痰热清在制备破坏细菌生物膜的产品中的新用途
【专利摘要】本发明公开了痰热清在制备破坏细菌生物膜的产品中的一种新用途。本发明提供了痰热清在制备降解细菌生物膜的产品中的应用。本发明还保护痰热清在制备破坏细菌生物膜的产品中的应用。本发明还保护痰热清在制备抑制细菌生物膜形成的产品中的应用。本发明发现，痰热清不仅能抑制细菌生物膜的形成，还能降解成熟的细菌生物膜。本发明对于公共健康事业具有重大价值。
【专利说明】痰热清在制备破坏细菌生物膜的产品中的新用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及痰热清在制备破坏细菌生物膜的产品中的一种新用途。
【背景技术】
[0002]细菌生物膜是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的水合性基质所组成的结构性细菌群落。细菌生物膜广泛存在于含水和潮湿的各种表面上，包括自来水管道，工业管道、通风设备、医疗器械甚至病理状态下的人体组织器官，据专家估计几乎所有的细菌在一定的条件下都可以形成生物膜。生物膜中细菌的代谢活动除了能够腐蚀管道和金属表面外，更可导致动植物及人类疾病发生。由于细菌在生物膜状态有着比游走态高出千百倍的抗药性，使得生物膜在临床更易引发难治性慢性感染，严重威胁人类健康。
[0003]痰热清注射液是由上海凯宝药业有限公司生产、具有独家知识产权的国家中药二类新药，由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘等科学组方，严格按照中药指纹图谱生产而成，有清热解毒、化痰、解痉、抑茵、抗病毒、解热、免疫调节等作用。临床主要可用于肺炎、支气管炎、肝炎、病毒性脑炎、传染性单核细胞增多症等多种痰病的治疗。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供痰热清在制备破坏细菌生物膜的产品中的一种新用途。
[0005]本发明提供了痰 热清在制备降解细菌生物膜的产品中的应用。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCC? Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射 液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0006]本发明还保护痰热清在制备破坏细菌生物膜的产品中的应用。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCC'" Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0007]本发明还保护痰热清在制备抑制细菌生物膜形成的产品中的应用。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCC? Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0008]本发明还保护一种降解细菌生物膜的产品，其活性成分为痰热清。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCC? Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0009]本发明还保护一种破坏细菌生物膜的产品，其活性成分为痰热清。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCCs Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0010]本发明还保护一种抑制细菌生物膜形成的产品，其活性成分为痰热清。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCCs Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。 [0011]本发明以金黄色葡萄球菌为例，利用微孔板法、激光共聚焦、Bioflux剪切力模型等研究了痰热清对细菌生物膜形成的不同时期、不同状态的影响。从微孔板法实验结果来看:痰热清、青霉素钠均对细菌生物膜的形成过程有影响，均能够抑制细菌生物膜的生物总量，并有效减少细菌生物膜中的活菌数量；当细菌生物膜成熟后，只有痰热清能够抑制细菌生物膜的生物总量，并有效减少细菌生物膜中的活菌数量，青霉素钠失去上述作用。基于上述发现，发明人推测痰热清破坏了细菌生物膜结构，为了验证这一猜测，发明人通过检测经痰热清处理后的滤膜(滤膜上有成熟的细菌生物膜)的抗生素的渗透量的多少，来间接反映痰热清对细菌生物膜结构的破坏，实验结果表明，经痰热清处理后的滤膜的抗生素渗透量增大，而对照组和青霉素钠处理组检测不到抗生素的渗透。为了直观观察痰热清对细菌生物膜的影响，用荧光染料对生物膜进行活菌(syto-9)、死菌(PI)及细菌外基质(matrix)三标后，通过激光共聚焦显微镜观察，青霉素钠(阳性对照)、痰热清对于细菌生物膜的形成过程有显著效果，只有痰热清对成熟的细菌生物膜有效果，这与微孔板的结果一致。为了模拟体内生物膜所处环境，发明人采用了 Bioflux剪切力模型。从bioflux结果来看:给细菌生物膜施加青霉素钠后，其状态和电子密度及体积均无明显改变；给细菌生物膜施加痰热清30min后即出现空洞，Ih时生物膜开始与管道剥离，到5h生物膜变得松散，IOh时生物膜消散、破解；此结果与微孔板结果和激光共聚焦显微镜观察的结果一致，均说明了痰热清对成熟的细菌生物膜有破坏作用，而青霉素钠对成熟的细菌生物膜无作用。
