蔓越莓木葡聚糖低聚糖组合物的制作方法
【专利摘要】一种由蔓越莓花萼经酶处理的组合物制备的组合物，其能减少或抑制微生物与具有用于粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附。
【专利说明】蔓越莓木葡聚糖低聚糖组合物
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种新的木葡聚糖低聚糖组合物，该组合物被命名为抗微生物粘附抑 制性级分A6, 一种含有所述包含抗微生物粘附抑制性级分A6的低聚糖组合物的组合物，和 使用所述组合物至少减少病原体粘附对动物细胞，特别是人和哺乳动物细胞粘附的方法。
【背景技术】
[0002] 木葡聚糖是公知的在双子叶植物和非鸭跖草科单子叶植物中发现的I型植物 细胞壁中的主要交联多糖（Carpita 和Gibeaut, Plant Journal, Volume 3，1_30，1993)〇 带一个0-(1-4)-葡聚糖骨架，木葡聚糖氢键结合到纤维素微纤维表面并且形成连接 细胞壁中相邻微纤维的网络。该木葡聚糖网络与细胞壁基质多糖的胶质网络相互交错 (Carpita和Gibeaut, 1993,见前）。这使得木葡聚糖成为初生细胞壁生长和形成中的重要 多糖（Carpita 和 McCann, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Buchanan B. B. , Gruissem, W. , Jones, R. L. , Eds. ；American Society of Plant Physiologists, Rockville，MD.，52-108, 2000)。木葡聚糖中存在似块状结构，其中6-11糖序列在整个 多糖中重复。因此，碳水化合物结构对植物分类群是特异性的（Sims等，Carbohydrate Research, Volume 293, 147-172, 1996 ;Vierhuis 等,Carbohydrate Research, Volume 332, 285-297, 2001 ;Ray 等，Carbohydrate Research, Volume 339, 201-208, 2004 ;Hoffman 等，Carbohydrate Research, Volume 340,1826-1840,2005)。3 种木葡聚糖结构已被描述 具有岩藻半乳-木葡聚糖，岩藻糖半乳糖-木葡聚糖最常分布在单子叶植物分类学的目中 约一半，和所有除茄目、唇形目、龙胆目、杜鹃花目外的双子叶植物目的植物中（Carpita和 McCann 2000,见前；Hoffman等2005,见前）。来自这些后一目的木葡聚糖含有阿拉伯糖 基-木葡聚糖结构。少量的第三种木葡聚糖结构同样在鸭跖草科单子叶植物中（禾本科植 物草，凤梨科植物，棕榈，和柏树）作为在纤维素骨架上随机分布的单一木糖取代基存在 (Carpita和McCann, 2000，见前）。单一字母命名被开发用于描述木葡聚糖取代基的顺序 (Fry 等，Physiol. Plant.，Volume 89, 1-3, 1993) 〇
[0003] 蔓越莓汁是酸性的（pH约2. 6或更低），富含花青素和赋予它涩味的丹宁酸 (Holmes 和 Starr,Fruit Juice Processing Technology, Nagy, S. , Chen, C. S. , Shaw, P. E. (Eds. )，AGSCIENCE，Auburndale，FL, 515-531, 1993)。果汁是在用热的市售果胶酶浸 软（约50°C作用约1小时）浆果后经研磨和压榨而制备的。蔓越莓胶质具有非常高的 甲氧基含量，在压榨后和果汁过滤和浓缩前需要二次的热的市售果胶酶处理。蔓越莓汁 被认为是一种健康的果汁。原花色素具有抗氧化特性（Uri-Sarda等，Anal.Bioanal. Chem，Volume394, 1545-1556, 2009)，并且被报道能抑制P-伞状大肠杆菌与尿路上皮细胞 的粘附（Howell 等，Phytochem.，Volume 66,2281-2291,2005)。P-伞状大肠杆菌是引 发尿路感染的主要原因，其造成每年830万的医院就次数（Zopf和Roth, Lancet, Volume 347, 1017-1021，1996)。蔓越莓汁也被报道具有益生特性（Clifford等，美国专利申请号 20090022849, 2009)〇
