用于递送生物活性化合物的功能化脂质体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及轭合物，其中使用可溶于水的聚合物通过醚键将甾醇功能化，导向配体与该可溶于水的聚合物结合。这些轭合物改善了携带它们的囊泡的物理化学性质和递送性质，使这些囊泡更稳定、均匀和有效。还描述了它们的制备方法、包含所述脂质体的药物组合物以及它们的治疗用途。
【专利说明】用于递送生物活性化合物的功能化脂质体
[0001] 本发明涉及用于选择性递送活性剂的新的功能化脂质体。由于这些脂质体具有多 种导向配体的功能化，它们可在化妆品和治疗中具有潜在应用。
【背景技术】
[0002] 脂质体是包含与细胞的脂质双层类似的脂质双层的囊泡。在它们的内部有水溶 液，其中可发现诸如天然产物、合成药物或核酸的不同分子。这些囊泡目前被用作具有许多 不同应用的载体和分子递送系统。典型的应用包括在治疗或化妆品中递送生物活性化合 物。
[0003] 脂质体不断演变，并且已经部分解决一些与它们在第一代中的使用相关的问题， 例如短的血楽半衰期或非特异性结合（TorchilinV."Recentadvanceswithliposomes aspharmaceuticalcarriers(脂质体作为药物裁体的最新讲展NatureRev.Drug 2005,vol. 4,pp. 145-160)。为了降低脂质体在循环中的快速消除，已经将它们涂覆有 可溶的、惰性和生物相容的聚合物，例如聚乙二醇（PEG)，其形成了能减慢被调理素识别的 保护层，由此增加它们的生物利用度。对于可导致它们的内容物的错误递送的非特异性结 合，已经测试了脂质体表面上的越来越多数量的功能化配体，试图将它们转化为特异性递 送体系。这些靶向分子的范围可为诸如叶酸或生物素的小分子至肽或甚至抗体。
[0004] 还描述了同时被涂层聚合物和导向配体功能化的脂质体，目标是尝试获得较长 半衰期并且同时它的内容物的更有效和选择性递送。因此，例如，已经描述了脂质体，其 中一种膜磷脂（二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或DSPE)已被用作聚乙二醇（PEG)链的共价结 合的锚点，其反过来已用于共价固定导向配体，在该情况下，环R⑶肽OubeyP.等人， "LiposomesmodifiedwithcyclicRGDpeptidefortumortargeting(用于肿瘤革巴向 的使用环R⑶肽修饰的脂质体）" ?T.DrugTarg. 2004,vol. 12,pp. 257-264)。在现有技术 中，发现公开具有磷脂-PEG-[导向配体]类型的轭合物的脂质体的其他参考文献。例如， 已经描述了具有DSPE-PEG-AG73类型的轭合物的脂质体（NegishiY.等人，"Preparation andcharacterizationoflaminin-derivedpeptideAG73_coatedliposomesas aselectivegenedeliverytool(作为选择性基因递送工具的层粘连蛋白衍生的肽 AG73 涂覆的脂质体的制备和表征）" ?Biol.Pharm.Bull. 2010,vol. 33,pp. 1766-1769) 〇 AG73是衍生自层粘连蛋白的a1链的球形结构域的肽，已知其结合至多配体蛋白聚 糖-2(syndecan_2)，在一些癌症中过度表达的受体。
[0005] 尽管磷脂质已被用作锚点，但已经开发了脂质体的其他成分，特别是胆固 醇。因此，例如，发现描述胆固醇-PEG-[导向配体]类型的轭合物的参考文献。已经 描述了胆固醇-PEG-西妥昔单抗的轭合物用于在过度表达西妥昔单抗受体，EGFR的 癌细胞上递送硼化合物（PanX.等人，"Synthesisofcetuximab-immunoliposomes viaacholesterol-basedmembraneanchorfortargetingofEGFR(通过用于 EGFR祀向的基于胆固醇的膜销的西妥昔单抗-免疫脂质体的合成）".BioconjuRate Chem. 2007,vol. 18,pp. 101-108)。现有技术的另一实例是在过度表达整合素av 0 3的细 胞上在基因疗法中用于选择性递送编码DNA的胆固醇-PEG-RGD类型的轭合物（Thomson B.，等人，"Neutralpostgraftedcolloidalparticlesforgenedelivery(用于基因递 送的中性移植后胶体颗粒）"?Bioconi.Chem.2005,vol.16,pp.608-614)〇
