用于中风和缺血或缺血性病况的人抗体及其特异性结合序列的制作方法

用于中风和缺血或缺血性病况的人抗体及其特异性结合序列的制作方法
【专利摘要】提供能够结合并识别CNS中的神经元并引起CNS神经元反应的特异性结合成员、特别是人抗体、特别是重组抗体及其片段。所述抗体可用于与神经损害、损伤或变性有关的病况和神经变性疾病的诊断和治疗，特别是治疗或减轻中风或脑缺血。本发明的抗体、其可变区或其CDR结构域序列及其片段还可用于与化学治疗剂、免疫调节剂或神经活性剂和/或与其它抗体或其片段的联合疗法。所述抗体或其活性片段可以单独或与溶栓剂例如TPA组合用于中风或脑缺血的疗法中。抗体通过本文提供其序列的抗体IgM12和IgM42举例说明。
【专利说明】用于中风和缺血或缺血性病况的人抗体及其特异性结合序 列
[0001] 政府支持声明 本文所述发明全部或部分受国立卫生研究院（National Institutes of Health)(资 助号 ROl NS 24180、R01 NS 32129、R01 CA104996、R01 CA096859)及全国多发性硬化协会 (National Multiple Sclerosis Society)(资助号 CA 1011 A8-3)的支持。美国政府在 本发明中享有一定权利。 发明领域
[0002] 本发明涉及能够结合并识别CNS中的神经元并能够引起CNS神经元反应的抗体， 特别是人天然抗体、来源其的重组抗体及其片段。这些抗体可用于诊断和治疗与神经损害、 损伤或变性有关的病况、神经变性疾病、慢性神经损伤或损害和突发性神经损伤或损害。本 发明的抗体、其可变区或其CDR结构域序列及其片段还可用于与化疗剂、免疫调节剂或神 经活性剂和/或与其他抗体或其片段组合的疗法中。本发明特别涉及用于减轻或治疗中风 或缺血、特别是脑缺血的方法，和用于中风或缺血的相关药剂、构建体和组合物。
[0003] 发明背景 神经再生是指神经组织、细胞或细胞产物的再生长或修复。此类机制可包括髓鞘再生、 新的神经元、胶质细胞、轴突、髓磷脂或突触的产生。神经再生因所涉及的功能机制以及再 生程度和速度而在周围神经系统（PNS)和中枢神经系统（CNS)间有所不同。
[0004] 在损伤后成熟哺乳动物中枢神经系统（CNS)中的轴突再生非常有限。因此，在脊 髓损伤（SCI)、创伤性脑损伤、中风和涉及轴突断裂的相关病况之后功能缺陷持续存在。这 种情形不同于哺乳动物周围神经系统（PNS)中的情况，周围神经系统中长距离轴突再生和 实质性功能恢复可发生在成体中。神经元的胞外分子和内在生长能力两者影响再生的成 功。
[0005] 成年哺乳动物中，中枢神经系统（CNS)轴突在损伤后不会自发地再生。相比之下， 周围神经系统（PNS)轴突容易再生，允许在周围神经损害后恢复功能。Aguayo与同事证实， 至少一些成熟CNS神经元当提供有允许的周围神经移植物时保持再生的能力（Richardson PM, McGuinness UM, Aguayo AJ (1980) Nature 284:264 - 265; Richardson PM, Issa VM, Aguayo AJ (1984) J Neurocytol 13:165 - 182; David S, Aguayo AJ (1981) Science 214:931 - 933; Benfey M, Aguayo AJ (1982) Nature 296:150 - 152)。该研究 表明对于轴突生长，PNS环境是刺激性的和/或CNS环境是抑制性的。随后的研究鉴定出 PNS中的生长促进因子和CNS中的生长抑制因子两者。再生的抑制剂包括CNS髓磷脂中的 特定蛋白质和与星形胶质瘢痕有关的分子。另外，CNS中相对于PNS的较慢的碎片清除可 妨碍轴突再生。了解影响轴突生长的因素对开发促进CNS再生的治疗剂至关重要。
[0006] 在周围神经损伤后，轴突容易再生。与细胞体断开的轴突的远端部分进行沃勒变 性。这种活性过程导致轴突断裂和分解。碎片被神经胶质细胞（主要为巨噬细胞）除去。 近端轴突然后可再生，并且使其目标重新受神经支配，使得功能恢复。
[0007] CNS再生抑制剂的两个主要类别是髓磷脂相关抑制剂（MI)和硫酸软骨素蛋白聚 糖（CSPG)。这些分子限制轴突再生，并且通过干扰其功能，在成体CNS中实现某种程度的生 长。细胞自主性因子也是CNS再生失败的重要决定因素。CNS神经元不会增量调节生长相关 基因至与PNS神经元相同的程度。因此甚至在没有抑制剂时，其再生能力也受到限制。提高 神经元的内在生长能力允许CNS内适度的轴突再生（Bomze HM等人（2001) Nat Neurosci 4:38 - 43; Neumann S，Woolf CJ (1999) Neuron 23:83 - 91)。
[0008] 作为CNS髓磷脂的组分，MAI是由少突胶质细胞表达的蛋白质。MAI体外削弱神经 突增生，被认为在CNS损伤后体内限制轴突生长。MAI包括Nogo-A (Chen MS等人（2000) Nature 403:434 - 439; GrandPre T 等人（2000) Nature 403:439 - 44)、髓憐脂相关糖蛋 白（MAG) (McKerracher L等人（1994) Neuron 13:805 - 811)、少突胶质细胞髓憐脂糖蛋 白（OMgp) (Kottis V 等人（2002) J Neurochem 82:1566 - 1569)、肝配蛋白-B3 (Benson MD 等人（2005) Proc Nat Acad Sci USA 102:10694 - 10699)和脑信号蛋白 4D (Sema4D) (Moreau-Fauvarque C 等人（2003) J Neurosci 23:9229 - 9239)。这些中的 3 种（Nogo-A、 MAG和OMgp)与神经元Nogo-66受体I (NgRl)相互作用从而限制轴突生长。这3种在结构 上不相关的配体还对第二种轴突生长抑制性受体（配对的免疫球蛋白样受体B (PirB))显 示亲和力（Atwal JK 等人（2008) Science 322:967 - 970)。
[0009] 已鉴定出几种识别分子，其充当构成促进和/或抑制神经突生长的基础的分子 线索。在神经突增生促进性识别分子中，神经细胞粘附分子Ll在介导神经突增生中起突 出作用（Schachner M (1990) Seminars in the Neurosciences 2:497-507)。Ll 依赖 性神经突增生受嗜同性（homophilic)相互作用介导。LI促进表达LI的神经突和施万细 胞及Ll转染的成纤维细胞中的神经突增生（Bixby等人（1982) Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 84:2555-2559; Chang 等人（1987) J Cell Biol 104:355-362; Lagenaur 等人· (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7753-7757; Seilheimer 等人（1988) J Cell Biol 107:341-351; Kadmon 等人（1990) J Cell Biol 110:193-208; Williams 等人（1992) J Cell Biol 119:883-892)。
[0010] 神经系统损伤每年影响90, 000多人，如果包括脑血管事件例如中风，则人数大更 多。据估计，仅脊髓损伤每年就影响10, 〇〇〇人。由于神经损伤这种高的发生率，神经再生和 修复（神经组织工程学的分支学科），正成为致力于发现损伤后恢复神经功能的新方法的 快速发展的领域。神经系统被分成两部分：由脑和脊髓组成的中枢神经系统及由脑神经和 脊神经连同其相关神经节组成的周围神经系统。虽然周围神经系统具有修复和再生的内在 能力，但是相比之下，且就绝大多数而言，中枢神经系统在其自我修复和再生能力方面受到 限制。目前还没有可接受并获得批准的在中枢神经系统损伤后恢复人神经功能的治疗法。
[0011] 在脊髓损伤（SCI)后，轴突保护和修复作为防止运动神经元损失和永久失能的有 效策略仍具有巨大潜力。使用防止损害和促进损伤后轴突修复的靶向营养因子已实现了神 经元保护。这些分子主要采用基于体外系统（其集中于靶向特异性小分子神经营养因子） 的选择策略而鉴定。虽然这些分子在临床前模型中显示神经保护结果，但是临床试验的结 果不太有利。
[0012] 使用损伤和疾病的多个模型，证实了天然自体反应性单克隆抗体在CNS细胞中 的有益生物功能。使用小鼠单克隆IgM，IN-1，体内证实了神经元存活、轴突再生和功能恢 复的抗体介导的促进（Bregman BS 等人（1995) Nature 378(6556):498-501; Caroni P, Schwab ME (1988) Neuron 1(1) :85-96)。在CNS损伤前使用脊髓匀浆物（SCH)免疫，获得 类似结果（Ellezam B, Bertrand J, Dergham P, McKerracher L (2〇〇3) Neurobiol Dis 12(1):1-10; Huang DW 等人（1999) Neuron 24 (3): 639-647)。
