熊胆粉在制备破坏细菌生物膜的产品中的新用途
【专利摘要】本发明公开了熊胆粉在制备破坏细菌生物膜的产品中的一种新用途。本发明提供了熊胆或熊胆粉在制备降解细菌生物膜的产品中的应用。本发明还保护熊胆或熊胆粉在制备破坏细菌生物膜的产品中的应用。本发明还保护熊胆或熊胆粉在制备抑制细菌生物膜形成的产品中的应用。本发明发现，熊胆或熊胆粉不仅能抑制细菌生物膜的形成，还能降解成熟的细菌生物膜。本发明对于公共健康事业具有重大价值。
【专利说明】熊胆粉在制备破坏细菌生物膜的产品中的新用途
【技术领域】[0001]本发明涉及熊胆粉在制备破坏细菌生物膜的产品中的一种新用途。
【背景技术】
[0002]细菌生物膜是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的水合性基质所组成的结构性细菌群落。细菌生物膜广泛存在于含水和潮湿的各种表面上，包括自来水管道，工业管道、通风设备、医疗器械甚至病理状态下的人体组织器官，据专家估计几乎所有的细菌在一定的条件下都可以形成生物膜。生物膜中细菌的代谢活动除了能够腐蚀管道和金属表面外，更可导致动植物及人类疾病发生。由于细菌在生物膜状态有着比游走态高出千百倍的抗药性，使得生物膜在临床更易引发难治性慢性感染，严重威胁人类健康。
[0003]熊胆为传统名贵中药，用于治疗惊风抽搐、目赤、咽喉肿痛等症。熊胆具有镇静、抗惊、解热、解痉、利胆、抑菌等作用，可以用于心血管病的治疗。熊胆粉成份比较复杂，主要含熊去氧胆酸，其次为鹅去氧胆酸、去氧胆酸和胆酸，还含有胆色素、粘蛋白、氨基酸(谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸等十八种氨基酸)、胆固醇、磷脂、无机盐、微量元素、水份
坐寸ο
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供熊胆粉在制备破坏细菌生物膜的产品中的一种新用途。
[0005]本发明提供了熊胆或熊胆粉在制备降解细菌生物膜的产品中的应用。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCCe Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述熊胆粉具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的熊胆粉。
[0006]本发明还保护熊胆或熊胆粉在制备破坏细菌生物膜的产品中的应用。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATLXT Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述熊胆粉具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的熊胆粉。
[0007]本发明还保护熊胆或熊胆粉在制备抑制细菌生物膜形成的产品中的应用。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATClT Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述熊胆粉具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的熊胆粉。
[0008]本发明还保护一种降解细菌生物膜的产品，其活性成分为熊胆或熊胆粉。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATOT Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述熊胆粉具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的熊胆粉。
[0009]本发明还保护一种破坏细菌生物膜的产品，其活性成分为熊胆或熊胆粉。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCCs Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述熊胆粉具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的熊胆粉。
[0010]本发明还保护一种抑制细菌生物膜形成的产品，其活性成分为熊胆或熊胆粉。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCC.Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述熊胆粉具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的熊胆粉。