[0006] 应当注意，通过酯-类型键或氨基甲酸酯-类型键实现在所有这些参考文献中脂 质体膜的胆固醇和串联PEG-[导向配体]之间的共价结合。
[0007] 另一方面，已描述了已使用其他基团功能化的脂质体。特别地，已描述了具有 轭合物的功能化脂质体，其中胆固醇通过乙稀基醚结合至PEG(称为CVEP)(BoomerJ.， 等人，"Cytoplasmicdeliveryofliposomalcontentsmediatedbyanacid-labile cholesterol-vinylether-PEGconjugate(通过酸不稳定的胆固醇-乙稀基醚-PEG轭合 物介导的脂质体内容物的细胞质递送）"Bioconi.Chem. 2009,vol. 20, 47_69)。乙烯基醚基 团在酸性介质中断裂，导致PEG涂层的损失。这些脂质体另外包含将它们引导至过度表达 叶酸受体的细胞的DSPE-PEG-叶酸的第二轭合物。
[0008] 尽管已经部分解决与使用脂质体相关的一些技术问题，但仍需要给予携带脂质体 更好的物理化学性质和药理学性质的轭合物。
[0009] 发明描述
[0010] 本发明涉及携带轭合物的脂质体，所述脂质体基于将存在于它的具有聚乙二醇链 的脂质双层中的留醇功能化，其反过来被导向配体功能化。胆固醇分子和PEG之间的结合 由烷基醚基团制成，不同于使用诸如氨基甲酸酯的其他化学基团的现有技术的那些。该新 共价结合给予携带轭合物的脂质体改进的物理化学性质和递送性质。特别地，发明人已发 现携带具有醚键的轭合物的脂质体显示比携带具有氨基甲酸酯键的轭合物的脂质体优异 的悬浮稳定性。即，具有醚键的轭合物具有比其中胆固醇和PEG链通过氨基甲酸酯结合的 那些轭合物更慢的沉降速率。这使得具有本发明轭合物的脂质体比现有技术描述的那些在 悬浮中更稳定。应当注意，现有技术没有参考文献表明该醚类型共价结合可给予所述悬浮 稳定性。
[0011] 另一方面，发明人出乎意料地发现，与由胆固醇-(氨基甲酸酯）-PEG-[导向配体] 类型的轭合物给予的相比，胆固醇_(醚）-PEG-[导向配体]类型的轭合物给予脂质体更均 匀的粒度。胆固醇_(氨基甲酸酯）-PEG-[导向配体]类型的轭合物表明双模态粒度分布， 而本发明的那些轭合物具有更均匀的，单模态分布。
[0012] 携带本发明轭合物的脂质体的均匀性和沉降速率的物理化学性质在用治疗剂功 能化的脂质体的生产、处理和使用中是有利的。
[0013] 此外，还出乎意料地发现携带本发明轭合物的脂质体在递送它们的内容物方面具 有改进的性质。因此，携带具有连接胆固醇和PEG的醚键的轭合物的脂质体比携带具有连 接胆固醇和PEG的氨基甲酸酯键的轭合物的脂质体具有优异的它们的内容物至靶标细胞 的递送。
[0014] 因此，本发明的第一方面提供轭合物，其包含：i)甾醇；ii)具有近端和远端的聚 乙二醇链，其中所述聚乙二醇链通过它的近端经由烷基醚类型的键与i)共价结合；iii)导 向配体，其能够与靶标细胞中存在的一个或几个受体选择性结合，所述导向配体与ii)的 远端共价结合。
[0015] 在优选的实施方案中，本发明的轭合物是其中留醇为胆固醇的轭合物。
[0016] 在另一优选的实施方案中，轭合物是其中聚乙二醇链具有1至30个重复 (repetitions)的轭合物。在另一更优选的实施方案中，聚乙二醇链具有2至10个重复。[0017] 在另一优选的实施方案中，轭合物是其中导向配体为肽的轭合物。在另一更优选 的实施方案中，导向配体包含RGD序列。在另一更优选的实施方案中，导向配体是具有序列SEQIDNO:1 :RGDFK的肽，其中R⑶和K残基是L-氨基酸且F残基是D-氨基酸。