[0013] 多发性硬化（MS)是一种慢性、频繁进行性、炎性中枢神经系统（CNS)疾病，其病 理学特征在于原发性脱髓鞘，通常没有最初的轴突损伤。MS的病因和发病机制未知。MS 的几个免疫学特征及其与某些主要组织相容性复合体等位基因适度相关，引起了 MS是免 疫介导的疾病的推测。自身免疫假设得到实验性自身免疫（变应性）脑脊髓炎（EAE)模 型的支持，其中将某些髓磷脂组分注射给遗传易感动物导致T细胞介导的CNS脱髓鞘。然 而，在MS患者的CNS中未明确鉴定出特异性自身抗原和致病性髓磷脂反应性T细胞，MS 也不与其他自身免疫疾病有关。基于流行病学数据的备择假设是环境因素，或许是未鉴定 的病毒促成了 CNS中的炎症反应，其导致直接或间接（"旁路对象（bystander)"）的髓磷 脂破坏，可能伴有受诱导的自身免疫组分。这种假设得到以下证据的支持：在人和动物两 者中若干天然存在的病毒感染可引起脱髓鞘。一个普遍应用的实验性病毒模型由泰勒氏 (Theiler' s)鼠脑脊髓炎病毒（TMEV)诱导（Dal Canto, M. C.，和 Lipton, H. L.，J Path., 88:497-500 (1977))〇
[0014] 在MS的情况下，脱髓鞘最终导致神经细胞死亡。然而，脱髓鞘后的轴突死亡不是 即时的。如果提供合适的支持分子或细胞，神经系统则具有明显的修复能力。保护CNS的 轴突有希望成为限制存活轴突的丧失和防止永久失能的有效策略。可通过调节损伤中的潜 在神经毒性炎性环境来实现神经保护。正在研究设计以限制兴奋性毒性、抑制一氧化氮或 阻断离子通道的试剂作为保护处于危险中的轴突的方法（Pitt，D.，P. Werner，和C. S. Raine (2000) Nat Med 6:67-70; Okuda, Y 等人（1997) Journal of neuroimmunology 73:107-116; Waxman, S. G. (2002) .J Rehabil Res Dev 39:233-242)。这些试剂中的 许多是具有已经证实的毒性并全身作用于所有细胞的小分子。
[0015] 缺血是向组织的血液供应受限，引起细胞代谢（以保持组织存活）所需要的氧和 葡萄糖短缺。缺血通常由血管问题引起，引起组织的损害或功能障碍。它也指有时由于淤 血（诸如血管收缩、血栓形成或栓塞）导致的身体给定部分的局部贫血。缺氧是其中作为 整体的身体或身体区域（组织缺氧、或较不常见的区域缺氧）缺乏足够氧供应的病况。动 脉氧浓度的变化可以是正常生理的一部分，例如，在剧烈身体锻炼过程中。氧供应和其在细 胞水平的需求之间的错配可以导致缺氧状况。缺血性缺氧在血流减少时发生，并且可以例 如在心脏衰竭和血管扩张性休克中发生。脑缺氧在没有足够氧气进入脑部时发生。脑部需 要氧和营养物的恒定供给来发挥功能。
[0016] 在脑缺氧时，有时只有氧供应中断。这可以由烟雾吸入）、一氧化碳中毒、气哽、防 止呼吸肌运动的疾病、高海拔、气管（气管）上的压力和窒息（Strangulation)引起。在其 他情况下，氧和营养物供给两者都被停止或中断，例如在心脏骤停、心律失常、全身麻醉并 发症、溺水、药物过量、出生期间或出生后新生儿损伤，诸如脑性麻痹、中风、非常低血压中。
[0017] 脑缺血是到脑部的血流不足，并且可以是急性或慢性的。急性缺血性中风是神经 紧急情况，如果快速治疗，其是可逆的。慢性脑缺血可以导致被称为血管性痴呆的痴呆形 式。影响脑部的短暂缺血发作被称为短暂性缺血发作（TIA)，经常被称为小中风。
[0018] 中风，也称为脑血管意外（CVA)，是由于到脑部的血液供应干扰导致的脑功能的迅 速损失。这可能是由于堵塞（血栓形成、动脉栓塞）或出血（血液渗漏）引起的缺血（缺 乏血流）。脑缺血，也被称为脑缺血，是其中到脑部的血流不足以满足代谢需求的病况，并且 是与蛛网膜下腔出血和脑内出血一起发生的中风类型。缺血可以是局灶性缺血，其限于脑 的特定区域，或全脑缺血，其涵盖脑组织的广泛区域。中风是美国长期残疾的主要原因。每 年，接近800, 000人患有中风。缺血性损伤之后，与临床赤字相关的残疾主要是由于神经元 的功能障碍。功能恢复的缺乏部分归因于再生和神经可塑性的限制（Walmsley，A.R.，和 Mir, A. K. (2007) Ci/rrefli 13:2470-2484)。中风可以导致改变 的运动功能，诸如在身体一侧不能移动一个或多个肢体，认知效果，诸如不能理解或组织说 话，或其他缺陷，包括视觉效果，诸如不能看到视野的一侧。目前不存在有效的治疗来预防 或逆转中风相关的神经系统缺陷。
[0019] 缺血性中风在医院中偶尔用血栓溶解（也称为"凝块破坏者（clot buster) "）治 疗，并且一些出血性中风受益于神经外科手术。复发的预防可以涉及施用抗血小板药物， 诸如阿斯匹林和双嘧达莫，控制和降低高血压，并且使用他汀类药物。所选患者可能受益 于颈动脉内膜切除术和使用抗凝血剂。脑缺血的介入治疗仍然受限于通过使用重组组织 纤溶酶原激活剂rtPA的酶促血栓溶解（Brott，T.G.，等人（1992)泣rofc 23:632-640; Haley, E.C·，等人（1992) 23:641-645; Group, Τ·Ν· (1995) New England J Med 333:1581-1587)，和经由直接插管介入去除血液凝块（Gobin YP等人（2004) Stroke 35:2848-2854)。然而，rtPA具有短的3小时的治疗窗口，如果超过3小时时间期输注，则 出血性脑缺血发病率增加（Clark, WM等人（1999) JAMA 282:2019-2026; Hacke W等人 (2008) New England J Med 359:1317-1329)。
[0020] 已鉴定出人单克隆自身抗体，其在中枢神经系统中显示活性，并且与刺激髓鞘再 生特别有关。将期望的是，开发在CNS中具有活性且具有促进神经再生和/或保护神经元免 受疾病、损伤、损害和/或死亡的能力的人单克隆抗体，特别是具有这些活性的重组抗体， 特别是在中风或脑部/脑缺血的情况下，或当到脑部或CNS的氧或血流被剥夺或受急性或 慢性影响时。具体而言，具有进入CNS并治疗、预防或减轻脑缺血或中风的能力的人单克隆 抗体的使用和应用将是期望的。本发明针对的正是该目标的完成。
[0021] 本文参考文献的引用不应解释为承认所述文献是本发明的现有技术。
[0022] 发明概述 本发明涉及在CNS中具有特定有效性的神经调节剂，所述调节剂包含选自IgM亚型 的抗体、其活性片段、其单体、其激动剂及其组合的物质。本发明的神经调节剂或抗体具有 以下一个或多个特征：它们保护和/或稳定神经元；它们靶向CNS或神经细胞损害、受损 (compromise)或损伤的部位；它们减少或阻止细胞死亡，例如过氧化氢诱导的细胞死亡。 在本发明的一个具体方面，所述药剂，特别是神经元结合单克隆抗体是有效的，且可应用或 用于治疗和减轻中风和缺血，特别是脑缺血，和其中涉及或已经发生神经细胞或脑的缺血 或缺氧的病况。
[0023] 本发明提供神经元结合单克隆抗体，其具有促进神经突延伸、以在神经再生中起 作用和/或保护神经元免受损害以及用于中枢神经系统的诊断和治疗目的的能力。本研究 证明，当将神经元结合单克隆抗体、特别是抗体IgM12 rHIgM12施用于中风之后的动物（在 这种情况下，用于诱导缺血性中风的动物模型）时，其导致动物功能的明显改善并保护组 织完整性。
[0024] 具体而言，提供特异性重组抗体，其中所述抗体识别并能够结合神经元，包括皮质 神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞，且在中风、缺血病况或神经细胞 或小胶质细胞缺血或缺氧事件中或之后，其靶向并介导神经元和神经细胞。本文提供重组 完全人抗体。本发明的抗体在与神经受损、损害或损伤有关的病况或疾病中具有诊断和治 疗用途。
[0025] 在一个总体方面，本发明提供针对且能够结合神经元上的一个或多个表位的抗 体，所述神经元包括皮质神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞。在一个 大的方面，本发明提供分离的特异性结合成员（binding member)，特别是抗体或其片段， 包括识别、结合和/或靶向神经元的重组人抗体。本发明提供特异性结合神经元和保护 神经元免于细胞死亡并且不会促进髓鞘再生的抗体，特别是人抗体，特别是IgM抗体。本 发明的抗体应用于治疗或减轻其中神经受损、损伤或损害或处于受损、损伤或损害风险的 哺乳动物的疾病或病况，包括应用于脊髓损伤（SCI)、创伤性脑损伤（TBI)、肌萎缩性侧索 硬化（ALS)、多发性硬化（MS)、阿尔茨海默病（Alzheimer' s disease)、中风、帕金森病 (Parkinson's disease)、亨廷顿舞蹈病（Huntington's disease)、产前缺氧/围产期缺血、 大脑性麻痹、脑病、脊髓病或运动神经元疾病，并且特别应用于神经元和这些疾病中神经能 力的保护、存活或维持。
[0026] 在一个具体方面，本发明的抗体或其组合物可用且应用于中风和脑缺血中。在一 个具体方面，本发明的抗体或组合物可用于其中到脑部的血流和/或氧不足以满足代谢需 求或其中对脑部的创伤性损伤导致神经元和相关细胞的死亡或损伤或死亡或损伤风险的 病况。在一个具体方面，本发明提供抗体或其片段，其是抗体12或42,特别是血清来源的或 重组的IgM12或IgM42。
