免疫调节疫苗的制作方法

免疫调节疫苗的制作方法
【专利摘要】一种免疫调节疫苗，其包括-导向佐剂，其包括连接至TLR9配体和第一肽α-螺旋的至少抗CD32部分，和-免疫原，其具有至少一个表位和与第一α-螺旋缠绕的第二肽α-螺旋，一种用于制备疫苗的试剂盒，和一种致敏疫苗，其包括在药物制剂中的连接至TLR9配体和肽的α-螺旋的至少抗CD32部分。
【专利说明】免疫调节疫苗

【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫调节疫苗，其包括免疫原和与之连接、由此调节对免疫原的免疫 应答的导向佐剂（directedadjuvant)。本发明进一步涉及包括免疫原性组合物的疫苗，所 述免疫原性组合物包括
[0002] -导向佐剂，其至少包括连接至TLR9配体的抗⑶32部分，和
[0003] _免疫原，其结合至所述导向佐剂；
[0004] 其用于治疗受试者以诱发针对免疫原的瞬时IgG免疫应答。

【背景技术】
[0005] 对于包括变态反应（allergy)、癌症和自身免疫病等的免疫疾病，由Thl/Th2/ Thl7/Treg细胞调节的免疫平衡调节及其在新免疫治疗开发中的应用起到重要作用。
[0006] Thl细胞（1型辅助T细胞）的特征在于产生促炎性细胞因子如IFN-y、IL-2和 TNF-0。Thl细胞参与细胞介导的免疫。由Thl细胞产生的细胞因子刺激微生物病原体的 吞噬和破坏。几种慢性炎性疾病已描述为Thl主导的疾病，即多发性硬化症、糖尿病和类风 湿性关节炎。
[0007] Th2细胞（2型辅助T细胞）的特征在于产生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。 Th2细胞被认为在变态反应响应中起作用。细胞因子如IL-4通常刺激抗体的产生。IL-5刺 激嗜酸性细胞应答，也是免疫应答的一部分。特应性（atopy)和变态反应被认为是Th2主 导病况。
[0008] Thl/Th2或Thl7/Treg免疫失衡成为各种免疫疾病的原因。
[0009] 变态反应被认为是对环境中的蛋白质的超敏反应。变应原（allergen)为特应 性患者在IgE抗体应答随后导致变态性反应下应答的抗原。复合体或融合蛋白中的抗原 可为环境变应原（如室尘螨（housedustmite)、桦树花粉（birchpollen)、草的花粉 (grasspollen)、猫抗原、蟑螂抗原），或食品变应原（如牛奶、花生、虾、大豆），或二者的 组合。IgE分子因其在效应细胞（肥大细胞、嗜碱性粒细胞（basophiles)和嗜酸性粒细胞 (eosinophiles))激活中的作用而是重要的。普遍接受的是，IgE还通过上调B细胞和树突 细胞（DC)的抗原捕获潜能（二者借助于低亲和性受体（CD23)和高亲和性受体（FeeRI)) 而在变态反应性疾病的诱导阶段起到重要作用。IgE抗体的消极作用可由变应原特异性 IgG抗体抵消，例如因为它们引导免疫应答远离B细胞转向单核细胞和DC，且它们能够通过 这些细胞上的FeeRI与FeyRIIb(⑶32b)共交联来下调IgE受体介导的效应细胞的活化。 另外，它们与IgE分子竞争变应原结合位点。由此，可通过变应原特异性IgG分子（特别是 IgGl)的诱导而治疗、治愈和预防变态反应。
[0010] 与IgE分子的大致3天的血清半衰期相比，IgG分子具有大约3周的血清半衰期。 IgE分子通过(nalfve)B细胞和Th2细胞之间的相互作用诱导，这提供IL-4和IL-13并伴随 ⑶40L表达，这在记忆B细胞和衆细胞中是将类别开关（classswitch)诱导为IgE所必需 的。相反，产生IFN-Y和IL-2的Thl细胞将类别开关诱导为IgG。因此，Thl而不是Th2 辅助T细胞对变应原应答的诱导有益于预防、治疗和治愈变态反应性疾病。