[0018] RGD肽是本领域通常描述的肽，该肽能够与各种细胞系的膜中存在的整合素相互 作用，并且是用于研宄细胞之间和细胞与不同组织或基底膜之间的细胞粘附特别感兴趣 的。在为本发明一部分的轭合物（醚键）以及最接近的现有技术的轭合物（氨基甲酸酯 键）中，所述实例中使用的RGD肽是具有RGDfK序列的肽，其中苯丙氨酸是唯一的D-氨基 酸（这就是为什么在序列中使用小写字母区别它的原因），并且其中已经进行与聚乙二醇 的共价键合，从而使赖氨酸侧链功能化。
[0019] 本发明的第二方面是包含如上定义的轭合物的脂质体。
[0020] 在优选的实施方案中，如上定义的脂质体具有单模态粒度分布。
[0021] 在另一优选的实施方案中，如上定义的脂质体具有25纳米直至500纳米的平均粒 度，并且以绝对值计的平均Z电势为20mV直至90mV。
[0022] 在另一优选的实施方案中，如上定义的脂质体还包含治疗剂。在更优选的实施方 案中，治疗剂为a-半乳糖苷酶（或简称为GLA)。
[0023] 本发明的第三方面是如上定义的脂质体作为治疗剂的递送系统的用途。
[0024] 本发明的第四方面涉及用作药物的如上定义的脂质体。
[0025] 本发明的第五方面涉及包含治疗剂a_半乳糖苷酶的脂质体在制备用于预防和/ 或治疗法布里病（Fabrydisease)的药物中的用途。
[0026] 该优选的实施方案可再阐述为用于治疗和/或预防法布里病的包含治疗剂a _半 乳糖苷酶的脂质体。
[0027] 还认为本发明的一部分是用于治疗和/或预防法布里病的方法，所述方法包括在 需要这种治疗的包括人在内的个体中给予治疗有效量的如上定义的脂质体，连同药物可接 受的赋形剂或载体。
[0028] 本发明的第六方面是包含治疗有效量的上述定义的脂质体连同药物可接受的赋 形剂和/或载体的药物组合物。
[0029] 本发明的第七方面提供用于制备如上定义的轭合物的方法，其包括下列步骤：a) 在碱和溶剂的存在下使留醇与磺酰基卤化物反应以提供相应的磺酰基酯；b)在溶剂的存 在下使在步骤a)中获得的化合物与具有2至10个重复的聚乙二醇反应；c)使用二琥珀酰 亚胺基碳酸酯活化在步骤b)中获得的化合物；d)在碱和溶剂的存在下使由步骤c)得到的 化合物与包含RGD序列的肽反应。优选地，磺酰基酯为甲磺酸酯、苯磺酸酯（besylate)或 甲苯磺酸酯。
[0030] 本发明的第八方面提供用于制备如上定义的脂质体的方法，其包括下列步骤：
[0031]a)制备可任选包含表面活性剂的水溶液；
[0032] b)制备包含溶解于有机溶剂中的如上定义的轭合物、胆固醇和任选的磷脂的溶 液，其中使用压缩流体膨胀有机溶液；
[0033]c)任选地，将治疗剂加入至步骤a)的溶液中，或者在膨胀步骤b)的溶液之前将治 疗剂加入至步骤b)的溶液中；和
[0034] d)在步骤a)的所得溶液上将由步骤b)获得的溶液减压。
[0035]优选地，表面活性剂是在饱和杂环和不饱和杂环中的叔胺的盐、季铵盐和烷基铵 的盐。此外，优选地，压缩流体为二氧化碳（C02)、乙烷、丙烷、氢氯氟烃（例如，CFC-22)和 氢氟烃（例如，HFC-134A)。
[0036]在整个说明书和权利要求书中，词语"包括/包含（comprises) "及其变型不意图 排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语"包括/包含（comprise)"包括"由… 组成（consistingof)"的情况。对于本领域技术人员，本发明的其他目的、优点和特征将 部分从说明书并且部分从本发明的实践中显现出来。通过图示提供下列实施例和附图，并 且不意图限制本发明。此外，本发明包括本文指出的特定和优选的实施方案的所有可能组 合。
[0037] 定义
[0038]本文使用的术语"脂质体"和"囊泡"可相互交换。对于本领域技术人员，通常理 解称为脂质体的囊泡具有在它的膜中存在的一些磷脂，而当脂质体没有磷脂时也使用术语 囊泡。在任何情况下，作为本发明一部分的轭合物可包含在含有或不含磷脂的囊泡中。