[0027] 在本发明的一个方面，提供包含图5和/或图6中所示的可变区⑶R序 列的重组或合成神经元结合抗体。抗体12包含图5中所示的重链CDR序列 CDR1 GGSVSLVY (SEQ ID N0 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ^ ID NO 32： 和 CDR3 ARSAS 丨 RGWFD (SEOID 吣調..及轻链 CDR 序列 CDR1 QSlSSY (SEQ IDNO.:判、CDR2 AAS (SEQ ID NO;35；和 CDR3 QQSWTPW (SEQ IO NO:36)。抗体 42 包含图 6 中所示的 重链 CDR 序列 CDR1 GFTFSTYA (SK! ID NO: 3打、C0R2 INVC5GVII (SEQ ID NO38)和 CDR3 VRRSGFDRNSSPADF (8EQ l〇 NO^35}及轻链 CDR 序列 CDW QGIG《SEQ D NO..爾、 CDR2 TTS 丨+SEO ID NOW)和C0R3 QKYNSAPRf (SEQ ID NO..销。因此，以本文鉴定的抗体的 CDR 为基础的重组抗体可用于靶向和保护神经元，特别是疾病或癌症中的易感、受损、损伤或损 害的神经元。
[0028] 本发明因此提供特异性结合神经元和保护神经元免于细胞死亡并且不会促进 髓鞘再生的分离的人IgM抗体或其片段，其中抗体或片段包含：(a)图5所示的可变重 链氨基酸⑶R 结构域序列 CDm GGSVSIYY (SEQ ID NO:31)、CD?2 GYI+YSSGST (SEQ ? NO:· 和 CDW ARSASIRGWFD (SM D Nft33)及轻链 CDR 序列 CDR1 QSISSY (SEO ID?.:制)、 CDR2 AAS (SEOID NO:?!和 CDR3 QOSYHTPW (SEQ ID W:3Q ;或（b)图 6 所示的可变重链 氨基酸⑶R 结构域序列 CDR1 证了rtyMseq 3D 37丨、CDR2 IWGGVTT {SEQ ID NO:38| 和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID N0.39j 和轻链 CDR 序列 CDR1 QGIG (SEOIO NO ]、 core TTS {SEQ ID ΝΟι.41;·和CDFQCWYN&APRT (SEQ ID NO: 42丨，以用于治疗或减轻其中神经受损、 损伤或损害或处于受损、损伤或损害风险的哺乳动物的疾病或病况。
[0029] 在更具体的方面，本发明的抗体包含包括图5和/或图6所示的抗体12或42的 氨基酸序列。本发明的重组抗体IgM12包含图5所示的可变重链序列（SEQ ID NO: 1)和轻 链序列（SEQ ID N0:11)。本发明的重组抗体IgM42包含图6所示的可变重链序列（SEQ ID NO: 17)和轻链序列（SEQ ID N0:27)。在本发明的具体方面，重组抗体是包含人重链可变区、 恒定区和人J链的完全人重组抗体。本文提供完全人重组IgM12抗体，其包含图5所示的 人免疫球蛋白重链（包含可变区（SEQ ID NO: 1)或其CDR)、人恒定区、特别是κ序列（SEQ IDN0:3、5、7和9)和人J链（SEQIDN0:15)。
[0030] 在又一个方面，本发明提供分离的抗体或其能够结合抗原的片段，其中所述抗体 或其片段包含含有基本如本文或图6中所示的氨基酸序列的多肽结合结构域。本发明提 供能够结合神经元的分离的人抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区（SEQ ID N0:17)或其CDR和轻链可变区（SEQ ID N0:27)或其CDR，或包含基本如本文或图6中 所示的氨基酸序列。
[0031] 在又一个方面，本发明提供分离的完全人抗体或其能够结合抗原的片段，其中 所述抗体或其片段包含含有基本如本文和图5中所示的氨基酸序列的多肽结合结构 域。本发明提供能够结合神经元的分离的完全人抗体或其片段，其中所述抗体或其片段 包含重链可变区（SEQ ID NO: 1)或其⑶R及轻链可变区（SEQ ID NO: 11)或其⑶R，或包 含基本如本文和图5中所示的氨基酸序列。本发明特别提供分离的人IgM抗体或其活 性片段，其包含图5所示的可变重链氨基酸⑶R结构域序列CDR! GGSVSLW (SEOID NO:31! 、C0R2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32)和 CDR3 ARSASiRGWFD (S+EQ _0 NO:33)及轻链 CDR 序列 CDR1 QSISSY (SEQ IDNO： 3IJ > CDR2 MS {SEQ D N0:% 和 C.DR3. QQSWTPW (SEO ID NO:36)。在 一个具体方面，本发明提供分离的完全人重组IgM抗体或其活性片段，其包含可变重 链氨基酸 CDR 结构域序列 CDm GGS辟LYY (SEO ID NO:31 丨、CDR2 GYiYSSGST (SEQ ID NO:32：| 和 CDR3 ARSASIRGWFD {SEQ ID NO 33丨及轻链 CDR 序列 CDR1 QSISSY (SEQ 丨DW 3$、 CDR2MS 丨SEQ ID N0.35丨和 CDR3 QQSWiPW {.SEQ O NO:：?)、人恒定区和 SEQ ID NO: 15 所示的 人J链序列。
[0032] 在其他方面，本发明提供包含编码上述神经元结合多肽或抗体的序列的分离的 核酸和制备本发明的多肽或抗体的方法，所述方法包括在引起所述多肽或抗体表达的条 件下表达所述核酸，并回收多肽或抗体。在一个此类方面，提供编码具有图5或图6所示 的氨基酸序列的抗体可变区序列的核酸或提供具有图5或图6所示的CDR结构域序列的 抗体。在一个方面，提供包含图5或图6的核酸序列的核酸。在又一个方面，提供编码 图5或图6所示的重链可变区VH或轻链可变区VL的核酸。本发明还涉及编码本发明抗 体的重组DNA分子或克隆基因或其简并变体；优选核酸分子，特别是编码抗体VH和VL、 特别是⑶R区序列的重组DNA分子或克隆基因，其具有图5或图6所示序列或能够编码 图5或图6所示序列。在优选的方面，本发明提供编码IgM12的重链（SEQ ID N0:2)和轻 链可变区序列（SEQ ID N0:12)的核酸，以及编码IgM42的重链（SEQ ID N0:18)和轻链 可变区序列（SEQ ID N0:28)的核酸。在本发明的一个方面，提供核酸，其编码包含可变 重链氨基酸 CDR 结构域序列 CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID N0:31丨.、CDR2 GYiYSSGST (SEQ ID 和① R3 ARSASIRGWFD (SEQ ID N0.33)及轻链 CDR 序列 CDfi1 OSISSY (SEO ID?.. 34}、 CDfS AAS (SM ID NCWS和CDR3 QQSYHWW既(2丨D NO 3?的抗体或其片段。在又一个方面， 核酸还编码人恒定区和人J链，特别是SEQ ID NO: 15的J链。在本发明的一个方面， 提供核酸，其编码包含可变重链氨基酸⑶R结构域序列CDR1 GFTFSTYA (SEO ID NO: 37) 、GDR2 INVGSVTT (SEQ ID ?;38丨和 CDRS VRRSGP+D侧SSPADF {SEQ 丨D NO:39丨及轻链 CDR 序列 CDR1 QGIG{SEQ ID NO: )、CDR2 TTS {SEO O NCH1)和 CDR3 OKYNSAPRT (SE0I.D ?312 丨的抗体或 其片段。在又一个方面，核酸还编码人恒定区和人J链，特别是SEQ ID NO: 15的J链。
[0033] 包含本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体可用于治疗、预防或诊断人 或动物体的方法，例如哺乳动物中的神经保护方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有 效量的本发明的抗体、其片段和重组抗体。包含本发明的⑶R结构域序列的重组抗体或其 片段可用于哺乳动物中的神经保护方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的本发 明的抗体、其片段和重组抗体。
[0034] 本发明的药剂，特别是重组抗体或其片段可在预防、治疗或减轻能够、可能或的确 导致CNS损伤的神经损伤、损害或受损和并发症的方法中用作神经保护剂。当涉及或关联 神经元的结构、功能或存活丧失（包括脑损伤或创伤、脊髓损伤（SCI)、神经损伤、头损伤、 其中脑供血减少或受损的病况、脑感染性疾病、神经变性疾病）时，本发明的治疗或预防方 法是可适用的。根据本发明的方法治疗、预防或减轻的示例性的此类疾病或病况包括脊髓 损伤（SCI)、创伤性脑损伤（TBI)、肌萎缩性侧索硬化（ALS)、多发性硬化（MS)、阿尔茨海默 病、中风、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、产前缺氧/围产期缺血和/或大脑性麻痹、脑病、脊髓病 和运动神经元疾病。本发明因此涉及治疗或减轻其中神经受损、损伤或损害的哺乳动物中 或者其中神经或神经元易于受损、损伤或损害或者有受损、损伤或损害风险的情形中的疾 病或病况的方法，所述方法包括施用选自IgM12和IgM42的重组抗体或完全人抗体或其片 段。
