Hpv18的重组腺相关病毒疫苗及其制备方法
【专利摘要】HPV18的重组腺相关病毒疫苗及其制备方法属于生物医药【技术领域】。本发明提供一种优化型的编码HPV18型(HPV18)主要衣壳蛋白L1的基因序列，以及含有其的2/1型重组腺相关病毒疫苗并提供了制备上述重组腺相关病毒的方法。本发明提供的重组HPV18L1的2/1型重组腺相关病毒疫苗可用于制备治疗和预防食管癌及宫颈癌的药物。
【专利说明】HPV18的重组腺相关病毒疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】。本发明涉及一种含密码子优化型HPV18L1基因的 2/1型重组腺相关病毒疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒（Human papillomavirus, HPV)是一种在自然界广泛存在的嗜上皮 性病毒，属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属的无包膜闭环双链DNA病毒。20世纪70年代， Zur Hausen提出HPV是宫颈癌的病毒学成因，之后国内外学者就两者之间的关系进行了大 量研究并提出90%以上的宫颈癌是由于HPV感染引起，国际癌症研究协会（IARC)发表的研 究显示超过2/3的子宫颈癌病例与HPV16型（51% )或HPV18型（16.2% )感染有关。
[0003] 1982年syr jane的研究表明HPV和食管鳞癌之间存在相关性，之后的不少 研究也证实了这一观点（Shen ZY，Xu LY，Li EM，et al. The multistage process ofcarcinogenesis in human esophageal epithelial cells induced byhuman papillomavirus. Oncol Rep，2004,11 :647-54.)其中曲鹏，李劲涛的研究也表明HPV感染 可能是食管鳞癌的病毒学诱因，结果显示标本HPV感染率为82. 6 %，其中HPV16型感染率 34. 8%，HPV18型感染率34. 8。（安阳地区不同食管鳞癌标本HPV感染率的比较研究，曲鹏， 李劲涛)。
[0004] 全球范围内子宫颈癌是第二大常见的妇科恶性肿瘤，每年约有50万新增子宫颈 癌病例，28万的死亡病例，我国每年新增宫颈癌病例约13. 5万，占全球发病数量的1 / 3， 约8万人死亡。
[0005] 食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死 亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。男多于 女，发病年龄多在40岁以上。
[0006] 根据HPV与良性和恶性肿瘤的相关度，将HPV病毒分为低危型和高危型两种。其 中低危型包括册￥6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81等，高危型包括册￥16、18、31、33、 35、 39、45、51、52、56、58、59等。HPV基因组L区的L1作为HPV的主要衣壳蛋白能够单独或 与次要衣壳蛋白L2共同在体外自行组装成VLPs。已经上市并广为接种的两种针对HPV预 防性疫苗，]^1^^公司的册￥6、11、16、18四价￥1^631(^8丨1疫苗和651(公司研制的册￥16、 18双价VLP Cervarix疫苗，都是由HPV L1蛋白组装成的VLPs。其作用机理是以VLP三作 为靶抗原诱导机体产生特异性中和抗体达到预防相应型别HPV的感染。
[0007] AAV属细小病毒科，为一缺陷病毒，是正链或负链单链DNA病毒，外包二十面体衣 壳蛋白，病毒颗粒的直径在20?26nm之间。AAV的复制依赖于辅助病毒（helper virus)， 如腺病毒或疱疹病毒。野生型AAV2(wtAAV2)基因组为线性单链DNA，大小约4. 7kb。两末端 各含一个倒置末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR)，中间含有rep和cap基因。 Xiao等（1998)将腺病毒上起辅助功能的基因全部构建到一个新的质粒上，由质粒代替腺 病毒向rAAV2提供辅助功能，从而构建了重组II型AAV载体（rAAV2)，它具有长时程有效表 达外源基因、无致病性、免疫原性弱和基因定点整合等多项优点。重组2/1型AAV (rAAV2/l) 是近年来出现的新型载体，采用AAV2的ITR，而仅将AAV2的外壳蛋白基因置换成AAV1的 外壳蛋白基因，它在保持II型AAV载体高效表达外源基因、高安全性等优点的同时提供了 更好的肌纤维细胞嗜性，是目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一。
