一种干扰tlr4受体的小rna及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药【技术领域】。慢性疼痛是神经元可塑性变化的表现形式之一，其生理学特点是痛觉的反应性增高，治疗困难且机制不明，治疗上多用阿片类受体阻滞剂，存在较多副作用。本发明提供了一种干扰TLR4受体的小RNA，其序列如SEQ?ID?NO:5所示。本发明还提供了该小RNA在治疗慢性疼痛药物中的应用。本发明的小RNA可采用直接注射的方式，或采用载体表达的方式，可在体内外抑制TLR4的表达，达到治疗慢性疼痛的效果，且给药途径方便，并且不存在成瘾、耐受等反应，可长期使用。
【专利说明】—种干扰TLR4受体的小RNA及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种抑制TLR4受体的小RNA及其在制备治疗慢性疼痛药物的应用。
【背景技术】
[0002]慢性疼痛是神经元可塑性变化的表现形式之一，其生理学特点是痛觉的反应性增高，主要表现为痛觉过敏(hyperalgesia)和超敏反应(allodynia)。此类疼痛治疗困难,主要是由于其机制不明。目前在治疗上，主要是以吗啡为代表的阿片类受体阻滞剂，但存在众多的副作用以及成瘾、耐受等反应，从而限制了其长期使用。因此，亟需一种治疗效果良好、作用时间长、副作用轻的新方法，达到长期、有效控制慢性疼痛的目的。
[0003]Toll样受体4(Toll like rec印tor4，TLR4)是Toll家族之一，是细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)胞内信号转导的重要通路，是LPS祀细胞膜上的跨膜受体和自然免疫系统主要的病原模式识别受体。TLR4具有细胞外亮氨酸重复区域和细胞内信号区域，胞外信号通过⑶14激活TLR4，而活化的TLR4胞内与接头蛋白MyD88的TLR4受体域结合，通过MyD88死域(death domain)再与IL-1受体相关激酶(IL-lreceptorassociated kinase, IRAK)结合，导致IRAK的自身磷酸化，从而激活肿瘤坏死因子受体相关因子 _6 (TNF-a receptor associated factor6, TRAF-6),而后通过激活 IKK 使
Iκ B家族α、β激酶活化,导致I K B家族的广泛磷酸化而降解，使NF- κ B转位到胞核，其活性二聚体启动细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等)和辅助刺激分子⑶80和⑶86基因的转录、翻译，最终导致炎症因子释放(参见文献:Takeuchi O and S akira.Toll-like receptors:their physiological role and signal transduction system.1ntImmunopharmacoI,2001，I(`4):625_635)。
[0004]TLR4受体在疼痛的发生、发展和维持中发挥重要作用。在L5神经损伤模型雄性大鼠模型中发现脊髓胶质细胞TLR4的高表达与神经损伤后痛觉超敏密切相关。L5神经切断后TLR4-knoCkout及TLR4基因突变小鼠热痛阈、机械痛阈明显高于野生小鼠；对雄性L5神经切断大鼠鞘内注射TLR4抑制性寡核苷酸(ODN)可降低脊髓胶质细胞激活相关标志及促炎因子的表达，明显减轻大鼠对痛觉的敏感性，在小鼠及大鼠模型证实TLR4在胶质细胞激活中的作用，为临床神经病理性疼痛的诊治提供了新靶点(参见文献=Tanga FY, NutileMcMenemy N,DeLeo JA.The CNS role of Toll-like receptor4in innate neuroimmunityand painful neuropathy.Proc Natl Acad Sci USA,2005，102(16):5856-5861)。