[0011]本发明以金黄色葡萄球菌为例，利用微孔板法、激光共聚焦等研究了熊胆粉对细菌生物膜形成的不同时期、不同状态的影响。从微孔板法实验结果来看:熊胆粉、青霉素钠均对细菌生物膜的形成过程有影响，均能够抑制细菌生物膜的生物总量，并有效减少细菌生物膜中的活菌数量；当细菌生物膜成熟后，只有熊胆粉能够抑制细菌生物膜生物总量，并有效减少细菌生物膜中的活菌数量，青霉素钠失去上述作用。为了直观观察熊胆粉对细菌生物膜的影响，用荧光染料对生物膜进行活菌(syto-9)、死菌(PI)及细菌外基质(matrix)三标后，通过激光共聚焦显微镜观察，青霉素钠(阳性对照)、熊胆粉对于细菌生物膜的形成过程有显著效果，只有熊胆粉对细菌的成熟生物膜有效果(使细菌生物膜中的活菌大大减少，死菌大大增多，细胞外基质减少，生物膜变薄、体积变小)，这与微孔板的结果一致。
[0012]生物膜成熟后，基质包裹在细菌外表面，形成很有序的结构，因此成熟的细菌生物膜具有很强的耐药性，所以找到一种能降解成熟的细菌生物膜的药物显得非常必要。本发明发现，熊胆粉不仅能抑制细菌生物膜的形成，还能降解成熟的细菌生物膜。本发明对于公共健康事业具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例1的步骤一的结果。
[0014]图2为实施例1的步骤二的结果。
[0015]图3为实施例1的步骤三的结果(硫酸卡那霉素)。
0016]图4为实施例1的步骤四的结果(盐酸万古霉素)。
[0017]图5为实施例2的步骤一的结果。
[0018]图6为实施例2的步骤二的结果。
【具体实施方式】
[0019]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。LIVK/DEAD? BacLight Bacterial Viability 试剂盒:美国 MolecularProbes公司)。激光共聚焦显微镜:0LYMPUS，FV1000。数控剪切流活细胞自动分析平台:BioFlux200systermo 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus): ATCC*Number 为 25923。
[0020]LB培养基:取胰蛋白胨IOg(英国OXOID公司)、酵母提取物5g(英国OXOID公司)、NaCllOg (北京市庆盛达化工技术有限公司)，溶于去离子水并用去离子水定容至1L。基础培养液为含0.25g/100mL葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)的LB培养基。
[0021]熊胆粉:上海凯宝药业股份有限公司；称取熊胆粉4.535g，加入注射用水100ml，用10%Na0H水溶液调pH=9.0±0.5，充分溶解后，用注射用水定容至500ml，然后用0.22 μ m的微孔滤膜过滤并收集滤液，灌装(每支30mL)、密封、灭菌(10(TC，流通蒸汽灭菌45min)，即为熊胆粉原液；实施例中，将熊胆粉原液用基础培养液稀释至8倍体积或16倍体积，得到含1134 μ g/ml熊胆粉的基础培养液或含567 μ g/ml熊胆粉的基础培养液，其它浓度以此类推。
[0022]青霉素钠注射液，又称注射用青霉素钠:华北制药股份有限公司，批号X1108105 ；使用时，将青霉素钠注射液冷冻干燥得到干粉；实施例中将干粉溶于基础培养液，青霉素钠的浓度以每毫升培养液中含有的干粉微克数计。
[0023]硫酸卡那霉素注射液，又称硫酸卡那霉素，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号DH1774 ;使用时，将硫酸卡那霉素注射液冷冻干燥得到干粉；实施例中将干粉溶于基础培养液，硫酸卡那霉素的浓度以每毫升培养液中含有的干粉微克数计。
[0024]盐酸万古霉素注射液，又称注射用盐酸万古霉素，购自Eli Lilly JapanK.K, Seishin Laboratories,产品目录号C008056 ;使用时，将盐酸万古霉素注射液冷冻干燥得到干粉；实施例中将干粉溶于基础培养液，盐酸万古霉素的浓度以每毫升培养液中含有的干粉微克数计。
[0025]实施例1、微孔板法检测熊胆粉对细菌生物膜的影响
[0026]为观察熊胆粉对细菌生物膜的影响，本实施例分别选取了细菌生物膜形成前期及细菌生物膜形成后期两个阶段，观察熊胆粉对细菌生物膜生物总量(生物总量包括活菌、死菌和细胞外基质)的影响和熊胆粉对细菌生物膜内活菌数的影响。
[0027]—、微孔板法检测熊胆粉对细菌生物膜形成的影响
[0028]1、分组处理(每组设置5个重复处理)
[0029]第一组至第十组:将金黄色葡萄球菌接种至培养液(第一组至第十组的培养液依次为:含 4535 μ g/ml、2268 μ g/ml、1134 μ g/ml、567 μ g/ml、284 μ g/ml、142 μ g/ml、71 μ g/ml、36 μ g/ml、18 μ g/ml或9 μ` g/ml熊胆粉的基础培养液)，使初始OD6tltol值为0.05，37°C静置24小时；