[0008] HPV18L1基因相对E6，E7癌基因而言更安全，且L1编码的蛋白能诱导产生较高的 体液免疫和细胞免疫效果，而2/1型重组腺相关病毒（rAAV2/l)也具有长时程有效表达外 源基因、无致病性等有点，因此可以开发制备防治食管癌和宫颈癌的基于HPV18L1的重组 腺相关病毒疫苗。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种密码子优化型的编码HPV18主要衣壳蛋白L1的基因序列以及 一种含有上述优化型基因的2/1型重组腺相关病毒（rAAV2/l)。
[0010] 一种制备所述2/1型重组腺相关病毒（rAAV2/l)的方法，其特征在于，包括如下步 骤：
[0011] (1)将SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列克隆到重组腺相关病毒穿梭质粒中，得到重 组腺相关病毒穿梭质粒；
[0012] (2)用步骤（1)制备的重组腺相关穿梭质粒和pHelper质粒、P5E18RXC1质粒共转 染腺相关病毒包装细胞，得到含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的2/1型重组腺相关病 毒（rAAV2/l)。
[0013] 进一步，所述重组腺相关病毒穿梭质粒是质粒pAAV-MCS。
[0014] 进一步，所述重组腺相关病毒包装细胞是293ft细胞。
[0015] 进一步，三质粒采用quickshuttle转染试剂按照摩尔比1:1:1的比值进行三质粒 共转染。
[0016] 进一步，所述疫苗的成分为所述的2/1型重组腺相关病毒。
[0017] 进一步包括，所述基因在制备用于防治HPV引起的子宫颈癌的药物或疫苗组合物 中的用途。
[0018] 进一步包括，所述基因在制备用于防治HPV引起的食管癌的药物或疫苗组合物中 的用途。
[0019] 进一步包括，所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗宫颈癌药物 或疫苗组合物中的用途。
[0020] 进一步包括，所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗食管癌方面 的药物或疫苗组合物中的用途。
[0021] 本发明更进一步提供一种HPV18的2/1型重组腺相关病毒疫苗，其有效成分为上 述2/1型重组腺相关病毒。
[0022] 本发明提供的HPV18的2/1型重组腺相关病毒可用于制备治疗和预防子宫颈癌和 食管癌的药物。
[0023] 本发明实现的技术效果如下：
[0024] 本发明提供的HPV18的2/1型重组腺相关病毒，用于制备HPV18的2/1型重组腺 相关病毒疫苗，产生中和抗体的滴度明显提高，细胞免疫效果也显著加强。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图 1. AAV-MCS-HPV18L1 重组质粒 Hindlll，Eorl I 双酶切电泳
[0026] 1. DNAmarker 12000
[0027] 2. MCS-HPV8L1 质粒 1
[0028] 3. MCS-HPVSL1 质粒 2
[0029] 4. MCS-HPVSL1 质粒 3
[0030] 5. MCS-HPVSL1 质粒 4
[0031] 6. MCS-HPV8L1 质粒 5
[0032] 图2.腺相关病毒颗粒的电镜图
[0033] 图3. rAAV2/l-HPV18Ll疫苗诱导的体液免疫
[0034] 图4. rAAV2/l-HPV18Ll疫苗在Balb/c小鼠中诱导的细胞免疫
【具体实施方式】
[0035] 材料和方法