[0005]RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因沉默的现象，是生物体内抑制特定基因表达的一种现象。外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA将被RNase III家族中的一个能够特异性识别双链RNA的酶Dicer，以ATP依赖的方式逐步切割为19~23nt的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNA)。siRNA双链在RISC作用下双链解开，同源的靶目标RNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目标mRNA切断，从而阻断了基因表达。RNA干扰是目前最有效的基因“沉默”技术，从理论上讲，在疼痛通路中兴奋性增高的基因都可能成为RNA干扰靶位，从而降低其兴奋性，达到治疗目的。但是，干扰效率高，特异性强的小RNA的获得较难，不同序列的差异即可导致有效性的丧失，从而影响其药理学的价值，我们采用大鼠模型发现干扰大鼠TLR4受体的小RNA具有治疗疼痛的作用。(参见文献:吴飞翔，缪雪蓉，徐学武，孙玉明，俞卫锋.鞘内注射针对Toll样受体4基因的siRNA缓解坐骨神经结扎大鼠的神经病理性疼痛.第二军医大学学报.2011,32 (4):377-381)。但是，用于人体的治疗仍需要有效的干扰人源性TLR4受体的小RNA。
[0006]目前尚无有关干扰人源性TLR4受体的小RNA及其用于治疗慢性疼痛的文献报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种干扰TLR4受体的小RNA，本发明的另一目的在于提供该小RNA在制备治疗慢性疼痛药物中的应用。
[0008]本发明人前期鞘内注射TLR4_siRNA可明显降低神经损伤所导致的神经病理性疼痛大鼠的痛敏，说明TLR4是一个有效的治疗慢性疼痛的靶目标，同时也说明RNA干扰技术用于治疗慢性疼痛的可行性。(用的siRNA序列为大鼠的序列:5’-GUCUCAGAUAUCUAGAUCU-3，参见文献:吴飞翔，缪雪蓉，徐学武，孙玉明，俞卫锋.鞘内注射针对Toll样受体4基因的siRNA缓解坐骨神经结扎大鼠的神经病理性疼痛.第二军医大学学报.2011,32 (4):377-381;及 Wu FX, Bian JJ1Miao XR, Huang SD, Xu Xff, Gong DJ, Sun YM, Lu ZJ, YuWF.1ntrathecal siRNA against Toll-like receptor4reduces nociception in a ratmodel of neuropathic pain.1nt J Med Sci，2010，7 (5):251-259.)。
[0009]因此，本发明人进一步对干扰人的TLR4的小RNA进行筛选，获得一种高效干扰TLR4的小RNA，可对干扰TLR4mRNA进行降解，从而抑制干扰TLR4蛋白的表达，该小RNA可成为治疗慢性疼痛的一种新的药物。
[0010]本发明的具体技术方案如下:
[0011]TLR4序列(G1:2459627)由Gene bank获得，将其序列中的开放读框部分输入http://1.cs.hku.hk/ ~sirna/software/sirna.php 网站所提供的 RNAi 设计软件进行在线筛选，而后选择GC比在40% - 60%之间的，逐个做Blast分析和SNP分析，选中位于开放读框内的3个不同的序列，如下:
[0012]I.GCATGGAGCTGAATTTCTA (SEQ ID NO:1)
[0013]I1.GGATTTATCCAGGTGTGAA (SEQ ID NO:2)
[0014]III.CCTGAACCCTATGAACTTT (SEQ ID NO:3)
[0015]其对应的RNA序列为:
[0016]1.GCAUGGAGCUGAAUUUCUA (SEQ ID NO:4)
[0017]II.GGAUUUAUCCAGGUGUGAA (SEQ ID NO:5)
[0018]II1.CCUGAACCCUAUGAACUUU (SEQ ID NO:6)
[0019]本发明将构建含人TLR4基因的pEGFPCl报告质粒，用脂质体方法将上述序列对应的RNA和pEGFPCl-TLR4共转染293细胞，进行RNA干扰效率的检测，进而筛选出RNA干扰效率最高的序列为:GGAUUUAUCCAGGUGUGAA (SEQ ID NO:5)。
[0020]本发明的第一方面， 提供了一种干扰TLR4受体的小RNA，其序列如SEQID NO: 5所/Jn ο
