前列环素及类似物在体外抑制心肌成纤维细胞增殖的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种前列环素及类似物在体外抑制心肌成纤维细胞增殖的应用。对本发明对前列环素及其类似物发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，对于抑制心肌纤维增殖，改善心肌重构提供了有意义的参考。
【专利说明】前列环素及类似物在体外抑制心肌成纤维细胞增殖的应用
【技术领域】
[0001]心肌纤维化是指心肌组织结构中胶原纤维过量积聚、胶原浓度显著升高及胶原成分发生变化，按有无心肌细胞缺失、坏死和疤痕形成可分为反应性纤维化和修复性纤维化，它是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，可致心肌僵硬度增加、心室舒张及收缩功能减退、心肌电生理紊乱和心律失常、甚至心力衰竭，是心血管疾病的独立危险因素。心肌纤维化的形成主要是胶原合成代谢增加和(或)降解代谢减少的结果。心肌纤维化的形成机制非常复杂，机械性超负荷、炎症因子、氧化应激等多种因素均参与了心肌纤维化的形成与发展，而上述刺激因素均会引起内源性的心脏旁/自分泌系统(如内源性的肾素-血管紧张素-醛固酮系统、内皮素-一氧化氮系统)的调控紊乱，诱导心肌成纤维细胞增殖及胶原合成。目前心肌纤维化治疗药物主要包括抗血压药、基质金属蛋白酶抑制剂、内皮素受体阻断剂、脯氨酰羟化酶抑制剂、干细胞治疗等，但疗效欠佳。
[0002]前列环素作为前列腺素家族的重要成员，具有一定的心血管保护效应。前列环素主要由过氧化物酶体增殖体激活受体和前列环素受体介导，前者主要与血管生成和脂肪酸代谢有关，后者广泛分布于心血管组织。前列环素与受体结合后可激活腺苷酸环化酶，使胞浆中cAMP增多，进而通过cAMP相关的信号转导机制的发挥舒张血管、抑制血小板聚集、抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移、促进血管平滑肌细胞分化等作用，临应床上可用于肺动脉高压、动脉粥样硬化和心肌梗死等疾病的治疗。但是目前，前列环素对心肌成纤维细胞增殖及相关心肌纤维化中的影响尚未见报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种前列环素及类似物在抑制心肌成纤维细胞增殖中的
应用。`
[0004]本发明的技术解决方案是:
一种前列环素及其类似物在体外抑制心肌成纤维细胞增殖的应用。
[0005]一种前列环素及其类似物在制备抗心肌纤维化药物中的应用。
[0006]所述前列环素类似物是贝前列素。
[0007]本发明的前列环素及其相关类似物结构简单，制备方便，安全无毒，药理作用强，有着良好的药用前景。
[0008]前列环素类似物贝前列素(Berapsost)能够显著降低血管紧张素II (Ang II)诱导的心肌成纤维细胞增殖及羟脯氨酸分泌，减少I型胶原纤维的基因与蛋白表达，该作用是通过激活细胞表面前列环素受体而实现的，其机制与抑制TGF β -Smad通路的激活有关。
[0009]对本发明对前列环素及其类似物发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，对于抑制心肌纤维增殖，改善心肌重构提供了有意义的参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。[0011]图1是贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中细胞数目的影响示意图。林与空白对照组相比/X0.01，##与血管紧张素II组相比/X0.01。
[0012]图2是贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中羟脯氨酸含量的影响示意图。林与空白对照组相比/X0.01，##与血管紧张素II组相比/X0.01。
[0013]图3是贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中I型胶原mRNA表达的影响示意图。**与空白对照组相比/X0.01，#与血管紧张素II组相比/X0.05。
[0014]图4是贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中I型胶原蛋白表达的影响示意图。**与空白对照组相比/X0.01，#与血管紧张素II组相比/X0.05。