[0011] 迄今为止，使用变应原的若干种主动免疫得到应用。最常见的是所谓的"免疫治 疗"，其依赖于以相对高浓度的变应原频繁免疫。该技术仅在少数变态反应性疾病如蜂毒变 态反应以及在鼻炎和结膜炎的某些情况中适度有效，最近某些报道已显示在较温和形式的 哮喘和过敏性皮炎中的有效性。更近一些，已施用其中将增加量的变应原在相当短的时间 范围内注射的快速免疫治疗，其结果稍胜一筹。通常，皮下途径用于变应原给药，但最近该 途径已与口服或者甚至局部施用进行了比较，结果一般是阳性的，但并不总是一致。不同的 免疫治疗技术为Saint-Remy描述的一种技术（EP0178085和EP0287361)，其中使用了在体 外与相关变应原复合的自身IgG抗体。该技术允许施用相当少量的变应原，并具有较少的 副作用。
[0012] 这些治疗背后的机理尚未清楚。在传统治疗中，如果该治疗诱导特异性IgG抗体 增加，则似乎存在有益效果，尽管不是每种特异性IgG的显著增加都与成功的免疫治疗相 关。之所以如此的可能观点是IgG抗体对B细胞、单核细胞和肥大细胞上的CD32的亲和性 相对低。Saint-Remy法从患者选择特异性IgG抗体，随后将其于相关的变应原体外混合。 这样，它们确保变应原不能与细胞或细胞上的其它抗体同种型如肥大细胞上的IgE自由反 应。另外，它们声称抗独特型（anti-idiotypic)抗体相对于特异性IgG分子升高，其此后 会防止变态反应。
[0013] 在WO97/07218中记载了变应原-抗⑶32融合蛋白。在该公报中，避免了分离特 异性IgG分子和这些IgG抗体对CD32的亲和性低的问题，并且降低了使用完整的"IgE结 合"变应原的传统免疫治疗的风险因素。然而，所声称的由于将含抗CD32的疫苗单独导向 到树突细胞所造成的Thl记忆应答的诱导并没有被证实。
[0014] W02007098934A1描述了能够结合至TLR9和CD32的包括至少一个抗原的至少一个 表位的分子，其生产和其作为药剂的用途，特别是用于变态反应治疗的用途。
[0015] 免疫调节不仅可在变态反应性疾病的情况下起作用，而且还可在一系列其它疾病 中起作用。
[0016] 增强对感染剂（infectiousagents)如微生物病原体的免疫应答是预防性或治疗 性抗感染免疫治疗的目标。
[0017] 在肿瘤免疫治疗中，目标也是使用除了细胞毒性T淋巴细胞（CTL)以外的肿瘤抗 原特异性T辅助型I(Thl)细胞。
[0018] 医学上已知为恶性赘生物的癌症是一组广泛的各种疾病，它们全部涉及没有调节 的细胞生长。在癌症中，细胞不可控制地分裂和生长，形成恶性肿瘤，并侵袭身体的附近部 位。癌症还可通过淋巴系统或血流扩散至身体更远的部位。并不是所有的肿瘤都是癌性的。 良性肿瘤不是不可控地生长，不侵袭近旁组织，且不扩散至全身。有超过200种折磨人类的 不同已知癌症。
[0019] 确定癌症的原因是复杂的。已知许多东西增加癌症的风险，包括使用烟草、某些感 染、辐射、缺乏身体运动、肥胖症和环境污染物。这些可直接损伤基因或与细胞内已存在的 遗传缺陷组合而引起疾病。大约5至10%的癌症是完全遗传的。
[0020] 癌症可以以多种方式检测，包括某些体征和症状的存在、筛选试验或医学影像。一 旦检测到可能的癌症，通过组织样品的镜检来诊断。癌症通常用化学治疗、辐射治疗和手术 治疗。疾病生存的几率根据癌症的类型和位置以及开始治疗时疾病的程度而大幅变化。虽 然癌症可影响所有年龄的人群，并且少数类型的癌症更常见于儿童中，但癌症发展的风险 通常随年龄增加。2007年，全球范围内癌症导致全部人类的约13%死亡（790万）。比例随 着更多人群的老龄化和随着在发展世界中发生大众生活方式的改变而升高。
[0021] 由于免疫系统基于自身与非自身之间的区别而对其遭遇的环境因素应答，所以因 癌症发病而出现的多种肿瘤细胞或多或少地耐受患者的自身免疫系统，这是因为肿瘤细胞 本质上是在没有适当地调节控制下生长、分裂和扩散的患者自身的细胞。
[0022] 免疫耐受或免疫学耐受为免疫系统不攻击抗原的过程。在天然耐受或自身耐受 中，身体不增加对自体抗原（self-antigen)的免疫应答。其以三种形式出现：中枢耐受、夕卜 周耐受和获得的耐受。
[0023] 中枢耐夸1:
[0024] 中枢耐受发生在淋巴细胞发育期间并在胸腺和骨髓中运行。这里，识别自体抗原 的T和B淋巴细胞在它们发育成完全免疫活性细胞之前被删除，防止自身免疫。该过程在 胎儿生命中最活跃，但随着不成熟淋巴细胞的产生而贯穿整个生命继续进行。
[0025] 外周耐
[0026] 外周耐受为在T和B细胞成熟后发展并进入外周的免疫学耐受。离开胸腺的T细 胞相对但不是完全安全。某些将具有可对自体抗原响应的受体（TCRs)，所述自体抗原以足 够高的浓度存在，以致它们能够结合至在胸腺中T细胞不会遇到的"弱"受体（例如，组织 特异性分子，诸如朗格罕氏岛（isletsofLangerhans)、脑或脊髓中的那些）。胸腺中逃脱 胸腺内阴性选择的那些自身反应性T细胞可造成细胞损伤，除非它们被删除或被有效地控 制在外周组织中。已知存在沉默此类潜在自身反应性T细胞的几种反馈机制。它们包括下 述：无变态反应性（anergy)、活化诱导的细胞死亡、外周抑制。
[0027] 获得的或诱导的耐
[0028] 获得的或诱导的耐受是指免疫系统对外部抗原的适应，其特征在于胸腺组织对在 其它环境中会很可能诱导细胞介导的免疫或体液免疫的给定抗原的特异的非反应性。最重 要的天然类型的获得的耐受之一为妊娠免疫耐受，此时胎儿和胎盘必须被母体免疫系统耐 受。
[0029] 靶向肿瘤相关抗原的免痔治疗:
[0030] 癌症免疫治疗是使用免疫系统来排斥癌症。主要的前提是刺激患者的免疫系统 来攻击引起疾病的恶性肿瘤细胞。这可通过患者的主动免疫（例如，通过给药细胞癌症疫 苗，如普罗文奇（Provenge)，Dendreon，西雅图，华盛顿，US)4来进行，在该情况中患者的自 身免疫系统训练为识别肿瘤细胞作为要摧毁的靶标，或者通过给药治疗性抗体作为药物来 进行，在该情况中患者的免疫系统被招募来通过治疗性抗体来破坏肿瘤细胞。活化患者免 疫系统对抗肿瘤的另一方法为使用所谓的肿瘤相关抗原（TAA's)，该肿瘤相关抗原为自身 蛋白质，其在健康正常细胞中在一定程度上表达，但在肿瘤细胞中过表达，或者它们包括使 肿瘤细胞增殖的细胞激素/生长因子 5。这些TAAs制成制剂并以免疫原性的方式呈递至体 内，以使免疫系统将建立应答，尽管事实是这些蛋白质是自身的。很明显，该方法仅对患者 已发育外周或获得的耐受所对抗的TAAs有用。当识别TAA的T和B细胞已从免疫学组库 (immunologicalrepertoire)中删除时，主动癌症免疫治疗并不是一个选项。
[0031] 胃泌素:
[0032] 可用作治疗消化系统癌症（gastrointestinalcancers)如胰腺癌的祀标的自 身抗原（autoantigen)(激素/生长因子）的实例为小胃泌素（littlegastrin) (G17)6A 另外，G17的中和还可有益于任意胃泌素相关的病况，包括胃溃疡、胃食管反流病（Gastro EsophagealRefluxDiseas,GERD)1(1，这是由于胃的pH受胃泌素调控，而对于终末期肾衰竭 (EndStageRenalFailure,ESRF)n，贝丨」是由于在ESRF患者中胃泌素在高于正常浓度下循 环。
[0033] US5023077描述了免疫原性组合物和用于治疗和预防胃和十二指肠溃疡病的方 法，该免疫原性组合物基于胃泌素肽，该胃泌素肽偶联至免疫原性载体，例如白喉类毒素、 破伤风类毒素、钥孔戚血蓝蛋白（keyholelimpethemocyanin)或牛血清白蛋白。
[0034] 胃泌素在胃肠道具有一些重要的功能，两个最重要的是刺激胃肠道 中的酸分泌和刺激胃肠道中的细胞生长。激素以至少两种分子形式存在， 十七胃泌素（heptadecagastrin)，所谓的小胃泌素（〃G17〃），和三十四胃泌素 (tetratriacontagastrin) (〃G34〃），其根据每个分子中的氨基酸残基（〃AA〃）数命名，其中 G17构成G34的17个氨基末端（"N-末端〃）。