[0035] 在本发明的一个具体方面，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组 抗体，可以用于方法中或以组合物施用以治疗或减轻中风或脑缺血。在本发明的一个具 体方面，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以 组合物施用以治疗或减轻中风。在本发明的一个具体方面，包含根据本发明的可变区序 列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以组合物施用以治疗或减轻脑缺血。在 本发明的一个实施方案中，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可 以用于方法中或以组合物施用以改善病况诸如中风中的运动功能。包含根据本发明的可 变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以组合物施用以改善患有或疑 似患有中风的动物中的运动功能。包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组 抗体，可以用于方法中或以组合物施用以改善已经具有中风或具有脑缺血的动物中的运 动功能。在一个具体方面，如图5中所示，包含重链CDR序列CDR1 GGSVSLYY(SEQ ID N0.31j 、CDR2 GYIYSSGST (SE-Q ID NO:32)和 GDR3 ARSASiRGWFD 〖SEQ ID ?.以及轻链 CDR 序列 CDW QSISSY (SEO ?NO.:34)、CDR2 MS {SEO ID NO:35)和 CDFQCMSWfPVV (SEOO NO:36)的 IgM12、 rIgM12、抗体12用于治疗、预防或减轻中风或脑缺血。在其一个方面，包含根据本发明的可 变区序列的抗体、其片段和重组抗体可以在其中确定、怀疑中风和/或脑缺血或处于中风 和/或脑缺血的风险的情况下，包括其中可以施用或利用酶促溶栓剂，诸如组织纤溶酶原 激活剂（TPA)或其他溶栓剂或抗血栓形成剂的情况下，进行施用。
[0036] 在本发明的一个方面，在其中神经受损、损伤或损害的情况、疾病或病况中或者在 其中神经或神经元易于受损、损伤或损害或者有受损、损伤或损害风险的情形下，包含本发 明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体可用于方法中或以组合物施用以改进或稳定神 经功能或运动功能。在一个具体方面，抗体或其片段在疾病、创伤或病况的早期或初始阶段 使用或施用，或在疾病、创伤或病况的进程或持续时间内重复，以利于或维持神经系统功能 或运动功能的改进或稳定，包括或选自运动（例如步行）或认知功能（例如回忆或识别）。
[0037] 在本发明的一个方面，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体 可用于方法中或以组合物施用以减缓或减轻中风或脑缺血事件中的神经影响、缺陷、损害 或神经元细胞死亡。根据该方法，所述抗体减轻一种或多种功能或可评价的神经或运动参 数，包括可评估的或可量的参数例如中风量表（scale)或功能量表。抗体的施用有效改善 或减轻一种或多种与中风相关的症状或参数，包括例如，上下肢运动功能、肢体共济失调、 感觉功能、语言、声音清晰度、注意力、注视和视觉功能、手臂、手和腿部力量和运动中的一 种或多种。
[0038] 本发明的方法可包括施用多于一种抗体或片段，包括抗体IgM12和42的 组合。在本发明的一个方面，提供包括施用一种或多种抗体或其片段的方法，其 中抗体包含（a)可变重链氨基酸⑶R结构域序列CDR1 GGSVSLYY丨SEQ ID N0:31}、 CDR2 GY1YSSGST |SEQ IO NO:32)和 COR3 ARSASlRGWFO {SEQ D 嶋:夠及轻链 CDR 序列 CDR1 QS丨SSY (SEQ IDNO 34)、CDR2 WS pEQ IO NO:36)和 CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID M0.3S),或（b)可 变重链氨基酸 CDR 结构域序列 CDR1 GFTFSTOMSEQ 丨D NO: 37]、CDR2 胸VG.GVTT (SEQ 10 ?5:38》 和 CDR3 VRRSGPDRNSSPAOF {SEQ ID NO.獨及轻链 CDR 序列 CDRI QGIGpEOIDNO:蝴、 CDR2 TTS (SEQ ?0 N0:41 丨和 CDR3 OKYNSAPRT (SEQ 丨D NO: β)。在又一个此类方法中，抗体 IgM12 和/或抗体IgM42的一种或多种可与另一种CNS活性抗体组合，特别包括抗体rHIgM22和 /或rHIgM46的一种或多种。rHIgM22抗体包含SEQ ID N0:43和44所示氨基酸序列，或 这些SEQ ID的CDR。rHIgM46抗体包含SEQ ID NO: 45和46所示氨基酸序列，或这些SEQ ID的⑶R。因此，抗体IgM12和/或抗体IgM42的一种或多种可与一种或多种包含以下 的髓鞘再生抗体组合：（a)包含CDRl序列SSGMH、CDR2序列V师SYDGSRKYYADSVKG和CDR3 序列GVTGSPTLDY的重链可变区CDR及包含CDRl序列SGSSSNiGNNFVS、CDR2序列DfTKRPS 和CDR3序列G(E丨TWDSSLSAV V的轻链可变区CDR ;或（b)包含CDRl序列SGFTFSSYW、 CDR2序列丨KKDGSEK和CDR3序列ARPfCGGDCYLPWYFD的重链可变区CDR及包含CDRl序列 QSVLYSSNNKNY、CDR2序列YWAS和CDR3序列QQYYNTPQA的轻链可变区CDR。抗体的组合 可在不同的时间和以不同的量或浓度共同或连续施用。可使用双特异性或多特异性抗体。 在一个具体此类方面，通过联合施用或通过相隔短的持续时间或较长持续时间（包括数小 时、数天或数周）的连续施用，将抗体12和/或42与抗体22和/或46和/或具有IgM22 或IgM46的⑶R区⑶RU OTR2和⑶R3序列的抗体组合施用。在一个此类具体方面，通过联 合或连续施用，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合施用用于治疗或减轻涉及神 经变性的疾病或病况，特别包括脱髓鞘。在又一个此类方面，通过联合或连续施用，将抗体 12和/或42与抗体22和/或46组合施用用于治疗或减轻脱髓鞘疾病或病况。在一个具 体方面，通过联合或连续施用，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合施用用于治疗 或减轻多发性硬化。在一个此类方面，在MS疾病的可测量临床方面，实现髓鞘再生和神经 保护的联合作用，包括协同作用。
[0039] 鉴于本发明药剂的神经保护和/或神经再生能力，本发明还涉及产生和刺激神经 元增殖的体外方法，包括皮质神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞的增 殖。此类增殖的神经元可适于移植和神经细胞治疗方案和方法。
[0040] 本发明的诊断效用延伸到本发明的抗体在表征CNS神经损伤或损害或者筛查或 评价涉及神经损伤、损害或死亡（包括坏死性或凋亡性死亡）的疾病或病况的测定法和方 法中的用途，包括体外和体内诊断和成像测定法。因此，所述抗体可用于测定和方法中以评 价中风或缺血和/或评估缺血或中风或预测的或怀疑的缺血或中风后的损伤。在免疫测定 中，可制备控制量的抗体等，并用酶、特异性结合配偶体、配体、染料、荧光标签和/或放射 性元素标记抗体，然后可引入细胞样品中。在标记材料或其结合配偶体有机会与样品中的 部位起反应后，所得质量可通过已知技术检查，这随所连接的标记的性质而变化。在体内 诊断或成像应用中，可制备抗体或其神经元结合片段，并用酶、特异性结合配偶体、配体、染 料、荧光标签和/或放射性元素标记所述抗体或其神经元结合片段，然后可引入动物中。在 标记材料或其结合配偶体有机会与动物内的部位起反应后，可通过已知技术检查动物，这 随所连接的标记的性质而变化。在本发明的诊断效用的方面，本发明的抗体或其活性片段 可用于测定和方法中以表征脑缺血或中风。具体而言，在其中疑似脑缺血或中风或有脑缺 血或中风风险的情况下，本发明的抗体可用于确定或评价脑缺血和或/中风。
[0041] 放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，可用于体外诊断技术和体 内放射性成像技术。在本发明的又一个方面，放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及 其片段，特别是放射性免疫缀合物，可用于放射性免疫疗法，特别作为用于神经损伤修复、 神经再生、神经变性恢复、癌症或CNS肿瘤疗法的放射性标记的抗体，或在某些情况下备选 地用于受损害神经组织或神经元的切除。在体内方面，抗体或其神经元结合片段是标记的， 并在手术或手术技术（包括立体定向术或最小侵入性技术）之前、期间或之后施用于动物， 用于定位神经损伤或评价其余受损害或受损伤的神经组织的目的。在一个此类方面，放射 性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，可用于放射免疫导向手术技术，其中它们 可在靶向、鉴定或除去此类细胞的手术之前、期间或之后，鉴定和表明受损、受损害、受损伤 或濒死神经细胞或神经元或神经组织的存在情况和/或位置。