[0015]图5是贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中I型胶原蛋白表达的影响示意图。I型胶原为绿色荧光，细胞核为蓝色荧光，重叠后图为片淡黄色荧光。
[0016]图6是贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中TGF β I基因表达的影响示意图。**与空白对照组相比/Χ0.01，#与血管紧张素II组相比/Χ0.05。
[0017]图7是贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中TGF β I蛋白表达的影响示意图。**与空白对照组相比/Χ0.01，#与血管紧张素II组相比/Χ0.05。
[0018]图8是贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中Smad2蛋白表达和磷酸化的影响示意图。**与空白对照组相比/X0.01，#与血管紧张素II组相比/X0.05。
[0019]图9是前列环素受体干扰后，贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中细胞数目的影响示意图。**与阴性对照siRNA单独转染组相比/X0.01,##与阴性对照siRNA转染后血管紧张素II刺激组相比/X0.01,M与前列环素受体siRNA单独转染组相比/X0.01。
[0020]图10是前列环素受体干扰后，贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中羟脯氨酸含量的影响示意图。**与阴性对照siRNA单独转染组相比/X0.01,与阴性对照siRNA转染后血管紧张素II刺激组相比/X0.01，与前列环素受体siRNA单独转染组相比/X0.01。
[0021]图11是前列环素受体干扰后，贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中I型胶原mRNA表达的影响示意图。**与阴性对照SiRNA单独转染组相比/X0.01，#与阴性对照siRNA转染后血管紧张素II刺激组相比/X0.05，与前列环素受体siRNA单独转染组相比/X0.01。
[0022]图12是前列环素受体干扰后，贝前列素对血管紧张素II诱导心肌成纤维细胞增殖中I型胶原蛋白表达的影响示意图。**与阴性对照siRNA单独转染组相比/X0.01，#与阴性对照siRNA转染后血管紧张素II刺激组相比/X0.05，与前列环素受体siRNA单独转染组相比/X0.01。
[0023]
【具体实施方式】
[0024]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实例中所用前列环素类 似物贝前列素(beraprost)购买于美国cayman chemical公司，血管紧张素II购买于美国Sigma-Aldrich公司，其余使用的试剂和材料均为一般市售产品。
[0025]本发明所述化合物可以制成注射液，用于静脉滴注、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射。亦可以制成口服的胶囊，片剂等。
[0026]实施例1:前列环素对血管紧张素II诱导的心肌成纤维细胞增殖的作用及机制。
[0027]体外培养原代心肌成纤维细胞方法如下:清洁级SD乳鼠断颈脱白处死后，取其心脏，剪下心尖部用胰酶多次消化后离心，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基、37 ° C5% CO2孵箱中培养1.5小时后更换培养基，利用差速贴壁法弃去心肌细胞，然后再培养36-48小时后，观察细胞生长情况较好时，传代，换液、分组。实验分为三组:空白对照组:不添加任何药物；血管紧张素II组:血管紧张素II (IOOnM)刺激24小时；贝前列素组(beraprost):先给予贝前列素(10 μ Μ)预处理4小时,再添加血管紧张素II (IOOnM)刺激24小时。
[0028]1.1前列环素对血管紧张素II诱导的心肌成纤维细胞增殖的作用
原代培养的心肌成纤维细胞经上述处理后，CCK8法测定心肌成纤维细胞数目，检测培养基中羟脯氨酸含量反 映心肌胶原分泌，提取细胞RNA进行real-time PCR检测，以18s作为内参照；提取细胞蛋白进行western blot检测I型胶原表达，以磷酸甘油醛脱氢酶作为内参照；并用细胞免疫荧光法检测心肌成纤维细胞内I型胶原表达，以上方法都可有效的评估心肌成纤维细胞增殖程度。