[0039]本文使用的术语"a_半乳糖苷酶"（简称为GLA)是指从糖脂和糖蛋白中水解末 端a-半乳糖基部分的糖苷水解酶。它由GLA基因编码。它主要水解神经酰胺三己糖苷， 并且它可催化蜜二糖水解为半乳糖和葡萄糖。如在这里理解的，GLA可意指在原核生物 (procariotes)和真核生物二者中克隆和表达的a-半乳糖苷酶，截短型GLA酶，或仍保持 它的原始催化活性的GLA衍生物。
[0040]本文使用的术语"治疗剂"是指待给药的以具有有利效果的任何种类的物质、分子 或物质或分子的混合物，并且其被封装、捕获或复合在脂质体中。
[0041] 本文使用的术语"治疗有效量"是指当给药时其足以阻止疾病或疾病状态的一种 或多种症状的发展或在一定程度上减轻疾病或疾病状态的一种或多种症状的化合物的量。 根据本发明给予的化合物的特定剂量将明显由与每种实例相关的情况设定，包括所给予的 化合物、给药途径、治疗的疾病和类似的考虑因素。
[0042] 术语"药物组合物"是指本文公开的囊泡与诸如溶剂的其他化学组分的混合物。药 物组合物促进将治疗剂携带至生物体的囊泡的给药。
[0043] 术语"药物可接受的赋形剂"是指药物可接受的物质、组合物或媒介物，例如液体 或固体填充剂、赋形剂、溶剂或封装材料。从与药物组合物的其他成分相容的意义而言，各 个组分必需为药物可接受的。它必须适用于与人和动物的组织或器官接触使用而没有过多 毒性、刺激性或过敏反应、致免疫性或其他问题或并发症，具有合理风险/效益比。
[0044]本文使用的术语"治疗"是指减轻或根除疾病或疾病状态，减轻或根除与疾病或疾 病状态相关的一种或多种症状，或减轻或根除疾病或疾病状态的病因。
[0045] 附图简述
[0046] 图1.例示本发明囊泡的制备方法的装配（缩写：R:高压容器；V:阀；P:泵；F:流 量计；H:热交换器；ST:搅拌器；FL:过滤器；TI:温度指示器；PIC:压力指示器和控制器； C:集电器；RD:破裂片）。
[0047] 图2?包含本发明轭合物（具有醚键，虚线）的囊泡和包含具有氨基甲酸酯键（实 线）的轭合物的囊泡的粒度分布。在该图中，示出前者具有单模态分布，而后者显示双模 态、较不均匀的分布。
[0048] 图3?显示不具有轭合物，具有DPPC:Col:Col-PEG-R⑶（醚）和具有 DPPC:C〇l:C〇l-PEG-RGD(氨基甲酸酯）的脂质体的内化实验的结果的共聚焦图像。左 手侧栏、中间栏和右手侧栏分别相应于传动装置（细胞）、绿色通道（溶酶体）和 红色通道（DiD)。上行、中间行和下行分别相应于DPPC:Col:Col-PEG-R⑶（醚）、 DPPC:Col:Col-PEG-RGD(氨基甲酸酯）和DPPC:Col。
[0049] 图4.显示与已使DID-标记的脂质体内化的细胞相关的荧光强度。它显示当使用 DPPC:Col:Col-PEG-RGD(醚）脂质体时比当使用DPPC:Col:Col-PEG-RGD(氨基甲酸酯）和 DPPC:Col脂质体时该内化显著更高。
[0050]y轴显示荧光强度（a.u.)。在x轴中：左手侧值、中间值和右手侧值分别相 应于简单（plain)脂质体、具有DPPC:C〇l:C〇l-PEG-RGD(醚）轭合物的脂质体和具有 DPPC:Co1:Co1-PEG-RGD(氨基甲酸酯）轭合物的脂质体。
[0051] 图5.在1. 5yg/ml酶浓度下，在a半乳糖苷酶-缺陷小鼠的MAEC培养物中的脂 质体的a半乳糖苷酶活性。y轴描述了 ％Gb3损失（平均+/_标准偏差）。在x轴中：点 1相应于a-半乳糖苷酶（没有脂质体封装），点2相应于功能化的脂质体（具有氨基甲酸 酯或者醚连接的轭合物）且点3相应于已经渗滤的功能化的脂质体。
[0052] 图6.不同浓度下的携带a_半乳糖苷酶的渗滤的具有轭合物的脂质体对a_半 乳糖苷酶缺陷内皮细胞中Gb3的损失的影响。x轴显示％Gb3损失而y轴显示a-半乳糖 苷酶浓度（Ug/mL)。具有实体黑色点的线相应于携带具有氨基甲酸酯键的轭合物的脂质 体，而具有空方格的线相应于携带具有醚键的轭合物的脂质体。 实施例
[0053] 实施例1.轭合物的制各
[0054] 使用下面描述的步骤合成形成本发明一部分的轭合物（在胆固醇和PEG之间具有 醚键）以及在现有技术中已描述的那些（在胆固醇和PEG之间具有氨基甲酸酯键）。用于 实验概述中的首字母缩略词为：
[0055] ACN :乙腈