[0035] US5609870描述了抗-G17免疫原的制备，这在哺乳动物中产生抗其自身G17的不 与G34反应的抗体，所述制备包括使由对应于G17的N末端氨基酸序列直至其C末端的氨 基酸残基数为12的片段序列组成的肽缀合至间隔子肽，所述间隔子肽缀合于免疫原性载 体如白喉类毒素、破伤风类毒素、钥孔戚血蓝蛋白或牛血清白蛋白。
[0036] 免痔平衡:
[0037] 受Thl/Th2/Thl7/Treg细胞调控的免疫平衡在免疫治疗开发中扮演重要作用。
[0038] 自身免疫病中需要调控Thl/Th2/Thl7/Treg失衡，g卩，在免疫系统攻击自身组织 的情况下。
[0039] TLR9 的作用：
[0040]Toll-样受体（TLRs)是一类在固有免疫系统中起到关键作用的蛋白质。它们是单 链、跨膜的非催化性受体，通常在细胞表面上和岗哨细胞如巨噬细胞和树突细胞的内吞小 泡中表达。TLR识别病原体相关分子模式（PAMPs)(其为结构上保守的分子，源自微生物）， 并且起始信号转导以诱导固有免疫和随后的适应性免疫所需的细胞因子的产生。
[0041] 各种TLR显示不同的表达模式。该基因倾向于在免疫细胞富集的组织中表达，例 如肾脏、淋巴结、骨髓和外周血白细胞。
[0042]已在人类和小鼠中共鉴定出了十三种TLR(简单命名为TLRl至TLR13，并且已经在 其它哺乳动物物种中发现了这些中的许多的TLR的等同形式。然而，不是小鼠中的每个TLR 受体也都发现于人类中，反之亦然。另外，不是每个TLR受体的配体和功能是已知的，例如 TLR10为具有未知功能的孤儿受体（orphanreceptor)。
[0043] TLR受体的活化已用于治疗各种疾病，例如TLR9被药剂活化已显示有益于治疗变 态反应和肿瘤。小鼠和人类中的研宄表明，TLR9的天然配体是DNA分子中未甲基化的CpG 序列。与细菌基因组或病毒DNA相比，CpG位点在脊椎动物基因组中相对稀少（?1% )。 TLR9由多种免疫系统细胞例如树突细胞、B淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤（NK)细胞表达。 然而，在健康人中，TLR9的表达仅限于浆细胞样树突细胞（pDCs)和B细胞。该表达是细胞 内的，位于核内体小泡（endosomalcompartments)内，通过结合至CpG基序富集的DNA来 起到警告免疫系统的病毒和细菌感染的作用。然而，在病理学状态下，TLR9表达已报道还 位于细胞的细胞表面上12_14。
[0044] 已报道了许多不同的合成的TLR9激动剂分子。激动配体（TLR9活化）已分类成 二组：
[0045] 由CpGA类组成的组，特别是CpG-A⑶15寡脱氧核苷酸（ODN)，也称作"D"-型0DN。 此类TLR9激动剂诱导强IFNa诱导和树突细胞的最低成熟，且在本文中称为"组1"TLR9配 体。实例为0DN221616:
[0046]GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQID48)
[0047] 由CpGB类组成的组，特别是CpG-B⑷17寡脱氧核苷酸（ODN)，也称作"K"-型0DN。 此类TLR9激动剂诱导弱IFNa诱导和树突细胞成熟，且在本文中称为"组2"TLR9配体。实 例为 0DN200618;19:
[0048]TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQID49)
[0049] 由CpGC类组成的组，也称作CpG-C2tl寡脱氧核苷酸（ODN)。此类TLR9激动剂诱 导IFNa和未成熟树突细胞的成熟，且在本文中称为"组3"TLR9配体。实例为0_M36221:
[0050] TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(SEQID69)
[0051] 迄今为止记载的TLR9的所有配体基于核苷酸。尽管TLR9特异性抗体已报道并用 于阐明受体的存在和位置，但这些分子还未描述为TLR9的配体，没有任何TLR9活化或抑制 活性的报道。
[0052]⑶32的作用：