[0029]图1利用商品化的CCK8试剂盒检测发现血管紧张素II能够显著增加心肌成纤维细胞数目，给予贝前列素预处理后，其数目明显减少；图2利用商品化的羟脯氨酸检测试剂盒发现，血管紧张素II能够显著增加心肌成纤维细胞分泌羟脯氨酸，给予贝前列素预处理后，其含量明显降低；图3显示血管紧张素II能够显著增加心肌成纤维细胞I型胶原mRNA表达，给予贝前列素预处理后，其表达明显减少；图4、5显示血管紧张素II能够显著增加心肌成纤维细胞I型胶原蛋白表达，给予贝前列素预处理后，其表达明显减少。
[0030]1.2前列环素对血管紧张素II诱导的心肌成纤维细胞增殖的作用机制 细胞经过上述处理后，提取细胞RNA进行real-time PCR检测TGF β I mRNA表达，以
18s作为内参照；提取细胞蛋白进行western blot检测TGF β I和Smad2蛋白表达
图6、7显示血管紧张素II能够显著增加心肌成纤维细胞TGF β ImRNA和蛋白表达，给予贝前列素预处理后，其表达明显减少；图8显示血管紧张素II能够显著增加心肌成纤维细胞Smad2磷酸化水平，给予贝前列素预处理后，其磷酸化水平明显降低，但对总Samd2的表达均没有明显影响。
[0031]实施例2:前列环素受体干扰后前列环素对血管紧张素II诱导的心肌成纤维细胞增殖的作用。
[0032]体外培养原代心肌细胞方法如下:清洁级SD乳鼠断颈脱白处死后，取其心脏，剪下心尖部用胰酶多次消化后离心，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基、37 ° C 5% CO2孵箱中培养1.5小时后更换培养基，利用差速贴壁法弃去心肌细胞，然后再培养36-48小时后，观察细胞生长情况较好时，传代，换液、分组。细胞饥饿4小时后，实验分为六组，转染能有效下调前列环素受体表达的siRNA (前列环素受体siRNA)，以无关序列的siRNA作为阴性对照(阴性对照siRNA)，然后再进行后续处理。具体分组及处理为:阴性对照siRNA组:只转染阴性对照siRNA ;阴性对照siRNA+血管紧张素II组:转染阴性对照siRNA24小时后，加入血管紧张素II (IOOnM)刺激24小时；阴性对照siRNA+血管紧张素11+贝前列素组:转染阴性对照siRNA24小时后，给予贝前列素(10 μ Μ)预处理4小时，再添加血管紧张素II (IOOnM)刺激24小时；前列环素受体siRNA组:只转染前列环素受体siRNA ;前列环素受体siRNA+血管紧张素II组:转染前列环素受体siRNA24小时后,加入血管紧张素II(IOOnM)刺激24小时；前列环素受体siRNA+血管紧张素11+贝前列素组:转染前列环素受体siRNA24小时后,给予贝前列素(10 μ Μ)预处理4小时,再添加血管紧张素II (IOOnM)刺激24小时。[0033]原代培养的心肌成纤维细胞经上述处理后，CCK8法测定心肌成纤维细胞数目，检测培养基中羟脯氨酸含量反映心肌胶原分泌，提取细胞RNA进行real-time PCR检测，以18s作为内参照；提取细胞蛋白进行western blot检测I型胶原表达，以磷酸甘油醛脱氢酶作为内参照。通过以上检测反映前列环素受体干扰后前列环素对血管紧张素II诱导的心肌成纤维细胞增殖的作用。
[0034]前列环素受体干扰后，图9显示，贝前列素预处理不能抑制血管紧张素II诱导的心肌成纤维数目增多；图10显示，贝前列素预处理不能抑制血管紧张素II诱导的心肌成纤维分泌羟脯氨酸增加；图11、12显示贝前列素预处理不能抑制血管紧张素II诱导的心肌成纤维I型胶原mRNA和蛋白表达上调。以上结果说明:前列环素类似物上述抑制心肌成纤维细胞增殖的作用是通过激活细胞表面前列环素受体而实现的。
【权利要求】
1.一种前列环素及类似物在体外抑制心肌成纤维细胞增殖的应用。
2.一种前列环素及类似物在制备抗心肌纤维化药物中的应用。
3.根据权利要求 2所述的前列环素及类似物在制备抗心肌纤维化药物中的应用，其特征是:所述前列环素类似物是贝前列素。
【文档编号】A61P9/00GK103705523SQ201410000645
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】孟国梁, 杨圣菊, 姚文娟, 朱红艳, 陈云, 张伟 申请人:南通大学