[0056] CDI : 1，1' -羰基二咪唑
[0057] DCM:二氯甲烷
[0058]DIPEA:N，N-二异丙基乙胺
[0059]DMF:N，N-二甲基甲酰胺
[0060] DSC:二琥珀酰亚胺基碳酸酯
[0061] HPLC-MS:高效液相色谱-质谱
[0062] HPLC-PDA:高效液相色谱-质谱-光电二极管阵列检测器
[0063] NMR:核磁共振
[0064] TMBE:甲基叔丁基醚
[0065] TFA :三氟乙酸
[0066] TIS :三异丙基硅烷
[0067] 实施例la:具有醚键的轭合物的制各：
[0068] 3曰固醇甲苯磺酰基（A)的制各：
【权利要求】
1. 轭合物，其包含： i) 甾醇； ii) 具有近端和远端的聚乙二醇链，其中所述聚乙二醇链通过它的近端经由烷基醚类 型的键与i)共价结合； iii) 导向配体，其能够与靶标细胞中存在的一种或数种受体选择性结合，所述导向配 体与所述ii)的远端共价结合。
2. 如权利要求1所述的轭合物，其中所述留醇为胆固醇。
3. 如权利要求1至2中任一权利要求所述的轭合物，其中所述聚乙二醇链具有2至10 个重复。
4. 如权利要求1至3中任一权利要求所述的轭合物，其中所述导向配体为肽。
5. 如权利要求1至4中任一权利要求所述的轭合物，其中所述导向配体包含RGD序列。
6. 如权利要求5所述的轭合物，其中所述导向配体为序列SEQ ID NO :1的肽。
7. 包含权利要求1至6中任一权利要求定义的轭合物的脂质体。
8. 如权利要求7所述的脂质体，其具有单模态粒度分布。
9. 如权利要求8所述的脂质体，其中所述平均粒度为25纳米直至500纳米，且绝对值 形式的平均Z电势为20mV直至90mV。
10. 如权利要求7至9中任一权利要求所述的脂质体，其还包含治疗剂。
11. 如权利要求10所述的脂质体，其中所述治疗剂为a -半乳糖苷酶。
12. 权利要求7定义的脂质体作为治疗剂的递送系统的用途。
13. 用作药物的权利要求10至11中任一权利要求定义的脂质体。
14. 用于治疗和/或预防法布里病的权利要求11定义的脂质体。
15. 包含治疗有效量的权利要求10至11中任一权利要求定义的脂质体连同药物可接 受的赋形剂和/或载体的药物组合物。
16. 用于制备权利要求1至6中任一权利要求定义的轭合物的方法，其包括下列步骤： a) 在碱和溶剂的存在下使留醇与磺酰基卤化物反应以提供相应的磺酰基酯； b) 在溶剂的存在下使在所述步骤a)中获得的化合物与具有2至10个重复的聚乙二醇 反应； c) 使用二琥珀酰亚胺基碳酸酯活化在所述步骤b)中获得的化合物； d) 在碱和溶剂的存在下使由所述步骤c)得到的化合物与包含RGD序列的肽反应。
17. 制备权利要求7至11和13中任一权利要求定义的脂质体的方法，其包括下列步 骤： a) 制备可任选包含表面活性剂的水溶液； b) 制备包含溶解于有机溶剂中的权利要求1-6中任一权利要求定义的轭合物、胆固醇 和任选的磷脂的溶液，其中使用压缩流体膨胀所述有机溶液； c) 任选地，将治疗剂加入至所述步骤a)的溶液中，或者在膨胀所述步骤b)的溶液之前 将治疗剂加入至所述步骤b)的溶液中；和 d) 在所述步骤a)得到的溶液上将由所述步骤b)得到的溶液减压。
【文档编号】A61K47/48GK104507503SQ201380034806
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2012年6月29日
【发明者】利奥诺·本托萨鲁尔, 豪梅·贝西亚纳米罗, 英格里德·卡博雷拉普伊赫, 埃莉萨·埃利松多塞斯德维库纳, 玛尔塔·梅尔加列霍迪亚兹, 米里亚姆·罗佑艾斯波西托, 费尔南多·阿尔本瑞希欧帕罗米拉, 丹尼尔·普利多马丁内斯, 桑蒂亚戈·萨拉韦尔格斯, 约瑟·路易斯·科尔歇尔罗涅托, 西蒙·施瓦兹纳瓦罗, 伊巴内·阿巴索洛欧劳尔图阿, 安东尼奥·佩德罗·韦拉韦尔德科拉莱斯 申请人:康斯乔最高科学研究公司(Csic), 巴塞罗那科技园基金会, 生物医学网络研究中心, 巴塞罗那生物医学研究基金会(Irb Barcelona), 巴塞罗纳大学, 瓦尔德西布伦大学医院基金会研究所, 巴塞罗那自治大学