所得到的片的厚度为58 μ m、单位面积重量为2.9mg/cm2、堆密度为504mg/cm3。将所得到的片切成直径1cm，用200μ L的生理盐水抽提蛋白质并实施凝血酶活性测定。其结果为，活性测定值为71.llU/cm2。对于所得到的片，照射30kGy的电子束进行灭菌后，在40°C /75%RH下保存，测定一个月后的凝血酶活性。将灭菌前的凝血酶活性记为100%时，刚照射电子束之后的凝血酶活性为75.7%的保持率。一个月后的活性保持率为82%，保存中没有发现凝血酶活性降低。
[0068]实施例4
在乙醇中分散含有纤维蛋白原的颗粒(将含有重组体纤维蛋白原10mg/mL、精氨酸、氯化钠和甘露醇的PH 8.5的水溶液冷冻干燥而成)后，加入二氯甲烷，以形成10重量％的方式溶解聚乙醇酸-聚乳酸共聚物(Purasorb PDLG5010>Purac公司制)，制备含有纤维蛋白原的颗粒/聚乙醇酸-聚乳酸共聚物=100 (以纤维蛋白原计为50.85)/100 (w/w)的纺丝液。通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。所得到的纤维成型体的厚度为131 μ m、单位面积重量为1.44mg/cm2、堆密度为llOmg/cm3。将所得到片切成直径1cm，用稀释液抽提纤维蛋白原并通过高效液相色谱测定聚集体量。其结果为，聚集体量为9.79%。对于所得到的片，照射30kGy的电子束进行灭菌后，在40°C /75%RH下保存，测定一个月后的聚集体量。刚照射电子束之后的聚集体量为18.81%。一个月后为24.14%。
[0069]比较例I
对于含有凝血酶的颗粒(将含有重组体凝血酶lmg/mL、氯化钠、柠檬酸钠、氯化钙和甘露醇的PH 7的水溶液冷冻干燥而成)照射30kGy的电子束进行灭菌后，在40°C /75%RH下保存，测定一个月后的凝血酶活性。照射前的凝血酶活性为404.73U/小瓶。将灭菌前的凝血酶活性记为100%时，刚照射电子束之后的凝血酶活性为51.8%的保持率。一个月后的活性保持率为17.9%，保存中发现凝血酶活性降低。
[0070]比较例2
在2-丙醇中分散含有凝血酶的颗粒(将含有重组体凝血酶lmg/mL、氯化钠、柠檬酸钠、氯化钙和甘露醇的PH 7的水溶液冷冻干燥而成)后，以形成13重量％的方式溶解羟基丙基纤维素(2.0-2.9mPa.s日本曹逹制)，制备含有凝血酶的颗粒/羟基丙基纤维素=100/100 (w/w)的纺丝原液。通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。所得到的纤维成型体的厚度为204 μ m、单位面积重量为2.08mg/cm2、堆密度为101mg/cm3。将所得到的片切成直径lcm，用200 μ L的生理盐水抽提蛋白质并实施活性测定。其结果为，活性测定值为110.3IU/cm2。对于所得到的片，照射30kGy的电子束进行灭菌后，在40°C /75%RH下保存，测定一个月后的凝血酶活性。将灭菌前的凝血酶活性记为100%时，刚照射电子束之后的凝血酶活性为68.4%的保持率。一个月后的活性保持率为54.9%，保存中发现凝血酶活性降低。
[0071]比较例3
对于含有纤维蛋白原的颗粒(将含有重组体纤维蛋白原10mg/mL、精氨酸、氯化钠和甘露醇的pH 8.5的水溶液冷冻干燥而成)照射30kGy的电子束进行灭菌后，在40°C /75%RH下保存，测定一个月后的纤维蛋白原的聚集体量。照射前的聚集体量为6.97%。刚照射电子束之后的聚集体量为18.51%。一个月后为54.72%。
[0072]实施例1?3、比较例I?2的结果(灭菌后及灭菌后保存后相对于灭菌前的凝血酶(Th)活性保持率)如图1所示。
[0073]可知，通过将蛋白质含有在脂肪族聚酯中，与仅存在含有蛋白质的颗粒的情况(比较例I)相比，放射线灭菌所导致的蛋白质的结构变化、机能降低得到抑制，进而放射线灭菌后的保存所伴随的这些变化、降低，与并非脂肪族聚酯而是纤维素类(羟基丙基纤维素)的情况(比较例2)相比，均得到抑制。
[0074]实施例4和比较例3的结果(灭菌后及灭菌后保存后的纤维蛋白原的聚集体的量)如图2所示。
[0075]可知，通过将蛋白质含有在脂肪族聚酯中(实施例4)，与仅存在含有蛋白质的颗粒的情况(比较例3)相比，放射线灭菌后的保存所伴随的蛋白质的结构变化得到抑制。
[0076]实施例5
在乙醇中分散含有凝血酶的颗粒(t 一> (注册商标、以下相同)组织粘接用:小瓶3)后,加入二氯甲烧，以形成10wt%的方式溶解聚乳酸(PL18 Purac B1material制)，制备含有凝血酶的颗粒/聚乳酸=40 (以凝血酶计为0.45)/100 (w/w)的纺丝液。通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。对于所得到的片以20kGy进行电子束灭菌。将所得到的片切断成2cmX 2cm，用ImL的生理盐水抽提蛋白质并实施活性和ELISA测定。其结果为，活性测定值为5.0U/cm2、ELISA测定值为3.4μ g/cm2。另一方面，对于没有进行灭菌处理的片，同样地实施活性和ELISA测定，结果活性测定值为7.5U/cm2、ELISA测定值为