[0004] 最近，Coleman等（于 07/13/2010 提交AmericanSocietyofPharmaconosy,St. PetersburgBeach,FL的报告）用蔓越莓汁粉喂猪并从尿中分离出低聚糖或氨基糖，其能 够抑制由尿路致病性大肠杆菌引发的红细胞凝集。相同的a-Gal-(l-4)-f3_Gal受体是红 细胞凝集和P-伞状大肠杆菌与尿路上皮细胞粘附所必须的（Howell等2005,见前）。因此， 非源自原花色素的碳水化合物，被报道具有细菌抗粘附特性（Coleman等2010,见前）。果 胶的低聚糖抑制大肠杆菌的产维罗毒素菌株和肠道致病菌株与HT29细胞的粘附（Rhoades 等J.FoodProtect.，卷71，2272-2277, 2008)。所以，植物细胞壁低聚糖优先地具有细菌抗 粘附特性。然而，蔓越莓植物细胞壁低聚糖的结构仍然未知，且Coleman等（2010,见前） 并未报道低聚糖如何在尿排泄前被胃肠道吸收。
[0005] 对中和和/或从宿主机体，如人和家畜，去除细菌和细菌成分的现有治疗方案很 大程度上基于抗生素的使用。自20世纪40年代引入抗生素药以来，抗生素药被证明对许 多细菌相关疾病是有效的。然而，它们时常被滥用已导致抗生素耐药性细菌菌株的产生，这 需要开发和使用越来越更强效的药物。医院内的细菌感染在不断增加，导致严重病患的病 例激增，在某些情况下，甚至出现危急性命的症状。例如，尿路感染（UTI)是一个普遍的卫 生保健问题。UTI通常定义为尿中出现>100, 000细胞/毫升的细菌。UTI普遍地由革兰氏 阴性细菌，特别是大肠杆菌（E.coli)引起，并主要感染女性。这种感染是由细菌与尿道上 皮细胞粘附并定植所致。大肠杆菌的粘附是通过细菌细胞壁上的蛋白质性纤维（菌毛）进 行的，蛋白质性纤维能够附着在尿路上皮细胞上特异性的低聚糖受体。抗生素是常规开处 方用于治疗，但常常提高细菌的耐药性。四分之一的女性也出现感染复发且经常被发现更 易于这些感染。能治疗和预防UTI的自然物质可被用于那些在许多情况下因抗生素治疗而 导致患有这种病况的患者，如需要后续抗真菌治疗的继发性阴道酵母感染。
[0006] 已有大量文献报道蔓越莓植物营养素在预防和减轻尿路感染（UTI)中的作用，特 别是革兰氏阴性尿路致病性细菌大肠杆菌，是UTI的最常见病因（Lavigne等，Clinical MicrobiologyandInfection,Volume14, 350-355, 2008 ；0feck等,Advancesin ExperimentalMedicineandBiology,Volume408, 179-183, 1996 ;0feck等，NewEngland JournalofMedicine,Volume324, 1599, 1991)。已发现食用蔓越莓在解决UTI感染有一定 的效果。蔓越莓产品能防止某些细菌菌毛与尿道的尿道上皮细胞的粘附，由此减少细菌产 生感染的能力?iMartino等，WorldJournalofUrology，2〇〇6) ;(Liu等，Biotechnology Bioengineering, 2006)。在蔓越莓汁中发现的原花色素，其是浓缩的丹宁酸，被证实抑制 大肠杆菌粘附（Howell等，JournalofMedicine, 1998)。于2009年公布的美国专利申请 2009/0226548,指出一些大肠杆菌菌毛特异性地结合到D-甘露糖，不像蔗糖或果糖，D-甘 露糖在人体内代谢非常慢，因此一旦摄入，D-甘露糖会进入血流并通过肾快速移动至排泄， 接着进入膀胱中的尿中。D-甘露糖一旦出现在尿中将会导致对D-甘露糖结合敏感的细菌 菌毛粘附于D-甘露糖，而不是上皮细胞。这使得机体从体内清除与D-甘露糖结合的大肠 杆菌。另外，D-甘露糖能够逆转与上皮结合的大肠杆菌竞争性地阻断尿路感染的初发期。 为了减轻现有的UTI和防止复发，定期摄取蔓越莓以及D-甘露糖将防止细菌粘附、定植并 最终防止不可控的尿路感染。这个文献进一步认为为了实施这个策略，需要消费者的配合。