[0042] 免疫缀合物或抗体融合蛋白包括在本发明中，其中本发明的特异性结合成员，特 别是抗体及其片段，与其他分子或药剂缀合或连接，其进一步包括但不限于与神经活性药 物、化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂或药物缀合的结合成员。 [0043] 本发明包括可以试验试剂盒的形式制备的测定系统，其用于定量分析例如受损 害、受损或受损伤神经元的存在程度或定量测定样品中的神经元。系统或试验试剂盒可包 括通过本文所述的放射性技术和/或酶技术之一，使标记与抗体偶联而制备的标记组分， 以及一种或多种其他的免疫化学试剂，任选其中至少一种是游离或固定的组分或其结合配 偶体。
[0044] 可在药物组合物中制备本发明的抗体，且在一个具体的实施方案中为包含本文图 5和图6提供的重链和/或轻链序列的重组抗体，或其活性片段和来源于其中、特别包含图 5和图6所述CDR区序列的单链、重组或合成抗体，所述药物组合物包括合适的媒介物、载 体或稀释剂，用于在其中疗法是适宜的情况下施用，以例如治疗或减轻涉及神经元受损、损 害、损伤或死亡的病况或疾病。此类药物组合物还可包括通过本领域已知方法（诸如聚乙 二醇化）调节抗体或片段的半衰期的方法。此类药物组合物还可包含其他抗体或治疗剂。
[0045] 本发明还包括与其他分子或药剂共价连接或以其他方式结合的抗体及其片段。 这些其他分子或药剂包括但不限于具有截然不同的识别特征的分子（包括抗体或抗体片 段）、毒素、配体、神经活性剂和化疗剂。在另一个方面，本发明的抗体或片段可用来靶向或 导向治疗分子或其他药剂，例如使分子或药剂靶向神经元，例如靶向皮质神经元、海马神经 元、视网膜神经节细胞或小脑颗粒细胞，包括伤口部位、缺血部位、肿瘤部位、炎症区域或神 经变性病灶。本发明的抗体或片段可用于靶向或引导治疗性分子或其他药剂，例如将分子 或药剂靶向至脑缺血或中风的部位。
[0046] 从接下来的参照下列说明性附图和随附权利要求书进行的详述来看，其他目的和 优势对本领域技术人员而言将是显而易见的。
[0047] 附图简沭 图1 :人IgM与多种类型的神经元表面结合。sHIgM42 (A)和rHIgM12 (C)与共表达神 经丝（NF) (B和D)的活的皮质神经元表面结合。在培养基中与10 μ g/ml IgM孵育10分 钟过程内，将细胞保持在冰上。将细胞固定，洗涤，用抗人μ链Fab'2-FITC第二Ab检测人 IgM。内部NF以特有的节段模式存在。使皮质细胞在聚鸟氨酸包被的盖玻片上的神经基础 B27培养基中生长6天。并非所有的皮质神经元均表达NF，但是IgM与培养物中的所有神 经元结合。rHIgM12 (E绿色）和sHIgM42 (F绿色）与共表达神经丝（NF，红色）的活的小 鼠海马神经元表面结合。使海马神经元在聚赖氨酸包被塑料上的神经基础B27培养基中生 长1周。使自人颞叶切除而分离的细胞在DMEM/F12/N2/B27中生长21天。rHIgM12与也是 β III微管蛋白阳性（F，得自Promega的抗β III)的细胞表面结合（G)。
[0048] 图2.人IgM以截然不同的模式标记小脑颗粒细胞表面。使在培养1天的大鼠小 脑颗粒细胞与10 Kg/ml人血清来源的IgM、sHIgM12或sHIgM42在培养基中在冰上活着孵 育15分钟。在用4%低聚甲醛洗涤和固定后，使细胞在室温下与FITC缀合的抗人μ链抗体 一起孵育，并使用免疫荧光显微镜成像。使用这两种抗体的神经元膜标记的模式不同。神 经突膜的短区被sHIgM12结合，导致清楚的点状模式。神经突膜的较大区被sHIgM42结合， 导致节段模式。放大倍数为400x。
[0049] 图3.神经元结合性人IgM、rHIgM12和sHIgM42保护培养中的皮质神经元免于过 氧化物诱导的细胞死亡。培养3天的小鼠神经元用含或不含10 Pg/ml人IgM的500 nM H2O2 或盐水处理30分钟。细胞用新鲜的神经基础B27培养基洗涤，24小时后，使用FLICA胱天 蛋白酶-3测定试剂盒（Immunochemistry Technologies 935)，检测一式三份处理的96孔 中胱天蛋白酶-3的表达。条形柱表示免于胱天蛋白酶3活化的保护％。
[0050] 图4表示用于产生重组抗体的可扩增载体。这是用于产生基于sHIgM22 (rHIgM22)的重组抗体的载体图，该载体经修饰以产生重组IgM12和IgM42。对于在CHO细 胞中表达，VH启动子用ElA启动子置换。CX轻链恒定区用κ轻链恒定区C κ置换。
[0051] 图5表示重组载体中的IgM12抗体氨基酸和核酸序列。重链氨基酸序列和编码核 酸序列呈灰色，提供并标出Vh的每一个和恒定区序列CHl、CH2、CH3和CH4。轻链氨基酸序 列和编码核酸序列呈紫色，标出可变VL和恒定CL (κ)序列。注释了重链和轻链可变区的 CDR区序列。在氨基酸和核酸序列中标示了人J链。
[0052] 图6表示重组载体中的IgM42抗体氨基酸和核酸序列。重链氨基酸序列和编码核 酸序列呈灰色，提供并标出Vh的每一个和恒定区序列CHl、CH2、CH3和CH4。轻链氨基酸序 列和编码核酸序列呈紫色，标出了可变VL和恒定CL (κ)序列两者。注释了重链和轻链可 变区的⑶R区序列。
[0053] 图7.重组rHIgM12改进患TMEV诱导性疾病的小鼠中的缺陷。在100 Pg sHIgM12 的单一 i.p.剂量后3周，平均每小时自发性夜间活动（当小鼠有正常活动性时）改变。在 TMEV感染后90天各组5只SJL小鼠用rHIgM12 (红色条形柱）或对照人IgM (黑色条形 柱）治疗，在AccuScan活动监测箱中按组每周监测3天。将3个夜间时段内的每小时夜间水 平活动的平均值土 SEM与IgM治疗前3个夜晚的夜间活动进行比较。在单剂量的rHIgM12 治疗后3周-7周存在与治疗前水平相比夜间活动增加（P〈0. 01)，但用对照治疗后无增加。 对未感染年龄匹配小鼠的运动水平作图用于比较（绿色条形柱）。
[0054] 图8.在小鼠脑干采集的MRS光谱。上小图表示从中采集信号的三维像素。定位该 目标区域使用解剖界标。极短MRI扫描用来获取3个正交平面的图像以定位脑干上的2. 5 mm3立方体（上小图）。小鼠脑干的300MHz，IH光谱（下小图）。容易地鉴定出胆碱（Cho)、 肌酸（Cr)和N-乙酰基-天冬氨酸（NAA)峰。光谱参照水（在4. 7 ppm)。
[0055] 图9.脑干NAA水平降低与轴突丧失增加有关。用TMEV感染后0-270天，对10只 SJL小鼠进行了前瞻性研究。获得每只小鼠脑干的MRS，并测定NAA浓度（上）。在病毒感 染后90天（通过横切面的直接计数显示大轴突丧失的点），在达到统计显著性下降的所有 小鼠中记录到NAA逐渐降低（2)。在疾病持续期间，NAA水平保持低下。未感染小鼠（黑色 条形柱）、感染后90天（灰色）和270天（白色）以T6水平计数的绝对轴突（下）。
[0056] 图10.在单剂量的人IgM后脑干中的NAA。TMEV感染后90天，当NAA水平开始 下降，且可检测到大轴突丧失时，向各组10-15只SJL小鼠 i.p.施用单次100 Pg剂量的 SHIgM12、sHIgM42、对照人IgM或盐水（PBS)。在治疗前和治疗后5周和10周，收集脑干的 MRS。由这些光谱计算NAA水平。在sHIgM12和sHIgM42治疗组中，与治疗前水平相比，NAA 在5周后（P=0. 005, P=O. 029)和在10周（P〈0. 001，P=O. 037)增加。在用对照试剂治疗的 各组小鼠中是稳定的或趋于向下。该图表示脑干三维像素 NAA水平的平均值+/-SEM。
[0057] 图11.与神经元结合的人IgM不改变脱髓鞘、髓鞘再生或炎症。各组5只慢性 TMEV感染小鼠用单次100 Pg剂量的人IgM治疗。在治疗后10周，所有组包括相同程度的 脊髓炎症（黑色条形柱）和脱髓鞘（红色条形柱）。如所预期的一样，用少突胶质细胞结合 性IgM、rHIgM22治疗的小鼠，显示较多髓鞘再生（绿色条形柱）。sHIgM12和sHIgM42不促 进脊髓髓鞘再生。这表明体内有保护轴突的多种方式。
[0058] 图12.静脉内注射后⑶-1小鼠循环中的神经元结合性人IgM的血清半衰期。夹 心ELISA用来定量测定48小时内小鼠血清的人μ链的衰变。碱性磷酸酶底物（Sigma 104) 的0D405平均值获自该方法。绘制每组3只小鼠的血清和标准误差。
[0059] 图13. 35S标记的rHIgMl2进入TMEV感染和未感染SJL小鼠的脑和脊髓。将35S 标记的rHIgM12 i.p.施用于5个月TMEV感染的和年龄匹配的未感染SJL小鼠。4小时后， 一对小鼠用盐水灌注，急速收获组织，称重，用剃刀切碎，并与10 ml闪烁液（Ultima Gold LSC)混合。在24小时时重复相同步骤。48小时后，使组织增溶，将小瓶在Beckman闪烁计 数器中计数1分钟。对每只小鼠的全脑和脊髓总计数绘图。小瓶中无组织的背景计数为12 个计数。
[0060] 图14.神经元结合性人IgM体内靶向脊髓病变。向患慢性TMEV诱导的脊髓脱髓 鞘的小鼠腹膜内施用1.0 mg sHIgM42 (A)、rHIgM12 (B)或对照人单克隆IgM (C)。4小时 后，小鼠用4%低聚甲醛灌注，取出脊髓，冷冻切片，使用针对人μ链的FITC缀合的Fab' 2 片段（Jackson Immnoresearch)免疫标记。来自接受sHIgM42或rHIgM12的小鼠的脊髓在 病变中含有人IgM。病变中几乎未发现对照人IgM。下小图为Η/E染色以显现炎性细胞和 病变。我们得出的结论是，在TMEV模型中某些人IgM可穿过BBB。