[0053] ⑶32强表达于单核细胞/树突细胞以及B细胞上，因而此类分子被设计为将免疫 应答导向重要的免疫细胞，意欲防止B细胞的抗原呈递，而促进尤其是树突细胞（DCs)的抗 原呈递，当充分刺激时后者导致Thl对抗原应答的诱导。有至少两种类型的DC:骨髓样树 突细胞（mDC)和浆细胞样树突细胞（pDC)，已导致DCl和DC2细胞的新理念。在该理念下， DCl细胞在抗原特异性刺激之后促进Thl细胞发育的诱导，DC2细胞支持Th2细胞的发育。 单核细胞衍生的DC(或mDC)通常被认为是DCl类型，而pDC被认为是DC2型。两种类型的 DC表达⑶32a并将诱导抗原特异性T细胞应答；然而，并不保证结果将是Thl类型。事实 上，在变态反应性供体中，Th2应答是更有可能的。重要的是，pDC表达TLR9受体，TLR9受 体结合CpG-ODN(含有未甲基化的CpG基序的寡脱氧核苷酸（ODN))。该受体在pDC中的活 化导致非常强的IFN-a和IL-12生产，这促进Thl诱导并因而将潜在的DC2转化成DCl细 胞。
[0054] 因此，此类分子可将TLR9受体在pDC中的活化与抗原特异性Thl细胞的特异性刺 激和诱导相结合。
[0055] 在肿瘤免疫治疗中，特定的目标是使用除细胞毒素T淋巴细胞（CTL)以外的肿瘤 抗原特异性T辅助型I(Thl)细胞。
[0056]卷曲螺方定（Coiledcoils)：
[0057] 卷曲螺旋由蛋白质中的结构基序构成，其中2-7个a-螺旋缠绕在一起类似于绳 索的股线；二聚体和三聚体是最常见的类型。卷曲螺旋螺旋体已用于使产生异二聚体的卷 曲螺旋结构域的Fv抗体片段稳定化22。
[0058] 复合蛋白质分子（proteinaceousmolecules)的稳定性和折叠结构在设计免疫原 时是至关重要的。因此，本发明的目的为提供具有改进的稳定性和结构用于调节对特定免 疫原的免疫应答的疫苗。
[0059] 进一步需要提供改进的靶向胃泌素和胃泌素依赖的病况的免疫治疗。因而，本发 明的目的为提供具有改进的免疫原性、稳定性和结构以调节对特定胃泌素表位的免疫应答 的疫苗。


【发明内容】

[0060] 本发明通过所要求保护的主题解决。
[0061] 根据本发明，提供有免疫调节疫苗，所述免疫调节疫苗包括
[0062] -导向佐剂，其至少包括连接至TLR9配体和第一肽a-螺旋的抗⑶32部分，和
[0063] -免疫原，其具有至少一个表位和与第一肽a-螺旋缠绕的第二肽a-螺旋。
[0064] 具体地，所述表位为T细胞和/或B细胞表位。
[0065] 根据本发明的具体方面，所述第一和第二肽a_螺旋各自包括3-5个氨基酸重复 的氨基酸基序，以小于KT6M的KcU优选小于KT7M的KcU更优选小于KT8M或KT9M的Kd彼 此特异性结合。
[0066] 根据本发明的另外的具体方面，所述抗CD32部分选自由抗CD32抗体、优选靶 向⑶32a的抗体片段和肽组成的组。抗体片段具体可例如为Fab、Fv、scFv、dAb、F(ab)2 或Fcab片段，或任何其它可能的实体，只要其特异性结合至受体并在结合后内在化 (internalized)艮P可。
[0067] 根据本发明的另一方面，TLR9配体为选自由CpGA类组成的组的TLR9激动剂，特 别是CpG-A⑶23寡脱氧核苷酸（ODN)，也称作"D" -型0DN。此类TLR9激动剂诱导强IFNa 诱导和最低树突细胞成熟，且在本文中称为"组1"TLR9配体。
[0068] 根据本发明的另一方面，TLR9配体为由CpGB类组成的组的TLR9激动剂，特别是 CpG-B(K)24寡脱氧核苷酸（ODN)，也称作"K" -型0DN。此类TLR9激动剂诱导弱IFNa诱导 和树突细胞成熟，且在本文中称为"组2"TLR9配体。
[0069] 根据本发明的另一方面，TLR9配体具体为由CpGC类组成的组的TLR9激动剂，也 称作CpG-C25 ;26寡脱氧核苷酸（ODN)。此类TLR9激动剂诱导IFNa和未成熟树突细胞的成 熟，且在本文中称为"组3 "TLR9配体。