[0007] 细菌和真菌感染的其他治疗有使用肉桂（Cinnamonmumcassia)提取物。肉桂的 抗微生物作用可部分归功于存在主要抗细菌的肉桂醛、丁香酚、冰片、芳樟醇（linool)和 麝香草酚，以及主要抗真菌的邻-甲基肉桂醛。
[0008] 对于用于至少减少抑制细菌与人和哺乳动物细胞的粘附和用于减少或抑制致病 性细菌入侵和感染人和哺乳动物细胞的营养和治疗组合物以及方法仍然存在着需求。以下 描述的本发明包括这样的组合物和方法，它们与相关技术的组合物和方法不同。
【发明内容】
[0009] 因此本发明的一个目的是提供一种制备自经酶处理的来自美洲蔓越橘 (VicciniumMacrocarpon)的蔓越莓花萼的组合物，其至少减少微生物与具有用于粘附的 a-Gal-(1_4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种制备自经酶处理的来自美洲蔓越橘的蔓越莓花 萼的组合物，其中所述组合物包含乙酰化、富含中性糖的多糖，所述多糖的重均摩尔质量为 约10. 2X103±2. 0Da，Z平均流体力学半径为约2. 0±0. 2nm，重量-平均特征粘度为约 0. 048±0. 0001dL/g。
[0011] 本发明的又另一个目的是提供一种用于防止细菌与具有用于粘附的 a-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附的方法，其中将具有乙酰化、富含中性 糖的多糖的组合物施用于具有用于粘附的a-Gal-(1_4)-Gal末端低聚糖受体的细胞，所 述多糖的重均摩尔质量为约10. 2X103±2.ODa，Z平均流体力学半径为约2. 0±0. 2nm，重 量-平均特征粘度为约〇.〇48±0.001dL/g。
[0012] 从下面的描述本发明的其他目的和有益效果将是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为显示蔓越莓级分的低聚糖分析的图。木葡聚糖低聚糖的DP在每个峰的上 方指示。
[0014] 图2为蔓越莓的A6级分的MALDI-T0F质谱扫描。
[0015] 图3六和8为111/^ = 1055.32〇\)的串联嫩0)1-1'0卩谱和111/^ = 1217.37(8)的串 联MALDI-T0F谱。
[0016] 图4和图4插图为基于MALDI-TOF/TOFMS.的木葡聚糖碎片的图。
[0017] 图5A-C是级分A6的NMR谱。
[0018] 图6为显示来自美洲蔓越橘的蔓越莓级分的抗粘附活性的图。
【具体实施方式】
[0019] 本发明提供了一种使用美洲蔓越橘由蔓越莓花萼经酶处理的组合物制备的组合 物。本发明的组合物包含合适的载体和有效量的作为活性成分的分离的抗微生物粘附抑制 性级分，所述组合物用作减少或抑制微生物与具有用于粘附的a-Gal-(1_4)-Gal末端低 聚糖受体的细胞的粘附的药剂。
[0020] 分离的粘附抑制性级分被命名为A6且表征为：A6包含乙酰化、富含中性糖的多 糖，其重均摩尔质量为约10.2X103±2Da，Z平均流体力学半径为约2.0±0.2nm，重量-平 均特征粘度为约〇. 〇48±0. 001dL/g。A6的单糖组成主要为葡萄糖、阿拉伯糖和木糖以及存 在非常少的半乳糖醛酸和鼠李糖，这指示多糖片段是半纤维素并且可能是木葡聚糖。
[0021] 本发明的组合物可以通过口服施用于患者。通常分离的抗微生物粘附抑制性级分 的浓度是减少细菌细胞与哺乳动物细胞，尤其是人细胞粘附的量，对其的确定在本领域技 术人员的能力范围内。
[0022] 鉴于发明的目的，以下为下文使用的某些术语的定义。
[0023] 当在说明书和权利要求书中使用时，除非上下文另外明确指示，否则单数形式 "一个"，"一种"，和"该"包含复数指代物。比如，术语"一个细胞"包括多个细胞，包括其 混合物。
[0024] 当在本文中使用时，蔓越莓被理解为美洲蔓越橘。