4.35 μ g/cm2。即，相对于未灭菌片，灭菌片的活性保持率为73%。
[0077]实施例6
在乙醇中分散含有凝血酶的颗粒(^ t 一>组织粘接用:小瓶3)后，加入二氯甲烷，以形成10wt%的方式溶解聚乳酸(PL18 Purac B1material制),制备含有凝血酶的颗粒/聚乳酸=70 (以凝血酶计为0.78)/100 (w/w)的纺丝液。通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。对于所得到的片以20kGy进行电子束灭菌。将所得到的片切断成2cmX2cm，用ImL的生理盐水抽提蛋白质并实施活性和ELISA测定。其结果为，活性测定值为9.575U/cm2、ELISA测定值为7.0 μ g/cm2。另一方面，对于没有进行灭菌处理的片，同样地实施活性和ELISA测定，结果活性测定值为11.15U/cm2、ELISA测定值为7.2 μ g/cm2。即，相对于未灭菌片，灭菌片的活性保持率为86%。
[0078]实施例7
在乙醇中分散凝血酶冷冻干燥粉末(t 一&组织粘接用:小瓶3)后，加入二氯甲烧，以形成10wt%的方式溶解聚乳酸(PL18 Purac B1material制)，制备凝血酶冷冻干燥粉末/聚乳酸=100 (以凝血酶计为1.1)/100 (w/w)的纺丝液。在温度22°C、湿度26%以下通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。喷出喷嘴的内径为0.8mm、电压为15kV、纺丝液流量为3.0mL/h、从喷出喷嘴至平板的距离为25cm。对于所得到的片以20kGy进行电子束灭菌。将所得到的片切断成2cmX2cm，用ImL的生理盐水抽提蛋白质并实施活性和ELISA测定。其结果为，活性测定值为15U/cm2、ELISA测定值为Ily g/cm2。另一方面，对于没有进行灭菌处理的片，同样地实施活性和ELISA测定，结果活性测定值为23U/cm2、ELISA测定值为16 μ g/cm2。即，相对于未灭菌片，灭菌片的活性保持率为64%。
[0079]比较例4
对于含有凝血酶的颗粒(t 一;)以20kGy进行电子束灭菌。用ImL的生理盐水抽提蛋白质并实施活性和ELISA测定。其结果为，活性测定值为22.5U/cm2、ELISA测定值为11.5 μ g/cm2。另一方面，对于没有进行灭菌处理的含有凝血酶的颗粒，同样地实施活性和ELISA测定，结果活性测定值为68.5U/cm2、ELISA测定值为41.5 μ g/cm2。即，相对于未灭菌片，灭菌片的活性保持率为32%。
[0080]实施例8
在乙醇中分散脂肪酶粉末(源自猪胰脏、和光纯药制、以下相同)后，加入二氯甲烷，以形成10wt%的方式溶解聚乳酸-乙醇酸共聚物(FiDLGSO1 Purac B1material制),制备脂肪酶粉末/聚乳酸-乙醇酸共聚物=50/100 (w/w)的纺丝液。在温度27°C、湿度25%以下通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。喷出喷嘴的内径为0.9mm、电压为15kV、纺丝液流量为4.0mL/h、从喷出喷嘴至平板的距离为25cm。所得到的片的脂肪酶抽提率为79%。对于所得到的片以20kGy进行电子束灭菌。将所得到的灭菌片切断成IcmX Icm，用试剂盒中含有的Lipase buffer ImL抽提脂肪酶，实施活性测定。其结果为，活性回收率为
100% ο
[0081]实施例9
向脂肪酶粉末中加入二氯甲烷，以形成10wt%的方式溶解聚乳酸-乙醇酸共聚物(PDLG5010 Purac B1material制)，制备脂肪酶粉末/聚乳酸=50/100 (w/w)的纺丝液。在温度26°C、湿度25%以下通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。喷出喷嘴的内径为0.8mm、电压为15kV、纺丝液流量为4.0mL/h、从喷出喷嘴至平板的距离为25cm。所得到的片的脂肪酶抽提率为63%。对于所得到的片以20kGy进行电子束灭菌。将所得到的灭菌片切断成IcmX Icm,用试剂盒中含有的Lipase buffer ImL抽提脂肪酶,实施活性测定。其结果为，活性回收率为92%。
[0082]实施例10