[0036] 大肠杆菌DH5a购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA A-Tailing Kit、 PMD18-T载体购自宝生物工程(大连）有限公司。HEK293ft细胞由北京工业大学生命学院 病毒药理室王小利老师提供。含密码子优化型HPV18L1基因的质粒pMK-RQ由周玉柏老师 提供。限制性内切酶Bgl II和Sal I购自NewEngland Biology公司，T4DNA连接酶、DNA Marker购自宝生物工程(大连）有限公司。普通DNA纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、 pfuDNA聚合酶、dNTP均购自天根生化科技（北京）有限公司。质粒提取试剂盒（Midi)、去 内毒素质粒提取试剂盒（Maxi、Mega)购自QIAGEN公司。预染蛋白Marker购自Fermentas 公司。脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。DMEM培养基、OptiMEMI 培养基、胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS)、青链霉素双抗购自Gibco公司。小鼠抗 HPV18L1单抗购自Abeam公司，小鼠抗β-actin单抗购自北京中杉金桥生物技术公司。羊 抗小鼠 IgG抗体（Anti-MOUSE IgG(H&L) (GOAT)Antibody IRDye700DX)购自 Rockland公司。 其它分析纯试剂由本实验室提供。脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公 司。QuickShuttle转染试剂购自北京康碧泉生物科技有限公司。DMEM培养基、RPMI-1640 培养基、Quick Spot小鼠 IFN-YELISP0T预包被试剂盒、EZ-S^)? MouselX易得小鼠淋巴 细胞分离液购自深圳达科为生物技术有限公司。其它分析纯试剂由本实验室提供。实验中 设计的多肽由北京中科亚光生物科技有限公司合成。实验所需引物由上海英骏生物技术有 限公司合成，序列如下：
[0037] MCSF :5-ATAAGAATTCATGGCTCTGTGGCGGCCCAG-3'
[0038] MCSR :5-ATATAAGCTTTCACTTGCGGGCTCTCACGC-3'
[0039] 本发明所涉及的分子生物学和免疫学等相关技术如核酸操作技术，蛋白质定性和 定量分析等在科学文献中都已有充分描述(如参见J ·萨姆布鲁克E · F ·弗里奇T ·曼尼要 蒂斯，分子克隆实验指南(第二版)）。
[0040] 实施例1重组pAAV-HPV18Ll质粒的构建
[0041] 1. 1PCR扩增HPV18L1基因片段以含密码子优化的HPV18L1基因的pMK-RQ为模板， MCSF为上游引物，MCSR为下游引物PCR扩增HPV18L1基因片段。PCR完成后取lyL反应 溶液进行DNA凝胶（1%)电泳检测。检测得到较好结果后回收PCR产物。
[0042] 1. 2小提并双酶切重组载体和HPV18L1质粒挑取冻存的pAAV-MCS菌，接种到 4mLAmp抗性的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜。按小提试剂盒说明书步骤小提质粒， 然后使用限制性内切酶Ecorll和Hindlll对pAAV-MCS质粒和HPV18L1基因片段进行双酶 切。用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。取1UL回收的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳 检测回收效果。
[0043] 1. 3HPV18L1片段和pAAV-MCS质粒的连接转化
[0044] 连接体系为：适量的1.2中酶切回收的HPV18L1片段和pVR质粒，10XT4Ligase buffer2. 5yL，T4连接酶lyL，补水至20yL。16°C连接过夜。将全部的连接产物（20yL) 加入至50 μ L DH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟。42°C加热90秒后，再在冰中放置 2?3分钟。然后加入400 μ L LB培养基，37°C振荡培养45分钟。取100 μ L已转化的感受 态细胞，用弯头玻棒轻轻涂到含有Kana的LB琼脂平板培养基上。平板上液体被吸收后置 于37°C恒温箱培养12?16h。