[0012]生物膜成熟后，基质包裹在细菌外表面，形成很有序的结构，因此成熟的细菌生物膜具有很强的耐药性，所以找到一种能降解成熟的细菌生物膜的药物显得非常必要。本发明发现，痰热清不仅能抑制细菌生物膜的形成，还能降解成熟的细菌生物膜。本发明对于公共健康事业具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例1的步骤一的结果。
[0014]图2为实施例1的步骤二的结果。
[0015]图3为实施例1的步骤三的结果(硫酸卡那霉素)。
[0016]图4为实施例1的步骤四的结果(盐酸万古霉素)。
[0017]图5为实施例2的步骤一的结果。
[0018]图6为实施例2的步骤二的结果。
[0019]图7为实施例3的步骤一的结果。
[0020]图8为实施例3的步骤二的结果。
[0021]图9为实施例4的结果。【具体实施方式】
[0022]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。LIVE, DHAD? BacLight Bacterial Viability 试剂盒:美国 MolecularProbes公司)。激光共聚焦显微镜:0LYMPUS，FV1000。数控剪切流活细胞自动分析平台:BioFlux200systerm。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus): ATCCT Number 为 25923。
[0023]LB培养基:取胰蛋白胨IOg(英国OXOID公司)、酵母提取物5g(英国OXOID公司)、NaCllOg (北京市庆盛达化工技术有限公司)，溶于去离子水并用去离子水定容至1L。基础培养液为含0.25g/100mL葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)的LB培养基。LB固体培养基为含2g/100mL琼脂的LB培养基。
[0024]痰热清注射液(上海凯宝药业股份有限公司):为由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘五味中药提取物，国药准字Z20030054 ;使用时，将痰热清注射液冷冻干燥得到干粉；实施例中将干粉溶于基础培养液，痰热清的浓度以每毫升培养液中含有的干粉微克数计。
[0025]青霉素钠注射液，又称注射用青霉素钠:华北制药股份有限公司，批号X1108105 ；使用时，将青霉素钠注射液冷冻干燥得到干粉；实施例中将干粉溶于基础培养液，青霉素钠的浓度以每毫升培养液中含有的干粉微克数计。
[0026]硫酸卡那霉素注射 液，又称硫酸卡那霉素，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号DH1774 ;使用时，将硫酸卡那霉素注射液冷冻干燥得到干粉；实施例中将干粉溶于基础培养液，硫酸卡那霉素的浓度以每毫升培养液中含有的干粉微克数计。
[0027]盐酸万古霉素注射液，又称注射用盐酸万古霉素，购自Eli Lilly JapanK.K, Seishin Laboratories,产品目录号C008056 ;使用时，将盐酸万古霉素注射液冷冻干燥得到干粉；实施例中将干粉溶于基础培养液，盐酸万古霉素的浓度以每毫升培养液中含有的干粉微克数计。
[0028]实施例1、微孔板法检测痰热清对细菌生物膜的影响
[0029]为观察痰热清对细菌生物膜的影响，本实施例分别选取了细菌生物膜形成前期及细菌生物膜形成后期两个阶段，观察痰热清对细菌生物膜生物总量(生物总量包括活菌、死菌和细胞外基质)的影响和痰热清对细菌生物膜内活菌数的影响。
[0030]一、微孔板法检测痰热清对细菌生物膜形成的影响[0031 ] 1、分组处理(每组设置5个重复处理)
[0032]第一组至第十组:将金黄色葡萄球菌接种至培养液(第一组至第十组的培养液依次为:含 16500 μ g/ml、8250 μ g/ml、4125 μ g/ml、2063 μ g/ml、1032 μ g/ml、516 μ g/ml、258μ g/ml、129l.! g/ml、65l.! g/ml或33 μ g/ml痰热清的基础培养液)，使初始OD600nm值为0.05，37。。静置24小时；
[0033]第十一组至第二十组:将金黄色葡萄球菌接种至培养液(第十一组至第二十组的培养液依次为:含 20 μ g/ml、10 μ g/ml>5 μ g/ml、2.5 μ g/ml、1.25 μ g/ml、0.625 μ g/ml、0.31 μ g/ml、0.15 μ g/ml、0.075 μ g/ml或0.038 μ g/ml青霉素钠的基础培养液)，使初始OD600nm 值为 0.05，37°C 静置 24 小时；[0034]第二^^一组(阴性对照):将金黄色葡萄球菌接种至基础培养液，使初始OD6tltol值为0.05，37。。静置24小时；