在乙醇中分散葡糖苷酶粉末(源自杏仁、才 ')工 >夕>酵母工业制、以下相同)后，加入二氯甲烷，以形成10wt%的方式溶解聚乳酸-乙醇酸共聚物(H)LG5010 PuracB1material制)，制备β -葡糖苷酶粉末/聚乳酸-乙醇酸共聚物=38/62 (w/w)的纺丝液。在温度27°C、湿度25%以下通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。喷出喷嘴的内径为0.9mm、电压为15kV、纺丝液流量为4.0mL/h、从喷出喷嘴至平板的距离为25cm。将所得到的片切断成2cmX 2cm后，以20kGy进行电子束灭菌。用生理盐水ImL抽提β -葡糖苷酶，用Tokyogreen-β Glu实施活性测定。其结果为，活性回收率为92%。另一方面，对于没有进行灭菌处理的片，同样地实施活性测定，结果活性回收率为94%。由以上可知，相对于未灭菌纤维成型体的灭菌纤维成型体，活性保持率为98%，没有因电子束灭菌而导致失活。
[0083]实施例11
在乙醇中分散β-葡糖苷酶粉末后，加入二氯甲烷，以形成10被％的方式溶解聚乳酸-己内酯共聚物(PLCA8812多木化学制)，制备β-葡糖苷酶粉末/聚乳酸-己内酯共聚物=38/62 (w/w)的纺丝液。在温度27°C、湿度25%以下通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。喷出喷嘴的内径为0.9mm、电压为15kV、纺丝液流量为3.0mL/h、从喷出喷嘴至平板的距离为25cm。将所得到的片切断成2cmX2cm后，以20kGy进行电子束灭菌。用生理盐水ImL抽提β-葡糖苷酶，用Tokyogreen-β Glu实施活性测定。其结果为，活性回收率为81%。另一方面，对于没有进行灭菌处理的片，同样地实施活性测定，结果活性回收率为80%。由以上可知，相对于未灭菌纤维成型体，灭菌纤维成型体的活性保持率为101%，没有因电子束灭菌而导致失活。
[0084]实施例12
在乙醇中分散葡糖苷酶粉末后，加入二氯甲烷，以形成llwt%的方式溶解聚乳酸(PL18 Purac B1material制)，制备β -葡糖苷酶粉末/聚乳酸=38/62 (w/w)的纺丝液。在温度27°C、湿度25%以下通过静电纺丝法进行纺丝，得到片状的纤维成型体。喷出喷嘴的内径为0.9mm、电压为15kV、纺丝液流量为3.0mL/h、从喷出喷嘴至平板的距离为25cm。将所得到的片切断成2cmX2cm后，以20kGy进行电子束灭菌。用生理盐水ImL抽提β -葡糖苷酶，用Tokyogreen-β Glu实施活性测定。其结果为，活性回收率为62%。另一方面，对于没有进行灭菌处理的片，同样地实施活性测定，结果活性回收率为71%。由以上可知，相对于未灭菌纤维成型体，灭菌纤维成型体的活性保持率为87%，没有因电子束灭菌而导致失活。
[0085]比较例5
对于脂肪酶粉末以20kGy进行电子束灭菌。向粉末Img中添加ImL的Lipase buffer并实施活性测定。其结果为，活性回收率为74%。
[0086]比较例6
对于β -葡糖苷酶粉末以20kGy进行电子束灭菌。将粉末2mg溶解于ImL的生理盐水中，用Tokyogreen-β Glu实施活性测定。其结果为，活性回收率为81%。
[0087]发明效果
本发明的灭菌组合物尽管被灭菌，蛋白质的结构、机能也得以保持。
[0088]产业实用性
本发明的灭菌组合物例如用于要求蛋白质机能和灭菌性的医疗用品的制造业中。
【权利要求】
1.经过了放射线灭菌的灭菌组合物，其含有蛋白质和含有该蛋白质的脂肪族聚酯。
2.根据权利要求1所述的灭菌组合物，其中，蛋白质直接或者以与可药用的添加剂的混合物的形式、以颗粒形式分散于脂肪族聚酯中。
3.根据权利要求1或2所述的灭菌组合物，其中，蛋白质选自由止血性蛋白质、酶、转运蛋白、肌肉蛋白质、保护性蛋白、毒蛋白、蛋白激素、储藏蛋白、结构蛋白、生长因子以及它们的混合物组成的组。
4.根据权利要求1或2所述的灭菌组合物，其中，蛋白质为止血性蛋白质。
5.根据权利要求1?4中任一项所述的灭菌组合物，其中，脂肪族聚酯选自由聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯、它们的共聚物、以及它们的混合物组成的组。
6.根据权利要求1?5中任一项所述的灭菌组合物，其为纤维形状。
7.根据权利要求6所述的灭菌组合物，其通过静电纺丝法制造。
8.根据权利要求1?5中任一项所述的灭菌组合物，其为膜形状。
9.根据权利要求8所述的灭菌组合物，其通过流延法制造。
【文档编号】A61K9/70GK104284673SQ201380025306
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年5月13日 优先权日:2012年5月14日
【发明者】景山由佳子, 藤永贤太郎, 山口鲇子, 本多勧, 佐竹真, 兼子博章, A.石割 申请人:帝人株式会社, 帝人制药株式会社, 一般财团法人化学及血清疗法研究所