[0070] 根据本发明的另一方面，所述TLR9配体具体为模拟任意CpGA、B或C类寡脱氧核 苷酸的免疫刺激肽，即特异性结合至TLR9具有活化、激动功能的肽。
[0071] 根据本发明的另一方面，TLR9配体为选自由抑制性ODNs27 ;28寡脱氧核苷酸（有时 称为抑制性CPGs)组成的组的TLR9拮抗剂，例如，包含由CCx(非-C)(非-C)xxGGG(X=任 意碱基）29组成的组的抑制性基序的那些。特异性抑制性ODNs已被证实不诱导IFNa，也不 诱导树突细胞成熟，还阻碍通过TLR9的激动剂的活化。
[0072] 此类TLR9激动剂或诘抗剂可在以适当细胞为基础的试验中确定，该试验测定 IFNa或者标记物⑶80、⑶83和⑶86至少之一的稳定表达，反映了未成熟树突细胞（DC)的 成熟。为此，如Tel等人3(1所述将浆细胞样树突细胞（pDCs)从健康供体的血液中纯化，并 随后用适当浓度的TLR9配体温育。24h后，使用标准ELISA实验方案在上清液中测定IFNa。 为了确定细胞的成熟状态，在与TLR9配体温育前后使用标准FACS步骤用商购可得的特异 性抗体染色表达CD80、CD83或CD86的pDC。
[0073]IFNa的诱导可由IFNa表达水平和相对于参考水平的相应增加来确定。相对于非 刺激细胞的增加可与由已确定的针对如由组1、2或3TLR9配体所定义的各类型CpG的参考 诱导的诱导水平相比较，并典型地在相应参考的30%和300%之间，优选至少100%，更优 选至少120%，至少150%，至少200 %或至少250%。
[0074] 未成熟的树突细胞的成熟可通过⑶80、⑶83和⑶86的任意标记物的表达水平来 确定。相对于非刺激细胞的相应增加可与由已确定的针对如由组1、2或3TLR9配体所定义 的各类型CpG的参考诱导的诱导水平相比较，且典型地在相应参考的30%和300%之间，优 选至少100%，更优选至少120%，至少150%，至少200 %或至少250%。
[0075] 具体地，组1和3的TLR9激动剂将导致IFNa表达增加，组2和3的TRL9激动剂 将导致任意DC成熟因子⑶80、⑶83和⑶86表达增加。甚至在组1-3各自的TLR9激动剂 的存在下，TLR9拮抗剂将导致IFNa表达降低和任意DC成熟因子⑶80、⑶83和⑶86表达 降低。
[0076] 根据本发明的具体实施方案，免疫原源自
[0077] _用于癌症疾病的免疫治疗的肿瘤相关抗原，或者
[0078]-用于传染病的免疫治疗的病原体，或者
[0079] _用于变态反应疾病的免疫治疗的变应原。
[0080] 此类疫苗典型地为免疫刺激疫苗，例如，刺激体液和T-细胞（Thl)免疫应答。
[0081] 免疫刺激疫苗的该实施方案具体采用为TLR9激动剂的TLR9配体。在该情况下疫 苗主要诱导Thl对免疫原的应答。
[0082] 具体地，所述抗CD32部分靶向CD32a，优选具有Kd彡KT6M,更优选小于KT7M或小 于KT8M的高亲和性。
[0083] 更具体地，所述抗⑶32部分为特异性或选择性的⑶32a结合剂，S卩，不靶向⑶32b 或以Kd>10_6M，优选高于10_5M，，更优选高于KT4M的低亲和性靶向⑶32b。结合至⑶32a和 Q)32b的差别亲和性（differentialaffinity)优选至少llog，更优选至少21ogs或至少 31ogs，或者较高的Kd值差别。
[0084] 在进一步采用TLR9激动剂的免疫刺激疫苗中典型地使用与⑶32a而不是⑶32b 结合为特别优选高亲和性或高差别亲和性的抗CD32部分。进一步优选此类疫苗采用选自 一系列肿瘤靶标或病原体靶标的免疫原，其中Thl应答和特异性IgG抗体对于与疾病有效 斗争是必须的。
[0085] 根据可选的实施方案，所述抗⑶32部分靶向⑶32a和⑶32b二者，具有Kd彡KT6M 的高亲和性，优选高于KT7M的亲和性，更优选高于KT8M的亲和性。在进一步采用TLR9激 动剂的疫苗中典型地使用与CD32a和CD32b二者的结合为特别优选的高亲和性的抗CD32 部分。进一步优选此类疫苗采用选自一系列变态反应靶标的免疫原，其中获得了Th2应答 的重新导向以得到Thl应答。典型地，不优选对疫苗自身的抗体。另外，特异性疫苗优选以 与结合至⑶32a大致相同的亲和性结合至⑶32b。