[0061] 图15.神经元结合性人IgM定位于脊髓病变中神经丝+ (NF)轴突。向患慢性 TMEV诱导的脊髓脱髓鞘的小鼠腹膜内施用1.0 mg IgM，4小时后处死。将脊髓纵向冷冻切 片，用FITC缀合的抗人μ链Fab' 2片段（绿色）和抗-NF (SMI-32和34,红色）免疫标 记，接着用TRICT缀合的第二抗体免疫标记。合并的共聚焦图像证实sHIgM42 (A)与长NF+ 纤维⑶共定位，在（C)中合并。rHIgM12 (D，绿色）也与NF+结构（D，红色）例如横切轴 突纤维束共定位。
[0062] 图16. rHIgM12和sHIgM42不会使EAE临床评分变差。在每只小鼠达到1的临床 评分（尾无力）时，向患MOG肽诱导的EAE的各组10只C57BL6小鼠 i. V.施用单次100 Pg 剂量的rHIgM12、sHIgM42、对照人IgM或盐水，且每隔一天进行监测直到免疫后28天。图 为每个治疗组的平均临床评分的平均值+/-SEM。平均临床评分的秩的ANOVA (ANOVA on ranks)表明组间无差异（Ρ=0· 14)。
[0063] 图17. rHIgM12和sHIgM42不加重EAE脊髓病理。在图13的研究结束时，取出 脊髓，切成I mm块，从每3个的连续块中切取横切面，用erichrome染色以显现病理。不 知情地对10个横切面/小鼠（40象限（quadrant))进行分级。炎症（P=O. 825)或脱髓鞘 (Ρ=0· 766)在组间无差异。
[0064] 图18. rHIgM12促进神经突增生使Ε15海马神经元在聚-D-赖氨酸（PDL) (A) 或rHIgM12 (B)硝酸纤维素包被的盖玻片上生长。接种（plating)细胞后12小时,将这些 神经元固定，并用β 3-微管蛋白抗体（Al和B1，绿色）和德克萨斯红鬼笔环肽（A2和B2) 染色。A3-B3是A1-A2和B1-B2的重叠，其中核用DAPI (蓝色）染色。C、D和E显示总的 (C，p=0. 0056)、最长（D，p〈0. 0001)和次最长（E，p=0. 0782)神经突长度的测量值。与具有 多个对称神经突的接种在对照PDL基质上神经元相比（72%相对于18%)，在rHIgM12上生长 的神经元带有较少神经突（F，p〈0. 0001)，且大多数为3期神经元（G)。统计分析显示平均 值土 SEM (非配对t检验）。
[0065] 图19. rHIgM12驱动轴突形成海马神经元在接种在TOL (A)、TOL+层粘连蛋白 (B)或rHIgM12 (C)的基质上后12小时用Taul (A1-C1，绿色）或MAP2 (A2-C2,蓝色）染 色。A3-C3是Al-Cl和A2-C2的重叠，将F-肌动蛋白（红色）用德克萨斯红鬼笔环肽标记。 D-F显示在通过短划线标示的Al-Cl中，沿自细胞体到生长锥的最长神经突的相对Taul强 度。Taul染色不对称地富集在于rHIgM12和层粘连蛋白基质两者中生长的3期神经元中的 最长神经突远部。
[0066] 图20. rHIgM12结合识别神经元膜在固定后，将DIV3海马神经元用rHIgM12、 霍乱毒素 B (CTB，Alexa Fluor 594)和菲律宾菌素三重染色（A)。rHIgM12 (Al)均匀地 标记神经元表面，其模式类似于分别用CTB或菲律宾菌素标记的GMl (A2)或胆固醇（A3) 的模式。然而，用rHIgM12在37°C下处理30分钟后，膜结合的rHIgM12在神经元表面聚集 (B1-C1)。用rHIgM12处理导致胆固醇（B2)和GMl (C2)两者的群聚，其与聚集的rHIgM12 共定位（B3-C3)。B和C底部的下小图是方框标示区域的更高放大倍数，表明生长锥区中聚 集的rHIgM12 (绿色）与群聚的胆固醇（蓝色）或GMl (红色）共定位。
[0067] 图21. rHIgM12与神经元膜微结构域中的GMl共定位A. DIVl海马神经元 首先用4%低聚甲醒固定，然后经rHIgM12染色。rHIgM12标记较小的点结构（punctum structure)。B.将活的DIVl海马神经元冷却到4°C达30分钟，然后用rHIgM12标记，接 着用抗β-III-微管蛋白抗体染色（在固定后）。rHIgM12使神经元表面上大得多的点形 成染色。C.活的DIV3海马神经元用甲基-β-环糊精在37°C下处理30分钟以消耗胆固 醇，然后冷却至4°C。固定的神经元然后用rHIgM12 (绿色）和霍乱毒素 B (红色）染色。 rHIgM12与较大的点（其与由霍乱毒素 B标记的GMl共定位）结合。下小图显示方框标示 区域的更高放大倍数。
[0068] 图22. rHIgM12与脂筏结合使活的DIV7皮质神经元在4°C下与rHIgM12或对照 IgM抗体结合30分钟。A.神经元在抗体结合后洗涤3次，在含有0. 5% NP-40的缓冲液中 裂解。裂解物通过在4°C下微量离心分离，上清液和沉淀两者用抗人IgM第二抗体进行印迹 法。与不与神经元结合并洗掉的对照IgM抗体相比，rHIgM12在沉淀和上清液两者中均有 分布。下小图显示加载等量的蛋白质的各个考马斯染色凝胶。B.在含有1% Triton X-100 的缓冲液中裂解的神经元在4°C下以蔗糖梯度通过超速离心分级分离。相继针对rHIgM12、 窖蛋白-1、转铁蛋白受体、β3-微管蛋白（B3-Tub)和β-肌动蛋白，用特异性抗体对所得 级分进行印迹法。rHIgM12位于含有窖蛋白-1和β 3-微管蛋白的低密度级分。较高密度 级分含有转铁蛋白受体、β 3-微管蛋白和肌动蛋白。一些rHIgM12定位于去污剂不溶性沉 淀，所述沉淀主要由微管蛋白中富含的细胞骨架蛋白构成。大部分肌动蛋白进入去污剂可 溶性较高密度级分。
[0069] 图23. rHIgM12与微管结合A.首先将DIVl海马神经元在37°C下用rHIgM12处 理30分钟，然后用含有4%低聚甲醛和0.1% Triton X-IOO的缓冲液同时固定并提取，接着 针对rHIgM12 (绿色）、β3-微管蛋白（蓝色）和F-肌动蛋白（红色）进行染色。rHIgM12 结合去污剂不溶性分子，所述去污剂不溶性分子与沿神经突干（neurite shaft) (A 2和4) 和在生长锥中心域的束状微管共定位，但不与位于生长锥周围的F-肌动蛋白共定位（A 3 和4)。B.使DIV7皮质神经元先结合rHIgM12,然后在0. 5% NP-40中裂解。对上清液进行 免疫共沉淀。rHIgM12和β 3-微管蛋白两者彼此免疫共沉淀。
[0070] 图24.提出的rHIgM12促进轴突形成的机制Α.神经元膜含有筏微结构域 (raft microdomain)和非後微结构域（nonraft microdomain)两种。在神经兀膜均勻分布 的筏微结构域分隔成两个库。它们之一与微管结合。B. rHIgM12的结合诱导筏微结构域群 聚，这促进了微管稳定并锚定神经元膜。C.在神经突增生期间，通过与rHIgM12相互作用， 生长锥探测环境，而筏微结构域群聚。结果，微管稳定于rHIgM12接触部位并锚定神经元 膜，这促进图3和图6中观察的生长锥周围至中心域转换，其中浸泡施用的（bath-applied) rHIgM12在生长锥中心域聚集。
[0071] 图25. rHIgM12不与微管蛋白直接结合A. N2A成神经细胞瘤细胞用rHIgM12 (Al,绿色）和β 3-微管蛋白（A2,红色）染色。核用DAPI (A3,蓝色）标记。N2A细胞是 rHIgM12染色阴性的，但表达β3-微管蛋白。Β.将Ν2Α细胞裂解物的上清液与rHIgM12 - 起孵育，与rHIgM12结合的分子被蛋白质-L琼脂糖拉下（pulled down)，并进行Western印 迹法。rHIgM12不与沉淀结合。β 3-微管蛋白不被rHIgM12拉下，但在上清液中检测到。
[0072] 图26. rHIgM12拉下肌动蛋白，但不与F-肌动蛋白共定位A.在固定后，先将 DIVl活的海马神经元在4°C下用rHIgM12 (A1，绿色）染色，将F-肌动蛋白（A2,红色）用 德克萨斯红鬼笔环肽标记。在生长锥区，F-肌动蛋白收缩，且在中心域富集，而rHIgM12使 生长锥表面上点结构均匀染色，这就标记了生长锥的最边缘。B.少量肌动蛋白被rHIgM12 拉下，3种所测的抗肌动蛋白抗体无一在免疫沉淀反应中起作用。位于与β3-微管蛋白类 似位置的条带是用空心箭头标示的IgG重链。
[0073] 图27 (a)细胞膜将在有数千纳米孔（大小为200 nm)穿孔的薄金膜上重构。（b) 悬浮金膜与两侧的缓冲溶液接触。
[0074] 图28.与神经元结合的人抗体促进神经突延伸。将神经元接种在用人IgM包被 的基质上，使之生长24小时后，用抗神经丝进行免疫标记。与非许可性人IgM (B)相比， sHIgM42诱导增生（A)。
[0075] 图29.与神经元结合的人抗体使膜结构域群聚。在0°C下进行体细胞（soma)和 轴突上的均匀免疫标记（A)。当细胞升温至15°C达15分钟时，sHIgM42定位在轴突细胞表 面上更多的分散斑块上（B)。
[0076] 图30.促进神经突延伸的人抗体体内靶向损伤部位。将抗体i.p.施用于患有慢 性SCI的小鼠，4小时后取出脊髓，在脊髓横切面中检测人IgM。来自施用抗体的小鼠的脊 髓受损区显示结合带荧光标签的抗人IgM的平行纤维（A)。来自施用对照人IgM的小鼠的 脊髓受损区不含人IgM (B)。