[0035]实验在96孔板中进行。
[0036]2、取完成步骤I的96孔板，用0.9%生理盐水清洗2次(以去除孔中未粘附的细菌)。
[0037]3、取完成步骤2的96孔板，采用结晶紫染色法检测每孔中的生物总量，结果见图1A (*P<0.05)ο
[0038]4、取完成步骤2的96孔板，采用XTT染色法检测每孔中的活菌量，结果见图1B(*Ρ〈0.05)。
[0039]图1的结果表明:在细菌生物膜形成阶段，痰热清和青霉素钠均可降低其生物总量，痰热清的有效作用浓度为1032-16500 μ g/ml，青霉素钠的有效作用浓度为 0.038-20 μ g/ml ;在细菌生物膜形成阶段，痰热清和青霉素钠均可降低其活菌量，青霉素钠的有效作用浓度为0.038-20 μ g/ml，痰热清的有效作用浓度为129-16500 μ g/ml。各组中，5个重复处理的结果一致。
[0040]二、微孔板法检测痰热清对成熟细菌生物膜的影响[0041 ] 1、分组处理(每组设置5个重复处理)
[0042]第一组至第十组:将金黄色葡萄球菌接种至基础培养液，使初始OD6tltol值为0.05，37°C静置24小时，弃除上清，加入培养液(第一组至第十组的培养液依次为:含16500 μ g/ml、8250 μ g/ml、4125 μ g/ml、2063 μ g/ml、1032 μ g/ml、516 μ g/ml、258 μ g/ml、129 μ g/ml、65 μ g/ml或33 μ g/ml痰热清的基础培养液)，37°C静置24小时；
[0043]第十一组至第二十组:将金黄色葡萄球菌接种至基础培养液，使初始OD6tltlnm值为0.0 5，3 7 °C静置2 4小时，弃除上清，加入培养液(第十一组至第二十组的培养液依次为:含 20 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml、2.5 μ g/ml、1.25 μ g/ml、0.625 μ g/ml、0.31 μ g/ml、
0.15 μ g/ml、0.075 μ g/ml或0.038 μ g/ml青霉素钠的基础培养液)，37°C静置24小时；
[0044]第二H^一组(阴性对照):将金黄色葡萄球菌接种至基础培养液，使初始OD6tltol值为
0.05，37°C静置24小时，弃除上清，加入基础培养液，37°C静置24小时；
[0045]实验在96孔板中进行。
[0046]2、同步骤一的2。
[0047]3、同步骤一的3，结果见图2A (*Ρ〈0.05 )。
[0048]4、同步骤一的4，结果见图2Β (*Ρ〈0.05)。
[0049]图2的结果表明:对于成熟的细菌生物膜，青霉素钠对其生物总量无影响作用，而痰热清可以降低其生物总量，痰热清的有效作用浓度为33-1032μ g/ml ;对于成熟的细菌生物膜，除了 20 μ g/ml浓度以外，青霉素钠对其活菌量无影响作用，而痰热清可以降低其活菌量，有效浓度为65-16500 μ g/ml。各组中，5个重复处理的结果一致。
[0050]本实施例的结果表明，青霉素钠只对细菌生物膜的形成过程有抑制或降解作用，痰热清不仅对细菌生物膜的形成过程有抑制或降解作用、对成熟的细菌生物膜也具有抑制或降解作用。
[0051]三、其它药物对成熟细菌生物膜的影响
[0052]用硫酸卡那霉素代替青霉素钠进行上述步骤二的实验，生物总量的结果见图3A(***Ρ〈0.05),活菌量的结果见图3Β(***Ρ〈0.05)。用盐酸万古霉素代替青霉素钠进行上述步骤二的实验，生物总量的结果见图4Α (#*Ρ〈0.05)，活菌量的结果见图4Β (#*Ρ〈0.05)。除20 μ g/ml的硫酸卡那霉素对细菌的活菌量有影响外，硫酸卡那霉素和盐酸万古霉素对成熟的细菌生物膜的总生物量和活菌量均无显著影响。
[0053]实施例2、利用抗生素渗透性研究痰热清对细菌生物膜结构的作用
[0054]一、不同作用时间下究痰热清对生物膜结构的作用
[0055]1、取6孔板中，每孔加入4ml OD600nm=0.05的金黄色葡萄球菌菌液(菌液是用基础培养液重悬金黄色葡萄球菌菌体得到的)，然后每孔放入一个15 X 15mm的滤膜，37°C培养48h，以在滤膜上表面形成成熟的细菌生物膜。
[0056]2、分组处理
[0057]第一组:完成步骤I后，将滤膜移至含不同浓度的痰热清的基础培养液(分别为含16500 μ g/ml,8250 μ g/ml,4125 μ g/ml 或 2062 μ g/ml 痰热清的基础培养液)中 37°C静置24h ；
[0058]第二组:完成步骤I后，将滤膜移至含不同浓度的青霉素钠的基础培养液(分别为含20 μ g/ml、10 μ g/ml,5 μ g/ml或2.5 μ g/ml青霉素钠的基础培养液)中37°C静置24h ；
[0059]第三组(阴性对照):完成步骤I后，将滤膜移至基础培养液中37°C静置24h。
[0060]3、完成步骤2后，将滤膜放置于含20 μ g/ml青霉素钠的LB固体培养基平板上，滤膜上覆盖一个新的15X15mm的无菌滤膜，形成细菌生物膜三明治，在新的无菌滤膜上再放置一个直径为6mm的滤纸片，在滤纸片上滴加5 μ I基础培养液润湿，37°C静置2h、4h或6h。