[0086] 与特异性靶向任意⑶32a或⑶32b或⑶32a和⑶32b二者的抗⑶32部分的结合 亲和性可以适当的试验确定，例如典型的ELISA，其使用商购可得的HIS标记的重组形式的 CD32a和CD32b，涂布至Ni-NTAELISA板，例如Ni-NTAHisSorbPlates(Qiagen,Austria)。 抗CD32部分可生物素化并由此可使用链霉亲和素-HRP或链霉亲和素AP和适当的底物 来检测。可选地，该部分可在FACS试验中使用表达⑶32a而不是⑶32b的U937细胞（如 ATCC:CRL1593)，和表达CD32b而不是CD32a的EBV转染的B细胞，如vanReijsen等人31 记载的CFB4:2来检测。
[0087] 根据本发明的其它实施方案，免疫原源自
[0088] -用于变态反应疾病的免疫治疗的变应原，或者
[0089] -用于自身免疫病的免疫治疗的人自身抗原。
[0090] 用于自身免疫病的此类疫苗典型地为免疫耐受疫苗，例如包括通过调控T细胞并 下调体液免疫应答诱导针对免疫原的T细胞耐受。
[0091] 免疫耐受的该实施方案具体采用为1组TLR9激动剂或为TLR9拮抗剂的TLR9配 体。在该情况下，疫苗将主要下调针对免疫原的Thl/2/17应答，除了活化Treg细胞外。
[0092] 用于变态反应的此类疫苗可为：
[0093] -例如通过采用为1组TLR9激动剂或为TLR9拮抗剂的TLR9配体，调控T细胞并 下调体液免疫应答来诱导针对免疫原的免疫耐受疫苗。在该情况下，疫苗将主要下调针对 免疫原的Thl/2/17应答，除了活化Treg细胞外；
[0094] 或者
[0095] -免疫刺激疫苗，采用为组3TLR9激动剂的TLR9配体诱导针对免疫原的Thl应答， 同时防止针对疫苗的体液免疫应答。
[0096] 根据免疫耐受疫苗的该实施方案，所述抗⑶32部分特异性靶向⑶32b或者⑶32a 和⑶32b二者，具有Kd<KT6M的高亲和性，优选具有Kd<KT7M的较高亲和性，更优选 Kd< 1(T8M。优选抗⑶32部分特异性靶向⑶32a和⑶32b二者。
[0097] 同样，对于用于变态反应的免疫刺激疫苗，所述抗CD32部分特异性靶向CD32a 和CD32b，具有Kd<KT6M的高亲和性，优选具有更高的亲和性，例如，Kd< 10_7M，更优选 Kd< 1(T8M。优选抗⑶32部分特异性靶向⑶32a和⑶32b二者。
[0098] 具体地，根据本发明提供疫苗，其中所述免疫原源自变应原，用于变态反应疾病的 免疫治疗，和其中所述抗⑶32部分靶向⑶32a和⑶32b。
[0099] 本发明的具体实施方案可由下表描述，表明根据结合CD32a和/或CD32b的特异 性和亲和性的抗CD32部分的选择、TLR9配体的类型和免疫原的类型。
[0100] 表1:具体实施方案：
[0101]

【权利要求】
1. 一种免疫调节疫苗，其包括 -导向佐剂，其至少包括连接至TLR9配体和第一肽a -螺旋的抗⑶32部分，和 _免疫原，其具有至少一个表位和与所述第一肽螺旋缠绕的第二肽螺旋。
2. 根据权利要求1所述的疫苗，其中所述第一和第二肽a -螺旋各自包括氨基酸基序 的3-5个氨基酸重复，以小于1(T6M的Kd彼此特异性结合。
3. 根据权利要求1或2所述的疫苗，其中所述抗CD32部分选自由抗CD32抗体、抗体片 段和肽组成的组。
4. 根据权利要求1至3任一项所述的疫苗，其中所述TLR9配体为选自由CpG寡脱氧核 苷酸A、B和C类或者模拟任意所述CpG寡脱氧核苷酸的免疫刺激肽组成的组的TLR9激动 剂。
5. 根据权利要求4所述的疫苗，其中所述免疫原源自 -用于癌症疾病的免疫治疗的肿瘤相关抗原，或者 -用于传染病的免疫治疗的病原体，或者 -用于变态反应疾病的免疫治疗的变应原。
6. 根据权利要求4所述的疫苗，其中所述抗CD32部分靶向CD32a。