[0021]本发明通过含TLR4基因的pEGFPCl报告质粒对进行RNA干扰效率进行检测，得到干扰效率最高小RNA ;又通过小RNA作用于人的神经小胶质细胞，发现小RNA具有良好的抑制内毒素诱导的TLR4的上调。本发明的小RNA的作用机理:TLR4在慢性疼痛的发生、发展和维持中发挥重要作用，在慢性疼痛中表达大量增加，可易化诱导炎症因子的释放，引起级联反应，造成痛觉的恶性循环，引起疼痛过敏。因此下调TLR4受体表达具有抑制慢性疼痛的作用。RNA干扰技术可降解mRNA从而抑制蛋白的表达，那么，采用该技术抑制TLR4的表达就可达到治疗疼痛的目的。
[0022]本发明的第二方面，提供了上述干扰TLR4受体的小RNA在制备治疗慢性疼痛药物中的应用。
[0023]所述的干扰TLR4受体的小RNA在制备治疗慢性疼痛药物中的应用，所述的药物可以为注射剂。
[0024]本发明所述的慢性疼痛，它是指的没有生物学价值的、超过正常的组织损伤愈合时间(通常>3月)的疼痛，包括炎症性疼痛，神经病理性疼痛和癌痛。
[0025]本发明小RNA在制备治疗慢性疼痛药物中的应用，可采用小RNA直接注射，或将包含该小RNA的重组载体经蛛网膜下腔直接注射，如慢病毒、腺病毒或质粒等，可达到治疗慢性疼痛的目的，且给药途径方便，效果良好。
[0026]同时，由于本发明不是传统的阿片类受体阻滞剂，不存在成瘾、耐受等反应，可长期使用。本发明为治疗慢性疼痛提供了新的治疗手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是流式细胞术显示报告载体pEGFG-TLR4中绿色荧光的表达；
[0028]图2是实时定量PCR检测人的神经小胶质细胞NMDA受体mRNA的表达；
[0029]图3是western blotting检测人的神经小胶质细胞NMDA受体蛋白的表达；
[0030]图中siRNA 组指 siRNA-TLR4 II ;MM 组指错配的 RNA 组(Mismathch RNA) ；NS 组指生理盐水组；Control组指空白组。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0032]实施例1:干扰TLR4的小RNA序列的筛选过程
[0033]一、含人TLR4受体基因的pEGFPCl报告质粒的构建及鉴定
[0034]据人TLR4受体序列，设计引物:
[0035]上游引物:5，-CGGAGCGTTTCAGACTCCGGAGCCTCAGCTGTT-3，(SEQID NO:7);
[0036]下游引物:5，-CGCGTCTTGCCCAGCTGGGTCCAATAAATT-3’(SEQ ID N0:8)。
[0037]引物两端分别含Sac I和Sal I酶切位点。采用RT — PCR，获取含有干扰靶序列的人TLR4序列表达框内的部分序列。
[0038]将此片段与pEGFPCl质粒(购自美国Invitrogen公司)分别用Sac I和Sal I酶切，而后用T4DNA连接酶16°C过夜连接成pEGFPCl-hNMDA。RKE.col1.DH5 α感受态细胞，挑克隆抽提质粒DNA，进行PCR扩增出正确的条带后进一步测序鉴定。[0039]1、PCR鉴定体系:
【权利要求】
1.一种干扰TLR4受体的小RNA，其序列如SEQ ID NO:5所示。
2.一种如权利要求1所述的干扰TLR4受体的小RNA在制备治疗慢性疼痛药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的干扰TLR4受体的小RNA在制备治疗慢性疼痛药物中的应用，其特征在于，所述的药物为注射剂。
4.根据权利要求2所述的干扰TLR4受体的小RNA在制备治疗慢性疼痛药物中的应用，其特征在于，所述的药物为主要活性成份为如SEQ ID NO:5所示的小RNA的注射剂。
5.根据权利要求2所述的干扰TLR4受体的小RNA在制备治疗慢性疼痛药物中的应用，其特征在于，所述的药物为包含如SEQ ID NO:5所示的小RNA的重组载体制成的注射剂。
6.根据权利要求5所述的干扰TLR4受体的小RNA在制备治疗慢性疼痛药物中的应用，其特征在于，所述的重组载体为慢病毒载体、腺病毒载体或质粒。
【文档编号】A61P25/04GK103757024SQ201410043633
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2014年1月29日
【发明者】吴飞翔, 俞卫锋, 张金旻 申请人:中国人民解放军第二军医大学