[0045] 1. 4小提并鉴定重组质粒挑取平板上的单菌落接种到4mL氨苄抗性的LB培养 基中，37°C剧烈振荡培养过夜。按小提试剂盒说明书步骤小提质粒，然后使用限制性内切 酶Ecorll和Hindlll对提取的质粒进行酶切鉴定，结果如图1所示，在相应的条带上有 pAAV-MCS和HPV18L1片段。初步鉴定正确后送北京华大基因测序。测序结果正确的重组质 粒命名为 PAAV-HPV18L1。
[0046] 实验例2 :重组腺相关病毒rAAV2/l-HPV18Ll的制备，纯化，病毒滴度分析和电镜 观察
[0047] (1)重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-HPV18Ll和辅助质粒的制备
[0048] 使用QIAGEN Plasmid Giga Kits质粒大量提取试剂盒分别提取重组腺相关病毒 辅助质粒pHelper、P5E18RXC1及重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-HPV18Ll。具体实验操作 步骤见 QIAGEN Plasmid Giga Kits 使用手册。
[0049] (2)重组腺相关病毒的包装
[0050] 转染传代293细胞于70个75cm2培养瓶中，根据Quickshuttle试剂盒操作 说明进行转染：48^ pHelperUeyg P5E18RXC1及重组腺相关病毒穿梭质粒16yg PAAV-HPV18L1的量混匀质粒加到500μ 1的Nacl生理盐水中。取160μ 1的转染试剂加到 500 μ 1的Nacl生理盐水中。二者混匀之后加入到含有15ml细胞培养基的每瓶细胞中立传 立转，交叉混匀（DNA和转染试剂1 :2的比例)，置37°C 5%C02继续培养。按此比例转染效果 较好，包装出的腺相关病毒较多。转染后72小时，用细胞刮将细胞刮下，800rpm离心5min， 弃上清，用2ml无菌PBS重悬细胞沉淀；-80°C和37°C反复冻融3次，3000rpm取上清，即为 重组腺相关病毒粗制品，命名为rAAV2/l-HPV18Ll，-80°C保存备用。
[0051] (3)重组腺相关病毒的纯化
[0052] 使用 Biomiga Vira TrapTM AAV2Purification Maxiprep Kit 腺相关病毒纯化试 剂盒对重组腺病毒进行纯化。准备腺相关病毒感染的细胞裂解液（6-8XT75培养瓶/每 根柱）1.对于转染的细胞贴壁，用移液管吸去培养基，使用细胞刮收集，每瓶细胞用3-5毫 升PBS。将细胞收集到50mL离心管中。2.在350g，10分钟，沉淀细胞。细胞沉淀在-80°C 下保存，或者立即进行下面的步骤。3.离心管中加入lOmL (Binding Buffer)结合缓冲 液重悬细胞沉淀。确保在重悬后没有细胞团块。这对病毒颗粒的释放至关重要。4.重悬 后，加入100yL为100X核酸酶反应缓冲液（Nuclease Reaction Buffer)和15yL核 酸酶（Nuclease)在37°C温和震荡孵育30-60min。5.将离心管600g离心15min，收集含 rAAV2/l-HPV18Ll上清液后用0. 45μπι的滤膜过滤上清液。6.采用硅胶柱纯化的方法，平 衡硅胶柱，将硅胶柱放置在50mL的离心管中，在400Xg离心1分钟，使填料平整无气泡。 将分离柱平置，拧开底部，让液体流出。先用4ml ddH20然后8毫升结合缓冲液（（Binding Buffer))平衡柱。7.将上清液加入纯化柱中，使上清液逐渐穿过纯化柱。收集滤出液，并 重新加入该纯化柱中，使纯化柱中的病毒粒子能充分上样。洗掉纯化柱中的非特异性结合 并洗脱rAAV2/l-HPV18Ll。8.用10ml结合缓冲液洗柱，重复一次。上清液可以由自然流下 或以400g离心5分钟。9.用4-6ml洗脱缓冲洗脱rAAV2/l-HPV18Ll。收集洗脱液，lmL每 管。收集的洗脱液使用脱盐柱在5000rpm离心lOmin。纯化的病毒通过0. 22 μ m的滤膜过 滤。
[0053] (4)重组腺相关病毒滴度的测定