[0030]第十一组至第二十组:将金黄色葡萄球菌接种至培养液(第十一组至第二十组的培养液依次为:含 20 μ g/ml、10 μ g/ml>5 μ g/ml、2.5 μ g/ml、1.25 μ g/ml、0.625 μ g/ml、
0.31 μ g/ml、0.15 μ g/ml、0.075 μ g/ml或0.038 μ g/ml青霉素钠的基础培养液)，使初始OD600nm 值为 0.05，37°C 静置 24 小时；
[0031]第二H^一组(阴性对照):将金黄色葡萄球菌接种至基础培养液，使初始OD6tltol值为
0.05，37。。静置24小时；
[0032]实验在96孔板中进行。
[0033]2、取完成步骤I的96孔板，用0.9%生理盐水清洗2次(以去除孔中未粘附的细菌)。
[0034]3、取完成步骤2的96孔板，采用结晶紫染色法检测每孔中的生物总量，结果见图1A (*P<0.05)ο
[0035]4、取完成步骤2的96孔板，采用XTT染色法检测每孔中的活菌量，结果见图1B(*Ρ〈0.05)。
[0036]图1的结果表明:在细菌生物膜形成阶段，熊胆粉和青霉素钠均可降低其生物总量，熊胆粉的有效作用浓度为9-4535 μ g/ml，青霉素钠的有效作用浓度为0.038-20 μ g/ml ;在细菌生物膜形成阶段，熊胆粉和青霉素钠均可降低其活菌量，青霉素钠的有效作用浓度为0.038-20 μ g/ml，熊胆粉的有效作用浓度为36-4535 μ g/ml。各组中，5个重复处理的结果一致。
[0037]二、微孔板法检测熊胆粉对成熟细菌生物膜的影响
[0038]1、分组处理(每组设置5个重复处理)
[0039]第一组至第十组:将金黄色葡萄球菌接种至基础培养液，使初始OD6tltol值为0.05，37°C静置24小时，弃除上清，加入培养液(第一组至第十组的培养液依次为:含4535 μ g/ml>2268 μ g/ml>1134 μ g/ml、567 μ g/ml、284 μ g/ml>142 μ g/ml>71 μ g/ml>36 μ g/ml、18 μ g/ml或9 μ g/ml熊胆粉的基础培养液)，37°C静置24小时； [0040]第^^一组至第二十组:将金黄色葡萄球菌接种至基础培养液，使初始OD6tltlnm值为0.0 5，3 7 °C静置2 4小时，弃除上清，加入培养液(第十一组至第二十组的培养液依次为:含 20 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml、2.5 μ g/ml、1.25 μ g/ml、0.625 μ g/ml、0.31 μ g/ml、
0.15 μ g/ml、0.075 μ g/ml或0.038 μ g/ml青霉素钠的基础培养液)，37°C静置24小时；
[0041]第二H^一组(阴性对照):将金黄色葡萄球菌接种至基础培养液，使初始OD6tltol值为
0.05，37°C静置24小时，弃除上清，加入基础培养液，37°C静置24小时；
[0042]实验在96孔板中进行。
[0043]2、同步骤一的2。
[0044]3、同步骤一的3，结果见图2A (*Ρ〈0.05 )。
[0045]4、同步骤一的4，结果见图2Β (*Ρ〈0.05)。
[0046]图2的结果表明:对于成熟的细菌生物膜，青霉素钠对其生物总量无影响作用，而熊胆粉可以降低其生物总量，熊胆粉的有效作用浓度为9-4535μ g/ml ;对于成熟的细菌生物膜，青霉素钠对其活菌量无影响作用，而熊胆粉可以降低其活菌量，有效浓度为142-4535 μ g/ml ο各组中，5个重复处理的结果一致。
[0047]本实施例的结果表明，青霉素钠只对细菌生物膜的形成过程有抑制或降解作用，熊胆粉不仅对细菌生物膜的形成过程有抑制或降解作用、对成熟的细菌生物膜也具有抑制或降解作用。
[0048]三、其它药物对成熟细菌生物膜的影响
[0049]用硫酸卡那霉素代替青霉素钠进行上述步骤二的实验，生物总量的结果见图3A(***Ρ〈0.05),活菌量的结果见图3Β(***Ρ〈0.05)。用盐酸万古霉素代替青霉素钠进行上述步骤二的实验，生物总量的结果见图4Α (#*Ρ〈0.05)，活菌量的结果见图4Β (#*Ρ〈0.05)。除20 μ g/ml的硫酸卡那霉素对细菌的活菌量有影响外，硫酸卡那霉素和盐酸万古霉素对成熟的细菌生物膜的总生物量和活菌量均无显著影响。
[0050]实施例2、通过激光共聚焦显微镜观察熊胆粉对细菌生物膜的影响
[0051]一、对细菌生物膜形成的影响
[0052]第一组(熊胆粉组):在小玻璃皿中加入含567μ g/ml熊胆粉的基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltol值为0.05的体系，37°C静置24小时，弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对活细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matrix染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm)，利用imaris软件进行图像及数据分析，结果见图5。