[0077] 图31.脊髓挤压伤。显微照片显示来自对照小鼠（A)或8 g Fejota夹压迫后30 天小鼠（B)的H&E染色脊髓的典型外观。压伤与广泛炎性细胞浸润、运动神经元丧失有关。
[0078] 图32. TMEV感染小鼠自发性夜间活动的实例。A)在64天时间内水平活动原始完 整记录。多夜间活动和少昼间活动易于理解。因为小鼠正常在夜间活动，因此我们选择夜 间活动用于分析（6PM-6AM)。然而，通过目视检查水平（B)或垂直（C)活动中的未过滤压缩 记录，可能难以鉴定真实的长期改变。
[0079] 图33.单次i. p.剂量的神经元结合抗体（rHIgM12)改善慢性感染SJL小鼠的水 平活动。在90dpi将3组（5只SJL小鼠）放入AccuScan活动监测箱。在8天时间内收 集基线测量。在治疗后，在8周内连接监测小鼠。小图A、C和E对应于水平活动，B、D和F 对应于垂直活动。A、B)作为每天的箱（bins)提供的平均夜间活动，表明仅在rHIgM12治 疗组的水平活动有改善；C)高斯滤波（GB=2天）和E)标准化Z值的6阶多项式拟合得出 rHIgM12治疗小鼠中清楚明显的改善。B、D和F)垂直活动不受任何治疗影响。活动（垂直 标度）是每小时光束中断次数。参数GB可解释为半高时滤波器半宽的值（以天计）。随着 GB值增加，标准差降低。给出每天的逐点95%置信带。
[0080] 图34.通过使用预测模型值在90dpi的3种治疗的比较。在治疗之前和之后每天 进行统计分析。与对照IgM治疗和盐水治疗小鼠相比,在治疗后第7天（p=0. 045)和第11 天（p=0. 042)，rHIgM12治疗小鼠的水平夜间活动分别显著偏离/改善（用黑色箭标示）。 给出每天的逐点95%置信带。
[0081] 图35.当在疾病早期施用时rHIgM12改善SJL小鼠的水平和垂直两种活动。在 45dpi将5只SJL小鼠3组放置在AccuScan活动监测箱中。在8天时间内收集基线测量。 在治疗后，在8周内连接监测小鼠。小图A、C、E和G对应于水平活动，B、D、F和H对应于垂 直活动。A、B)水平和垂直活动的原始未滤过记录；C、D)作为每天的箱（bins)提供的平均 夜间活动；E、F)高斯滤波（GB=2天）；和G、H)标准化Z值的6阶多项式拟合显示rHIgM12 治疗组中水平和垂直两种活动皆改善。对照IgM治疗组和盐水治疗组显示整个研究中运动 活动水平相似。给出每天的逐点95%置信带。
[0082] 图36.通过使用预测模型值在45dpi的3种治疗的比较。在治疗之前和之后每天 进行统计分析。A、C)与对照IgM治疗和盐水治疗小鼠相比，治疗后第13天（p=0. 015)和 第9天（p=0. 036)，rHIgM12治疗小鼠的水平夜间活动分别显著偏离。B、D)治疗后第14天 (ρ=0· 019)和第6天（ρ=0· 037)，rHIgM12治疗小鼠的垂直（直立（rearing))活动分别偏 离/改善。黑色箭头表示开始显著改善的日期。给出每天的逐点95%置信带。
[0083] 图37.正常未感染SJL小鼠具有不受任何治疗影响的高度可变的自发活动。将5 只未感染SJL小鼠3组放入AccuScan活动监测箱。在8天时间内收集基线测量。在治疗 后，在8周内连接监测小鼠。任何治疗都不引起水平（A、C、E和G)或垂直（B、D、F和H)活 动改变。给出每天的逐点95%置信带。
[0084] 图38.单剂量的人抗体延长SODl G86R突变体转基因小鼠的存活。在55日龄时， 小鼠用单剂量的rHIgM12或PBS治疗。一些小鼠则未治疗。跟踪小鼠直到漸死,然后处死用 于病理学。一些小鼠死于疾病。所有小鼠在死亡前都有极度的体重减轻。使用Kaplan-Meir 曲线绘制存活率，使用非参数Mantel-Cox检验确定统计显著性。与PBS治疗或未治疗小鼠 相比，用rHIgM12治疗的小鼠中存活率提高，P=O. 008。所有分析和治疗以不知情方式进行， 使得做出处死小鼠决定的研究人员不了解治疗组。在该分析中研究了共45只小鼠。同窝 野生型SOD +/+小鼠具有正常的存活率且无体重减轻（数据未显示）。
[0085] 图39表示在50日龄时施用单次200 Pg剂量的rHIgM12的小鼠与施用PBS的对 照小鼠中，G86R SODl小鼠的体重减轻作为时间的函数。施用rHIgM12的小鼠显示在单次 抗体注射后，在60天时间内较少体重减轻。
[0086] 图40. SODl G86R突变体转基因小鼠中单剂量的人抗体减少脊髓轴突变性。在55 日龄时，小鼠用单次250 μ g剂量的rHIgM12或PBS治疗。一些小鼠则未治疗。在位于胸正 中水平的脊髓中，统计变性轴突特有的髓磷脂螺环（whorl)的数目。与PBS治疗（P=O. 003， T检验）和未治疗小鼠相比，用rHIgM12治疗的SODl突变体小鼠的变性轴突数减少。注意， 与SODl+/+突变体小鼠相比，野生型SOD-/-小鼠脊髓中的变性轴突数最少。在处死时，小 鼠用Trump固定液（4%甲醒，0· 1%戊二醒（gluataraldehyde))灌注，将脊髓切成Imm块。 将块包埋在Araldite塑料中，将来自T6水平的1微米切片用对苯二胺染色以显现髓磷脂 环绕（wrapping)。显示野生型SOD-/-(右上）和SODl+/+突变体（右下）的脊髓切片。 [0087] 图41.单剂量的人抗体保护SODl G86R突变体转基因小鼠脊髓中的前角和后角 神经元两者。在55日龄时，小鼠用rHIgM12或PBS治疗。一些小鼠则未治疗。在胸正中水 平处脊髓的石蜡切片中，统计用特异性标记神经元的抗NeuN抗体染色的前角和后角细胞 数目。rHIgM12治疗小鼠中前角和后角细胞的数目比用PBS治疗的小鼠或未治疗小鼠显著 更多（P=O. 0025和P=O. 018,通过T检验）。用rHgM12治疗的SOD突变体小鼠的前角和后 角细胞的数目与野生型SOD-/-小鼠中观察到的数目类似。
[0088] 图42.重组人抗体rHIgM12与各物种的神经元结合。小鼠皮质神经元（A、B、C、 D)、小鼠海马神经元（E、F)和人皮质神经元（G、H)用rHIgM12 (A、C、E和G)活染，相同细 胞用抗神经丝抗体（B、D)或β微管蛋白（F、G)共标记。rHIgM12用带荧光标签的第二抗 体检测。
[0089] 图43.⑶-1小鼠中的脑缺血。A.显示24H时脑缺血区域（高信号区域）的 DWI-MRI图像扫描。B.脑缺血之后小鼠脑上的缺血性损伤（脑右半球上的灰白圆形区域）。 C.显示受损组织（黑色突出显示）的x4 H&E切片。
[0090] 图44.神经元结合抗体（rHIgM12)的单次i. p.剂量改善经受光血栓形成脑缺血 的CDl小鼠中的水平㈧和垂直⑶活动。小鼠用200 Pg rHIgM12 (n=5)或PBS (n=5) 的单次剂量治疗。rHIgM12治疗组中的活动从第三天改善。C.在小动物MRI系统中扫描小 鼠，以测量图中表示为mm 3的脑缺血的总体积。
[0091] 图45. MT-MRI量度表明改善结果。使小鼠经受脑缺血并用rHIgM12或PBS治疗。 缺血性损伤后三天，计算脑的缺血（红色轮廓）和对侧（绿色轮廓）半球的MTR图（A小 图）。与用PBS治疗的组相比，用rHIgM12治疗的组表明中风ROI内MTR的相对增加（小图 B，蓝色条代表在对照侧上计算的值）和中风体积的降低（小图C)。
[0092] 图46.在聚-D-赖氨酸上生长5天且在缺氧条件（2. 7 % 02，5 % CO2)下孵育 4-44小时的皮层神经元（CN)的Western印迹分析。显示与对照（44小时，在印迹中孵育0 小时）相比缺氧处理4小时、21小时和44小时之后裂解的胱天蛋白酶-3的水平的代表性 印迹。
[0093] 图47描绘了显示来自使用髓鞘标志物MBP和凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3的 三次独立实验的Western印迹的定量分析的条形图。使混合胶质细胞培养物在含有FBS (10 %)的培养基中生长4天，并在具有促进髓鞘再生的IgM rHIgM22、再生的mAb rHIgM12、同种 型对照sHIgM116 (各10 yg/ml)的化学定义的培养基或仅培养基中处理7天。每两天更 换具有新鲜抗体的培养基。在4天结束时，使用Western印迹评价培养物的MBP或胱天蛋 白酶-3,通过OD/面积定量，并绘图。
[0094] 图48提供了显示各种蛋白和标志物的水平的代表性Western印迹：少突胶质细 胞祖细胞（OPC)标志物I3DGFa R、髓鞘标志物CNPase和M0G、小胶质细胞标志物⑶68和 Lyn、增殖标志物Ki-67和组蛋白H3、凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3和细胞周期标志物 pRbS795。将OPC-小胶质细胞共培养物在具有促进髓鞘再生的mAbs A2B5、04、01、78. 09、 94. 03、rHIgM22,再生的 mAb rHIgM12,同种型对照（LEAF、5A5、ChromPure IgM、rHIgM42、 SHIgM14、SHIgM24、sHIgM26)(各10 yg/ml)的星形胶质细胞条件培养基或培养基中培养， 如所示。
[0095] 图49描绘了显示来自使用标志物⑶68 (用于活化的小胶质细胞）和Lyn激酶（小 胶质细胞中的高丰度激酶，在OPC中程度较低，但在星形胶质细胞中不存在）的三次独立实 验的Western印迹的定量分析的条形图。混合培养物（0PC小胶质细胞共培养物）用如上 对于图48所述的抗体处理并标明。