[0025] 术语木葡聚糖用于描述一组被称作半纤维素的多糖。木葡聚糖含有1，4-连接的 0 -D-吡喃葡萄糖基残基的骨架，在1，4-连接的-D-吡喃葡萄糖基残基中04处于赤道方 位。
[0026] 当在本文中使用时，术语分离的、纯化的或生物纯的，是指基本上或实质上不含当 以其天然状态存在时正常与其共存的组分的材料。在一个示例性实施方案中，纯度和均质 性使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶、电泳、或高效液相色谱来测定。
[0027] 当在本文中使用时，术语病原体是指非有益细菌、病毒、真菌、单细胞或多细胞寄 生虫，例如大肠杆菌，如产维罗毒素的大肠杆菌（VTEC)，肠道致病性大肠杆菌（EPEC)，产肠 毒素的大肠杆菌（ETEC)，或聚集性大肠杆菌（EAggEC)，金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林金黄 色葡萄球菌（MRSA)，艰难梭菌，硫酸盐还原细菌如脱硫弧菌（Desulfovibriosp.)，例如，脱 硫脱硫弧菌（Desulfovibriodesulfuricans)或Desulfovibriopiger〇
[0028] 当在本文中使用时，术语"控制"，或"控制的"，如在例如下列短语：大肠杆菌的 控制，控制大肠杆菌，控制大肠杆菌菌群，或控制大肠杆菌感染或任何语法上等同的表述 中，是指用于预防感染或侵袭，减少或消除已感染区域或有机体的群体，或消除大肠杆菌或 期望进行控制的其他物种的群体的任何手段。如本文所用的控制是指成功预防、消除、减少 或改善大肠杆菌、大肠杆菌感染或大肠杆菌菌群的任何指示。
[0029] 本发明的药物、营养或药学组合物被定义为具有本发明的至少一种活性成份和适 当的载体的组合物。适当的载体被定义为不会引起对活细胞或生物体明显刺激且不消除施 用的本发明的活性成分的生物活性和特征的任意物质。
[0030] 当在本文中使用时，治疗有效量是指引发期望生物反应所必须的量。如本领域普 通技术人员所理解的，生物活性剂的有效量可以根据诸如下面的因素变化，所述因素如期 望的生物终点、待递送的生物活性剂、包封基质的组成、靶组织等。
[0031] 当在本文中使用时，术语"级分"意指来自蔓越莓花萼经酶处理的浓缩物的任意 HPLC洗脱级分，所述HPLC洗脱级分能够控制在活生物体或活细胞群中的的大肠杆菌菌群。
[0032] 术语"尿路感染"或"UTI"是指影响尿路的任何部分的细菌感染。当细菌进入膀 胱或肾脏并于尿中繁殖时，它们引起UTI。UTI的最常见类型是膀胱感染，其也称膀胱炎。
[0033] 术语粘附是指细菌通过细菌表面上的粘附分子与彼此，与其他细胞表面，和与非 细胞表面的总体聚集。
[0034] 除非以其他方式定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的 普通技术人员所普遍理解的相同含义。术语"约"定义为加或减10%;例如约100°F意指 从90°F到110°F。尽管与本文所述的那些类似或等效的任何方法和材料可以用于实施 或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。
[0035]P-伞状粘附分子特异性地结合于一组被确认为P-血型抗原的受体。这种受 体存在于多种类型的人细胞，如尿道上皮细胞和红细胞的表面上，其介导细菌的附着以 及随后在尿道上皮的定植。P-伞状大肠杆菌导致人红细胞（RBC)聚集（HA)(Ofeck和 Doyle，BacterialAdhesiontoCellsandTissues,ChapmanandHall,Ltd.,Lond on，357-365, 1994)。
[0036] 本发明提供一种用于通过施加处于合适的载体中的减少细菌粘附量的分离的被 命名为A6的粘附抑制性级分来至少减少细菌的粘附的药物、营养或药学组合物和方法。这 种组合物可以以适合于治疗的多种方式给药。活性成份，A6可以单独给药或作为与在药学 上可接受的载体、稀释剂、辅料和媒介物组合的活性成份。组合物一般通过口服给药。常规 方法，如将化合物作为片剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂等施用是可用的。 用于经口或静脉内递送抗粘附组合物并保留生物活性的已知技术是优选的。可以经皮下、 局部或胃肠外或鞘内给药的制剂和输注技术以及栓剂和植入物也在本发明的考虑当中。