[0053]第二组(青霉素钠组):在小玻璃皿中加入含20 μ g/ml青霉素钠的基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值为0.05的体系，37°C静置24小时，弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matrix染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm)，利用imaris软件进行图像及数据分析，结果见图5。
[0054]第三组(对照组):在小玻璃皿中加入基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值为0.05的体系，37°C静置24小时，弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matrix染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm),利用imaris软件进行图像及数据分析，结果见图5。
[0055]由图5可以观察到，在细菌生物膜形成阶段，青霉素钠和熊胆粉的杀菌效果都很好，活菌、死菌及细胞外基质的量都大大减少，细菌生物膜变薄、体积变小，这与微孔板的检测结果一致。每组设置5个重复处理。各组中，5个重复处理的结果一致。
[0056]二、对成熟细菌生物膜的影响
[0057]第一组(熊胆粉组):在小玻璃皿中加入基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值为0.05的体系，37°C静置24小时；弃除上清，加入含567 μ g/ml熊胆粉的基础培养液，37°C静置24小时；弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matriX染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm),利用imaris软件进行图像及数据分析,结果见图6。
[0058]第二组(青霉素钠`组):在小玻璃皿中加入基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值为0.05的体系，37°C静置24小时；弃除上清，加入含20 μ g/ml青霉素钠的基础培养液，37°C静置24小时；弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matriX染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm),利用imaris软件进行图像及数据分析,结果见图6。
[0059]第三组(对照组):在小玻璃皿中加入基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltol值为0.05的体系，37°C静置24小时；弃除上清，加入基础培养液，37°C静置24小时；弃去上清，用0.9%生理盐水清洗两次(去掉未粘附细菌)，然后进行matrix染料染色(对细胞外基质染色)、PI染色(对死细菌进行染色)和Syto9染色(对或细菌进行染色)，在激光共聚焦显微镜上观察(P1、Syto9、matrix染料所需的激发波长依次为488nm、559nm和559nm),利用imaris软件进行图像及数据分析,结果见图6。
[0060]由图6可以观察到:对于成熟的细菌生物膜，熊胆粉可使其活菌大大减少，死菌大大增多，细胞外基质减少，使细菌生物膜变薄、体积变小；对于成熟的细菌生物膜，青霉素钠失去作用。该结论与微孔板的检测结果相符。每组设置5个重复处理。各组中，5个重复处
理的结果一致。
[0061]由步骤一和步骤二可以得出如下结论:青霉素钠只对细菌生物膜的形成过程有作用，对成熟的细菌生物膜失去作用，熊胆粉不仅对细菌生物膜的形成过程有作用，对成熟的细菌生物膜也具 有抑制或降解作用。
【权利要求】
1.熊胆或熊胆粉在制备降解细菌生物膜的产品中的应用。
2.熊胆或熊胆粉在制备破坏细菌生物膜的产品中的应用。
3.熊胆或熊胆粉在制备抑制细菌生物膜形成的产品中的应用。
4.如权利要求1至3中任一所述的应用，其特征在于:所述细菌为金黄色葡萄球菌。
5.一种降解细菌生物膜的产品，其活性成分为熊胆或熊胆粉。
6.一种破坏细菌生物膜的产品，其活性成分为熊胆或熊胆粉。
7.一种抑制细菌生物膜形成的产品，其活性成分为熊胆或熊胆粉。
8.如权利要求5至7中任一·所述的产品，其特征在于:所述细菌为金黄色葡萄球菌。
【文档编号】A61P31/04GK103705541SQ201410005140
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】王毅, 刘冲, 刘绍勇, 刘宜善, 王国明, 王艺竹, 于友华, 李连达 申请人:上海凯宝药业股份有限公司