[0096] 图50提供了代表性免疫荧光图像，其显示在mAb处理之前培养第4天和用 rHIgM12、rHIgM22和同种型对照sHIgM24 (各10 Pg/ml)处理7天之后培养第11天混合 胶质细胞培养物中CD68 (绿色）和核标志物DAPI (蓝色）的水平。
[0097] 图51提供了显示缺氧诱导因子1(HIF1 α)、少突胶质细胞标志物NG2、TOGFa、 〇lig-2、髓鞘标志物MBP和CNPase、星形胶质细胞标志物GFAP、小胶质细胞标志物⑶68、细 胞周期标志物pRbS795和凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3的水平的代表性Western印迹， 其中β肌动蛋白用作上样对照。使混合胶质细胞培养物在含有FBS (10 %)的培养基中生 长4天，并在缺氧条件（3 % 02)(与常氧条件（21% 02)相比）下在化学定义的培养基中处 理直至额外7天。如所示在第1、3、5和7天通过Western印迹评价蛋白。
[0098] 图52描绘了图51的Western印迹的定量分析，以提供蛋白标志物的表达的定量 值和蛋白标志物的缺氧和常氧条件的比较。
[0099] 图53提供了增殖标志物Ki-67、小胶质细胞标志物IBA-1、⑶68和iNOS、凋亡标志 物裂解的胱天蛋白酶-3、星形胶质细胞标志物GFAP、细胞周期标志物pRbS795和pRbS80、 少突胶质细胞标志物H)GF a R、NG2、01ig_l和01ig-2和髓鞘标志物MBP的代表性Western 印迹。使混合胶质细胞培养物在常氧条件下在含有FBS (10 %)的培养基中生长4天，随后 在缺氧（3 % 02)下在具有人再生抗体rHIgM12的化学定义的培养基或仅培养基中处理1-7 天。
[0100] 图54提供了显示在常氧和缺氧条件下生长且用rHIgM12或rHIgM22抗体处理（相 比于单独的培养基）的第7天混合培养物中小胶质细胞标志物IBA-I和CD68、细胞凋亡标 志物裂解的胱天蛋白酶-3、星形胶质细胞标志物GFAP、少突胶质细胞标志物TOGF a R、NG2、 01ig-2和髓鞘标志物MBP和CNPase的水平的代表性Western印迹。将混合胶质细胞如前 所述培养，并在缺氧或常氧条件下在具有rHIgM12、rHIgM22的化学定义的培养基或仅培养 基中处理7天。
[0101] 图55提供了来自P13的缺氧和常氧C57/B16新生小鼠的皮层的各种标志物的 RT-PCR分析。C57/B16新生小鼠通过CDl母兽（dams)交叉培育，并从P3至P7暴露于缺氧 (10% 02) 4天。随后将小鼠暴露于室内空气，持续额外6天，并在P13处死。从两个处理组的 皮层中分离RNA，并探测髓鞘标志物PLP1、MOG、MBP1、少突胶质细胞祖细胞标志物TOGF a R 和Olig-I、星形胶质细胞标志物GFAP、神经元标志物巢蛋白和β 3-微管蛋白、缺氧诱导因 子Ia和肌长蛋白蛋白SSPN。表达水平通过RT-PCR分析，并将结果针对β肌动蛋白的水 平均一化。
[0102] 图56提供了表明如各小图中所注来自对照（假操作）和中风小鼠（孟加拉玫瑰红 方案）的各种组织中放射性标记的rIgM12抗体（如所示通过放射性测量为cpm/?θθμ?)的 量的图。在中风后30至40 min，将500 ul体积盐水中10百万cpm的35S标记的rHIgM12(约 60 ug IgM)腹膜内施用于每只小鼠。在IgM处理后6、12和24小时，从小鼠收集血液，用 30 ml生理盐水洗涤脉管系统，并快速收集组织。对于中风组织中放射性标记的分析，将含 有病变区域的脑右前皮质去除，作为75 mg组织块（在小图中表示为脑）。去除一部分其他 组织，称重并处理。CB=小脑，cord=脊髓。
[0103] 发明详沭 根据本发明，可采用本领域技术人员所掌握的常规分子生物学、 微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中有完整解释。参见例如
【权利要求】
1. 分离的人IgM抗体或其片段，其特异性地结合神经元并保护神经元免于细胞死亡， 并且其不促进髓鞘再生，其中所述抗体或片段包含下列序列： (a) 如图5中所示的可变重链氨基酸⑶R结构域序列CDRI GGSVSLYY (SEO iD N0.3〗} 、CDR2GYIYSSGST(SEQ ? NO:32:和 CDR3.ARSASIRSWro (SEQID 嶋:33：,及轻链 CDR 序列 CDRi QSISSY {SEQ !0N0; 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36) ； ^ (b) 如图6中所示的可变重链氨基酸CDR结构域序列CDR! GRfSTYA {SEO ID NO: 37} 、001?2_00^11味0 0?:38:'和〇^3￥1^50?0刚539細:既0?嶋:39),及轻链〇)1?序列 CDF? QGIG (SEQ ID NO: ?)、CDR2 HS (SEO ID N0:41}和 C0R3 QKYNSAPRT (SEO ID NO: 42), 其用于治疗或减轻脑缺血或中风，改善中风或脑缺血之后动物中的神经功能，或保护 神经元或神经细胞免于中风或脑缺血之后的损害或细胞死亡。
2. 权利要求1的分离的抗体，其包含SEQ ID NO: 1中所示的可变重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 11中所示的可变轻链氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 17中所示的可变重链氨基酸序 列和SEQ ID N0:27中所示的可变轻链氨基酸序列，或者其高度同源的变体，其中所述变体 保持神经元结合和神经保护或神经再生活性。
3. 权利要求1的分离的抗体，其是重组抗体rHIgM42并包含如图6中所示的SEQ ID NO: 17中所示的可变重链氨基酸序列和SEQ ID NO:27中所示的可变轻链氨基酸序列。
4. 权利要求1的分离的抗体，其进一步包含人J链序列。
5. 权利要求4的抗体，其中所述J链包含SEQ ID NO: 15中所示的氨基酸序列。
6. 权利要求4或5的抗体，其是重组抗体rHIgM12并包含SEQ ID NO: 1中所示的可变 重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 11中所示的可变轻链氨基酸序列。
7. 权利要求5的分离的抗体或片段，其是包含重链和轻链可变区的完全人抗体或其抗 体片段，或者其高度同源的变体，所述重链和轻链可变区含有选自氨基酸序列SEQ ID N0:1 和11的氨基酸序列，其中所述变体保持神经元结合和神经保护或神经再生活性。
8. 权利要求1-7中任一项的分离的抗体或其片段，其用于中风、创伤性脑损伤（TBI)、 脑缺血或其中对脑或脑细胞或神经细胞存在血流或氧不足的其他病况。
9. 权利要求1的分离的抗体，其配制用于治疗或减轻中风或脑缺血，并组合有一种或 多种作为溶栓剂、抗血小板药、抗高血压药或他汀类药物的药剂。
10. 权利要求1-7中任一项的抗体，其标记有可检测标记或功能标记。
11. 权利要求10的抗体，其中所述标记是酶、特异性结合配偶体、配体、染料、荧光标签 和/或放射性元素。
12. 分离的核酸，其包含编码权利要求1-7中任一项的抗体或片段的序列。
13. 制备权利要求1-7中任一项限定的抗体或片段的方法，其包括在引起所述抗体或 片段表达的条件下表达权利要求12的核酸，和回收所述抗体或片段。
14. 用于治疗或减轻中风或脑缺血的药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项限定 的抗体或片段和药学上可接受的媒介物、载体或稀释剂。
15. 用于治疗或减轻动物中的中风或脑缺血的试剂盒，其包含权利要求14的药物组合 物的药物剂型和含有一种或多种另外的神经活性剂或治疗剂、溶栓剂、抗高血压剂、抗血小 板剂、抗炎剂、神经递质释放调节剂、神经受体配体或激动剂或拮抗剂、钙通道药剂、免疫调 节剂、或其他CNS反应性抗体的单独的药物剂型。
16. 用于治疗或减轻动物中的中风或脑缺血的方法，其包括向疑似或确定患有中风或 脑缺血的动物施用有效量的权利要求14的药物组合物。
17. 权利要求16的方法，其中所述组合物作为单一剂量施用于所述疑似或确定患有中 风或脑缺血的动物。
18. 用于检测患有或疑似患有中风或脑缺血的哺乳动物的神经损伤、死亡或损害的存 在情况或程度的方法，其包括： A. 将来自其中怀疑中风或脑缺血的哺乳动物的生物样品与权利要求1-7中任一项的 抗体或片段在允许所述抗体或片段与所述样品中的神经元结合发生的条件下接触；和 B. 检测来自所述样品的所述神经元与抗体间是否已发生结合或者测定来自所述样品 的所述神经元与抗体已发生结合的量； 其中检测到结合表明在所述样品中存在神经细胞损伤、死亡或损害，且结合的量表明 神经细胞损伤、死亡或损害的相对量。
【文档编号】A61K39/395GK104379167SQ201380027368
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年4月17日 优先权日:2012年4月17日
【发明者】M.罗德里格斯, A.E.沃林顿, L.R.皮斯 申请人:梅奥医学教育和研究基金会