[0061]4、完成步骤3后，取滤纸并放置于涂布有金黄色葡萄球菌的LB固体培养基平板上，37°C培养18-24h，观察抑菌圈。
[0062]步骤2至步骤3中，均保持细菌生物膜向上。
[0063]步骤4中培养24小时后的照片见图5。第一组进行步骤4后均能观察到抑菌圈，第二组和第三组进行步骤4后均不能观察到抑菌圈。
[0064]二、药敏实验
[0065]将滤纸放置于涂布有金黄色葡萄球菌的LB固体培养基培养基平板上,上面滴加5 μ I含青霉素钠的基础培养液或滴加5 μ I含痰热清的基础培养液，37°C培养18-24h，观察抑菌圈。培养24小时后的照片见图6。可以看出，痰热清本身并无抑菌圈，而青霉素钠抑菌圈较大。
[0066]综合步骤一和步骤二的结果，结论如下:步骤一的2中，第一组为痰热清处理组，痰热清破坏了细菌生物膜结构，使得步骤3中的青霉素钠能够通过细菌生物膜并渗透到滤纸内，从而使得滤纸具有杀菌作用；步骤一的2中，第二组为青霉素钠处理组，青霉素钠不能破坏细菌生物膜结构，从而步骤3中的青霉素钠无法通过细菌生物膜渗透到滤纸内，滤纸没有杀菌作用。结果表明，对于成熟的细菌生物膜，青霉素钠不具有抑制或降解作用，而痰热清具有显著的抑制或降解作用。
[0067]实施例3、通过激光共聚焦显微镜观察痰热清对细菌生物膜的影响
[0068]一、对细菌生物膜形成的影响
[0069]第一组(痰热清组): 在小玻璃皿中加入含2063 μ g/ml痰热清的基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltol值为0.05的体系，37°C静置24小时，弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对活细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matrix染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm)，利用imaris软件进行图像及数据分析，结果见图7。
[0070]第二组(青霉素钠组):在小玻璃皿中加入含20 μ g/ml青霉素钠的基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值为0.05的体系，37°C静置24小时，弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌 进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matrix染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm)，利用imaris软件进行图像及数据分析，结果见图7。
[0071]第三组(对照组):在小玻璃皿中加入基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值为0.05的体系，37°C静置24小时，弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matrix染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm),利用imaris软件进行图像及数据分析，结果见图7。
[0072]由图7可以观察到，在细菌生物膜形成阶段，青霉素钠和痰热清的杀菌效果都很好，活菌、死菌及细胞外基质的量都大大减少，细菌生物膜变薄、体积变小，这与微孔板的检测结果一致。每组设置5个重复处理。各组中，5个重复处理的结果一致。
[0073]二、对成熟细菌生物膜的影响
[0074]第一组(痰热清组):在小玻璃皿中加入基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值为0.05的体系，37°C静置24小时；弃除上清，加入含2063 μ g/ml痰热清的基础培养液，37°C静置24小时；弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matriX染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm),利用imaris软件进行图像及数据分析,结果见图8。
[0075]第二组(青霉素钠组):在小玻璃皿中加入基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值为0.05的体系，37°C静置24小时；弃除上清，加入含20 μ g/ml青霉素钠的基础培养液，37°C静置24小时；弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matriX染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm),利用imaris软件进行图像及数据分析,结果见图8。