7. 根据权利要求4所述的疫苗，其中所述免疫原源自变应原，用于变态反应疾病的免 疫治疗，且其中所述抗⑶32部分靶向⑶32a和⑶32b。
8. 根据权利要求1至3任一项所述的疫苗，其中所述TLR9配体为选自由抑制性ODN组 成的组的TLR9拮抗剂。
9. 根据权利要求8所述的疫苗，其中所述免疫原源自 -用于变态反应疾病的免疫治疗的变应原，或者 -用于自身免疫病的免疫治疗的人自身抗原。
10. 根据权利要求9所述的疫苗，其中所述抗⑶32部分靶向⑶32b，或者⑶32a和 CD32b〇
11. 根据权利要求9或10所述的疫苗，其用于变态反应疾病的免疫治疗，其中所述抗 CD32部分靶向CD32a和CD32b。
12. 根据权利要求9至11任一项所述的疫苗，其包括 -导向佐剂，其由包括SEQ ID 70的序列或由SEQ ID 70的序列组成的连接至所述第 一肽a -螺旋的抗⑶32部分组成，偶联至SEQ ID 69的TLR9配体，优选以1:1-18 (分子/ 分子）的比例；和 -免疫原，其包括连接至第二肽a-螺旋的SEQ ID 30的免疫原，优选SEQ ID 75,或其 功能性活性变体，优选其中除去Cys379的变体；或者所述免疫原由上述组成； 其中所述导向佐剂和所述免疫原通过第一和第二肽a _螺旋的卷曲螺旋结构彼此结 合。
13. -种试剂盒，其用于制备根据权利要求1至12任一项所述的疫苗，所述试剂盒包括 下列组分 -导向佐剂，其至少包括连接至TLR9配体和第一肽a -螺旋的抗⑶32部分，和 -免疫原，其具有至少一个T细胞表位和与所述第一肽a-螺旋匹配的第二肽a-螺 旋。
14. 一种致敏疫苗，其至少包括药物制剂中的连接至TLR9配体和肽a -螺旋的抗⑶32 部分。
15. 根据权利要求14所述的疫苗，其中所述a -螺旋为卷曲螺旋双链螺旋。
16. 根据权利要求14或15所述的疫苗，其中所述TLR9配体为选自由CpG寡脱氧核苷 酸A、B和C类，或者模拟任意CpG寡脱氧核苷酸的免疫刺激肽组成的组的TLR9激动剂。
17. 根据权利要求14至16任一项所述的疫苗，其用于在利用根据权利要求1至10任 一项所述的免疫调节疫苗免疫治疗患者之前预先免疫所述患者。
18. -种包括免疫原性组合物的疫苗，所述免疫原性组合物包括 -导向佐剂，其至少包括连接至TLR9配体的抗⑶32部分，和 _免疫原，其结合至所述导向佐剂，优选通过连接或亲和结合； 其用于治疗受试者以瞬时诱发导向免疫原的IgG免疫应答，优选具有接种时诱导的 特异性最大IgG滴度，接着在接种时6个月内滴度减少至少30%、优选至少40%、或至少 50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或多至100%。
19. 根据权利要求18所述的疫苗，其中所述滴度减少为在一系列接种中的最后接种 时。
20. 根据权利要求18或19所述的疫苗，其中所述免疫原为或包括自体抗原的抗原或表 位。
21. 根据权利要求20所述的疫苗，其中所述自体抗原选自由肿瘤相关抗原（TAA)、前激 素和激素组成的组，所述肿瘤相关抗原优选由肿瘤细胞产生的肿瘤细胞表面受体或可溶性 抗原，例如Her2/neu、干扰素 a (INFa)、表皮生长因子（EGF)、EGF受体（EGF-R)、表皮细胞 粘附分子（EpCAM)、a-甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、MUC-1或路易斯Y，所述前激素和 激素例如消化性激素、甲状腺激或性激素中任一种，所述消化性激素包括胃泌素、胰泌素或 膜岛素。
22. 根据权利要求20或21所述的疫苗，其中所述受试者为人类且所述自体抗原为人 源。
23. 根据权利要求18至22任一项所述的疫苗，其中所述IgG免疫应答可逆。
【文档编号】A61K39/00GK104487083SQ201380037510
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2012年7月13日
【发明者】G·穆德 申请人:S-目标疗法有限公司