[0037] 药学上可接受的载体、稀释剂、辅料和媒介物以及植入物载体一般是指惰性的、无 毒的固体或液体填料、稀释剂，或不与本发明的活性成份反应的包封材料。适用于注射的药 物制剂包括无菌水溶液或分散体和用于重构成无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可 为溶剂或分散介质，包含例如水，乙醇，多元醇如甘油丙二醇、液体聚乙二醇等，及其适合的 混合物和植物油。
[0038] 适当的流动性可以通过使用如卵磷脂的涂层，在分散体的情况下通过维持所需的 粒度以及通过使用表面活性剂来保持。非水性媒介物如棉籽油，芝麻油，橄榄油，大豆油，玉 米油，向日葵油，或花生油和酯，如肉豆蔻酸异丙酯也可被用做用于复合组合物的溶剂。另 夕卜，可以添加增强组合物的稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧 化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种的抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、 苯酚、山梨酸等，可以确保阻止微生物的作用。可能合乎需要的是包括等渗剂，比如糖、氯化 钠等。可注射药物形式的长效吸收可以通过使用延缓吸收的药剂，如单硬脂酸铝、明胶等 来产生。使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂必须能与本发明的抗微生物粘附性级分A6配 伍。对递送系统的选择也在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0039] 对在本发明的抗微生物粘附抑制性级分A6中的木葡聚糖的鉴定通过使用碳水化 合物分析、高效尺寸排阻色谱法、MALDI-TOF/TOFMS和核磁共振光谱法进行。本发明的活性 木葡聚糖制剂被命名为抗微生物粘附级分A6,其包括以SSGG结构为优势嵌段序列的阿拉 伯糖-木葡聚糖。这是首个具有这种类型的木葡聚糖结构的杜鹃花目成员，但仅是在此目 之下被表征有木葡聚糖的第二种植物。一种新的木葡聚糖七糖被表征为SSG和GSS低聚糖 结构。在蔓越莓MALDI-TOFMS谱中SSG/GSS木葡聚糖七糖和SSGG木葡聚糖八糖是最丰富 的离子。NMR确认了利用质谱法阐明的蔓越莓木葡聚糖结构。蔓越莓木葡聚糖低聚糖在阻 断尿路致病性大肠杆菌和产维罗毒素大肠杆菌菌株与人上皮细胞的粘附方面是有活性的。
[0040] 用于从蔓越莓中分离抗微生物粘附级分A6的方法包括用Klerzymel50果胶酶 (DSM FoodSpecialities)或该酶家族中其他等效的果胶酶处理蔓越莓花萼的步骤。处理 典型地是在100-140° F的范围内进行水果脱果胶。用于30-45min脱果胶过程的用量为 大约为0. 035至0. 055重量％ (即每100镑水果用0. 035-0. 055镑酶），并且这可根据对 蔓越莓脱果胶期间时间或酶量的变化进行调整。碎片和其他颗粒物经倾析、离心或其他相 似方法除去。然后液体经喷雾干燥产生蔓越莓粉末并产生级分Al。A1的分级分离是利 用BiotageFLASH-40系统完成的，系统改为接收装有SNAPKP-C18-HS12g样品的Biotage SNAPKP-C18-HS120g柱。约20克级分A1溶解在约200ml去离子水（DI)中。约50ml(±5g) 的溶液加样到预平衡的C18-柱中（柱子用约300ml甲醇洗脱接着再用约300mlDI水洗 脱）。分级分离是从先用约500mlDI水洗脱柱子开始，接着用约500ml约15%甲醇/水（V/ V)混合物洗脱柱子（流速为约35ml/min)，以产生级分A2。残留的酚类内容物用约500ml 甲醇从柱子中洗去。柱子通过在再次加样更多的A1溶液（约50ml)前，用约500mlDI水 洗涤进行再次平衡。