[0076]第三组(对照组):在小玻璃皿中加入基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltol值为0.05的体系，37°C静置24小时；弃除上清，加入基础培养液，37°C静置24小时；弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matrix染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm),利用imaris软件进行图像及数据分析,结果见图8。
[0077]由图8可以观察到:对于成熟的细菌生物膜，痰热清可使其活菌大大减少，死菌大大增多，细胞外基质减少，使细菌生物膜变薄、体积变小；对于成熟的细菌生物膜，青霉素钠失去作用。该结论与微孔板的检测结果相符。每组设置5个重复处理。各组中，5个重复处
理的结果一致。
[0078]由步骤一和步骤二可以得出如下结论:青霉素钠只对细菌生物膜的形成过程有作用，对成熟的细菌生物膜失去作用，痰热清不仅对细菌生物膜的形成过程有作用，对成熟的细菌生物膜也具有抑制或降解作用。
[0079]实施例4、BioFlux细菌生物膜模型构建
[0080]1、在 BioFlux Plate 出口加入 200 μ L OD6tltlnm=0.6-0.8 的金黄色葡萄球菌菌液(菌液是用基础培养液重悬金黄色葡萄球菌菌体得到的)，出口至入口方向给力5dyn/cm2、5min，静置lh，弃去入口及出口的废液。
[0081]2、在BioFlux Plate入口加入100 μ L OD6tltlnm=0.6-0.8的金黄色葡萄球菌菌液(菌液是用基础培养液重悬金黄色葡萄球菌菌体得到的)，出口加入100 μ L OD600nm=0.6-0.8的金黄色葡萄球菌菌液(菌液是用基础培养液重悬金黄色葡萄球菌菌体得到的)，出口至入口方向给力2dyn/cm2、2s，静置2_4h，镜下可见观察窗内布满细菌，弃去入口及出口的废液。 [0082]3、在BioFlux Plate入口加入ImL OD600nm=0.6-0.8的金黄色葡萄球菌菌液(菌液是用基础培养液重悬金黄色葡萄球菌菌体得到的)，出口加入100 μ L OD600nm=0.6-0.8的金黄色葡萄球菌菌液(菌液是用基础培养液重悬金黄色葡萄球菌菌体得到的)，入口至出口方向给力0.15dyn/cm2,培养2_4d,形成成熟的生物膜。
[0083]4、分组处理
[0084]第一组(痰热清组):在BioFlux Plate入口加入ImL含2063 μ g/ml痰热清的基础培养液，入口至出口方向给力0.15dyn/cm2 ;前半小时每IOmin拍照一次,半小时后每30min拍照一次，观察痰热清对生物膜的影响；
[0085]第二组(青霉素钠组):在BioFlux Plate入口加入ImL含20 μ g/ml青霉素钠的基础培养液，入口至出口方向给力0.15dyn/cm2 ;前半小时每IOmin拍照一次,半小时后每30min拍照一次，观察青霉素钠对生物膜的影响。
[0086]为了模拟体内生物膜所处环境，本实施例采用了 Bioflux剪切力模型。Bioflux剪切力模型是一种接近于真实状态的细菌生物膜模型，在精确的推动力作用下，模拟细菌在机体内形成细菌生物膜的动态过程，所形成的细菌生物膜是真实的细菌生物膜，该模型可动态、直观地反应药物对细菌生物膜的作用过程。
[0087]不同时间后的照片见图9。加入青霉素钠后，细菌生物膜的状态和电子密度及体积均无明显改变。加入痰热清30min后管道中两个球形生物膜之间的部分开始出现空洞，Ih时生物膜开始与管道剥离，5h时生物膜变得松散、电子密度明显变小，IOh时管道中右侧一团生物膜消散、左侧的一团生物膜破解。本实施例的结果与微孔板结果以及激光共聚焦显微镜观察结果一致，均说明了痰热清对成熟的细菌生物膜有破坏作用，而青霉素钠对成熟的细菌生物膜无作用。每组设置5个重复处理。各组中，5个重复处理的结果一致。
【权利要求】
1.痰热清在制备降解细菌生物膜的产品中的应用。
2.痰热清在制备破坏细菌生物膜的产品中的应用。
3.痰热清在制备抑制细菌生物膜形成的产品中的应用。
4.如权利要求1至3中任一所述的应用，其特征在于:所述细菌为金黄色葡萄球菌。
5.如权利要求1至5中任一所述的应用，其特征在于:所述痰热清为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。
6.一种降解细菌生物膜的产品，其活性成分为痰热清。
7.一种破坏细菌生物膜的产品，其活性成分为痰热清。
8.一种抑制细菌生物膜形成的产品，其活性成分为痰热清。
9.如权利要求6至8中任一所述的产品，其特征在于:所述细菌为金黄色葡萄球菌。
10.如权利要求6至9中任一所述的产品，其特征在于:所述痰热清为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。
【文档编号】A61K35/32GK103720768SQ201410005060
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】王毅, 刘冲, 刘绍勇, 刘宜善, 王国明, 王艺竹, 于友华, 李连达 申请人:上海凯宝药业股份有限公司