[0054] 使用 CELL BI0LABS，INC QuickTiter? AAV2Quantitation Kit 腺相关病毒滴度 测定试剂盒对重组腺相关病毒进行滴度测定。通过测定腺相关病毒中DNA分子含量的原 理，通过荧光染料发光值确定腺病毒含量。按照1:2比例建立标准样品曲线浓度从10微 克/晕升，5微克/晕升，2. 5微克/晕升，1. 25微克/晕升，0微克/晕升，每个稀释度 转移10 μ L至微孔板。加入90ul CyQuamiO GR染料到含有10 μ L标准样品的96孔板。 使用480/520nm波长设置荧光酶标仪读板，混合13. 5ul纯化rAAV2/l-HPV18Ll样品和 1.5ullQuickTiter试剂盒中的10XC液，75°C孵育1小时短暂离心收集管壁的液滴，室温 孵育20分钟。通过混合13. 5yL相同的纯化rAAV2/l-HPV18Ll和1.5ullOX C液准备未 加热的对照样品。将10 μ L未加热组和实验组样品的混合物到96孔板中，各孔分别加入 90 μ L的新鲜配制1 X CyQuant? GR染料，用荧光酶标仪480/520nm波段读板。根据标准 曲线及说明书中的公式 Titer(GC/mL)=Dilution FactorXAAV2-2DNA(ng) X (3.6X108GC/ ng) X (15μ L/13. 5μ L)]/0. OlOrnL 计算 rAAV2/l-HPV18Ll 滴度约为 8. 8X10nvg/ml
[0055] (5)重组腺相关病毒rAAV2/l-HPV18Ll电镜观察：
[0056] 取10ul纯化的rAAV2/l-HPV18Ll病毒悬液用2%磷钨酸复染3min，在透射电镜下 观察病毒样颗粒的形态。结果如图2所示，电镜下可见直径约20nm的病毒颗粒的存在。
[0057] 实验例3 :重组腺相关病毒rAAV2/l_HPV18Ll免疫效果的初步研究
[0058] 3. 1免疫小鼠的准备及免疫计划
[0059] 从商业途径获得的20只4?6周龄的SPF级的健康雌BALB/cH-2Kd小鼠随机分 为2组，每组5只，在第一周大腿肌肉注射免疫，免疫后一周检测免疫反应。具体免疫内容 和剂量见表1。
[0060] 表1小鼠免疫分组和剂量
[0061]
【权利要求】
1. HPV18的2/1型重组腺相关病毒，其特征在于，所述病毒含有SEQ ID NO: 1所示的核 苷酸序列。
2. -种制备权利要求1所述2/1型重组腺相关病毒的方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 将SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列克隆到重组腺相关病毒穿梭质粒中，得到重组腺 相关病毒穿梭质粒； (2) 用步骤（1)制备的重组腺相关穿梭质粒和pHelper质粒、P5E18RXC1质粒共转染腺 相关病毒包装细胞，得到含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的2/1型重组腺相关病毒。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒穿梭质粒是质粒 pAAV-MCS〇
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒包装细胞是293ft细 胞。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，三质粒采用quickshuttle转染试剂按照 摩尔比1:1:1的比值进行三质粒共转染。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疫苗的成分为权利要求1所述的2/1 型重组腺相关病毒。
7. 根据权利要求1所述基因在制备用于防治HPV引起的子宫颈癌的药物或疫苗组合物 中的用途。
8. 根据权利要求1所述基因在制备用于防治HPV引起的食管癌的药物或疫苗组合物中 的用途。
9. 根据权利要求2所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗宫颈癌药物 或疫苗组合物中的用途。
10. 根据权利要求2所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗食管癌方 面的药物或疫苗组合物中的用途。
【文档编号】A61P35/00GK104140980SQ201410035933
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年1月25日 优先权日:2014年1月25日
【发明者】周玉柏, 曾毅, 刘海庭, 方军, 沈思嗣, 李劲涛, 李泽琳 申请人:北京工业大学