这个过程重复总计4次并且混合约15%甲醇/水的各部分以制备级 分A2。干燥级分A2 ;首先在真空状态（BuchiLaboratoryEquipment)下去除甲醇，接着冷 冻干燥水性溶液以产生约4. 97g粉红色粉末。使用示差折光检测对A2进行分析，观察到从 HPX-87CHPLC柱中在约6. 7min时洗脱的一个未知的峰。使用S印hadexLH20柱层析对级 分A2作进一步纯化以消除残留的酚类色素。故将级分A2 (约4. 8g)溶解在约60mlDI水 中，将混合物加样至45X300mm的S印hadexLH20柱中（用约500mlDI水预处理）。柱子 用约500mlDI水洗脱得到纯化的级分A6 (使用MasterflexL/S泵-型号为7014-52,流速 约为2. 5ml/min)。残留的酚类内容物用约75%丙酮/水溶液（约500ml)从柱子中洗去。 级分A6经冷冻干燥得到约4. 32g灰白色结晶粉末（含粉红色的痕迹）。
[0041] 实施例1
[0042] 聚合度（DP)约为7?9的木糖葡萄糖低聚糖购自于Megazyme(伯雷，爱尔兰）。 蔓越莓花萼经酶处理的命名为A1的浓缩级分是在蔓越莓脱果胶过程中使用Klerzyme150 果胶酶〇)SMFoodSpecialties)生产的。经C18快速色谱法对A1的分级分离产生约15% 甲醇级分（A2)。在A2级分中观察到一个未知的峰，此峰是使用示差折光检测从HPX-87C HPLC柱在约6. 7m/in时洗脱出来的。存在与A2相关的粉红色，利用LH20凝胶柱色谱将 其减少以消除酷类色素，产生A6。详细地，蔓越莓花萼用Klerzyme150果胶酶（DSMFood Specialties)或这个酶家族中的其他等效果胶酶处理。处理典型地是在约100?140°F 的范围内进行水果脱果胶。用于约30-45min脱果胶过程的用量为大约为0. 035至0. 055重 量％ (即每100镑水果用0. 035-0. 055镑酶），并且这可由对该方法了解的人根据时间或酶 的量的变化进行调整。碎片和其他颗粒物经倾析、离心或其他相似方法除去。然后液体经喷 雾干燥产生蔓越莓粉末级分AUA1的分级分离是利用BiotageFLASH-40系统完成的，系统 改为接收装有SNAPKP-C18-HS12g样品的BiotageSNAPKP-C18-HS120g柱。A1 (约 20 克）溶解在约200ml去离子水（DI)中。约50ml(±5g)的溶液加样到预平衡的C18-柱中 (柱子用约300ml甲醇洗脱接着再用约300mlDI水洗脱）。分级分离是从先用约500mlDI 水洗脱柱子开始，接着用约500ml约15%甲醇/水（V/V)混合物洗脱柱子（流速为约35ml/ min)，以产生级分A2。残留的酚类内容物用约500ml甲醇从柱子中洗去。柱子通过在再次 加样更多的A1溶液（约50ml)前，用约500mlDI水洗涤进行再次平衡。这个过程重复总 计4次并且混合约15%甲醇/水的各部分以制备级分A2。干燥级分A2 ;首先在真空状态 (BuchiLaboratoryEquipment)下去除甲醇，接着冷冻干燥水性溶液以产生约4. 97g粉红 色粉末。使用示差折光检测对A2进行分析，观察到从HPX-87CHPLC柱中在约6. 7min时洗 脱的一个未知的峰。使用SephadexLH20柱层析对级分A2作进一步纯化以消除残留的酷 类色素。因此，将级分A2 (约4. 8g)溶解在约60mlDI水中，将混合物加样至45X300mm的S印hadex LH20柱中（用约500mlDI水预处理）。柱子用约500mlDI水洗脱得到纯化的 级分A6(使用Masterflex L/S泵-型号为7014-52,流速约为2. 5ml/min)。残留的酚类内 容物用约75%丙酮/水溶液（约500ml)从柱子中洗去。级分A6经冷冻干燥得到约4. 32g 灰白色结晶粉末（含粉红色的痕迹）。
[0043] 中性糖含量（NS)，半乳糖醛酸含量（GA)，酯化程度（DE)和乙酰化程度（DA)如以 前报道那样测定（Fishman等2008)，除了NS(葡萄糖标准品）用作DA的基准而非GA。根据 以前报道的程序（Zhao等，AlternativeTherapies，卷14, 34-38, 2008)，通过高效阴离子 交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD)接着进行甲醇分解来进行单糖分析。根据Rhoades 等2008,见前报道的程序，也通过HPAEC-PAD分离未水解的低聚糖。
[0044] 利用高效尺寸排阻色谱来进行对通过市售果胶酶处理蔓越莓花萼得到的A1级分 的碳水化合物分析。约10_20mg/ml的蔓越莓样品溶解在含有约0. 05MNaN03和约0. 01% NaN3的流动相中，置于冷室中搅拌过夜，在约50, 000g转速下离心约lOmin且通过约0. 22或 0. 45微米MillexHV滤器（Millipore公司，贝德福德，MA)过滤。用于溶剂递送系统，1000 型串联脱气器，自动采样器和泵（Agilent公司）的流速设置约为0.7mL/min。注射容量约 为200yL。样品一式三份地测试。柱子组由1个PLAquagel0H-40与2个0H-30尺寸排 阻柱（PolymerLaboratories,Amherst,MA)串联构成。柱子的温度在设定在约35°C的水浴 中进行控制。柱流出液用与ViscostarII型差压粘度计（DPV)(WyattTechnology,Santa Barbara,CA)和OptilabrEX干涉仪（RI)(WyattTechnology)串联的HELEOSII多角度激 光散射光度计（MALLS)(WyattTechnology,SantaBarbara,CA)检测。来自这3个探测器 的电子输出由ASTRA?软件（WyattTechnology)处理。
[0045] 对通过市售果胶酶处理蔓越莓花萼得到的A1级分的碳水化合物分析包含高甲氧 基果胶片段和大量的富含中性糖的物质（表1)。A2级分通过甲醇洗脱从反相HPLC柱中由 A1得到。明显地，甲醇并不能完全从此级分中除去，因为A6的甲醇明显多于果胶甲酯理论 上可能的量（表1)。大多数纯化的蔓越莓级分（A6)由乙酰化的、富含中性糖且重均摩尔质 量约为10, 200Da的多糖构成（表2)。z-平均流体力学半径和重量-平均特征粘度与A6 的低分子量保持一致（表2)。A1和A2分子量值也比大多数多糖要低，但A6的分子量是3 种蔓越莓级分中最低的。
[0046] 表1.蔓越莓级分的碳水化合物分析（摩尔％ ).
【权利要求】
1. 一种抗微生物粘附的组合物，包含有效量的分离自蔓越莓的抗微生物的粘附抑制性 级分A6作为活性成分，其中所述分离的级分含有乙酰化、富含中性糖的多糖，所述多糖的 重均摩尔质量为约10. 2X103±2. ODa，Z平均流体力学半径为约2. 0±0. 2nm，重量-平均 特征粘度为约〇. 〇48±0. 0001dL/g，且具有对尿路致病性菌和产维罗毒素菌有粘附抑制活 性，其中所述有效量至少降低细菌与具有用于粘附的a -Gal-(1_4)-Gal末端低聚糖受体 的细胞的粘附。
2. -种用于减少细菌与具有用于粘附的a -Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的 粘附的方法，包括对所述细胞施用有效量的分离自蔓越莓的抗微生物的粘附抑制性级分A6 作为活性成分，其中所述分离的级分含有乙酰化、富含中性糖的多糖，所述多糖的重均摩尔 质量为约10. 2X103±2. 0Da，Z平均流体力学半径为约2. 0±0. 2nm，重量-平均特征粘度 为约0. 048±0. 0001dL/g，且对尿路致病性菌和产维罗毒素菌有粘附抑制活性，其中所述有 效量至少降低细菌与具有用于粘附的a -Gal-(1_4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附。
【文档编号】A61K31/716GK104507485SQ201380032460
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年5月22日 优先权日:2012年5月25日
【发明者】阿兰·T·霍奇斯基, 阿尔伯托·努涅斯, 克里斯蒂娜·邱, 加里·D·斯特拉恩 申请人:美利坚合众国（由农业部长代表）, 优鲜沛蔓越莓公司