臭灵丹提取物及组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明是一种臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用。该臭灵丹提取物对呼吸道甲型病毒性流感病毒有较强的抑制作用。该臭灵丹提取物活性成分用乙醇、甲醇或脂溶性溶剂提取或再萃取、沉淀、层析获得。本发明所述的臭灵丹提取物通过细胞病变、血凝效价、RealTimeRT-PCR等一系列实验，对臭灵丹提取物的样品进行甲型流感病毒的体外中和作用和增殖抑制作用检测，臭灵丹提取物及其活性成份具有抗甲型流感病毒活性，具有开发成单方、复方抗甲型流感病毒药物的前景。
【专利说明】臭灵丹提取物及组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体地说是臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用。
【背景技术】
[0002]臭灵丹(Laggera Pterodonta (DC.) Benth)为菊科六棱菊属药用植物，别名狮子草、臭叶子、六棱菊等，分布于云南、四川、西藏等地，主产于我国云南省，药源丰富。《云南中草药》、《昆明民间常用草药》及《滇南本草》等大量收载了云南民间使用臭灵丹的经验，该药具有良好的抗菌消炎、清热解毒的作用，被广泛用于治疗感冒、咽喉炎、支气管炎、疟疾等病症。目前已经从该属植物中鉴定的化合物主要为桉烷型倍半萜及黄酮醇类化合物。
[0003]从植物中发现天然抗病毒药物，是开发抗病毒药物的重要途径。臭灵丹药材资源十分丰富，现已开发成为抗细菌类的咽喉肿痛、肺热咳嗽类药物，但对病毒作用尚无系统基础研究和应用研究。目前未见臭灵丹提取物用于抗甲型病毒性流感的文献报导。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型流感病毒中的应用，以及所述臭灵丹提取物的提取方法。
[0005]本发明对臭灵丹进 行药物活性成分的富集和提取分离，并且进行呼吸道合胞病毒及甲型流感病毒株的体外培养，研究臭灵丹活性成分的体内外抗病毒作用，发扬和利用我国中药的优势和特色，对有效成分的深入药理机理研究，进一步寻找具有生物活性的化合物，研制出疗效确切、副作用小、经济有效和能广泛应用于临床的抗甲型病毒性流感的臭灵丹提取物的应用。
[0006]本发明的臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型流感病毒中的应用是将臭灵丹提取物及其组合物制备成抗甲型病毒性流感的药物。
[0007]所述的臭灵丹提取物活性成分含以下化合物:3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸、3，5- 二 -O-咖啡酰奎宁酸、4，5- 二 -O-咖啡酰奎宁酸、4’，5- 二羟基_6，7- 二甲氧基黄酮、5，6- 二羟基-3，4’，7-三甲氧基黄酮、4’，5- 二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮、5-羟基_3，3’，4’，6，7-五甲氧基黄酮、4’，5-二羟基-3，3’，6，7-四甲氧基黄酮、3’，5-二羟基_3，4’，6，7-四甲氧基黄酮。
[0008]所述的臭灵丹提取物组合物为:臭灵丹提取物可配以贯众、金银花、药用赋形剂组合成药物组合物。各组份的重量份为:臭灵丹提取物70~80、贯众10~15、金银花10~15，必要的药用赋形剂(其用量可按现有技术)。
[0009]所述药物为:片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、散剂、丸剂、合剂、颗粒剂、冲剂、滴丸剂、膏剂、口服液，或控释、缓释、纳米制剂。
[0010]所述的臭灵丹提取物的提取方法:用臭灵丹药材，加入臭灵丹药材10倍重量乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种，用冷浸或渗滤、回流加热、超声提取回收溶剂得到初提物；该初提物按以下方法处理:加初提物2~3倍重量的水，放置2~3小时，滤去不溶物叶绿素、树脂状物，水液减压浓缩，加入浓缩物2~3倍量的无水乙醇，放置4~5小时，滤除醇不溶物；醇溶液再次重复去除水不溶物，或直接回收溶剂至干得臭灵丹提取物；或者初提物上大孔树脂柱或活性炭柱,水洗,除去水溶性杂质,再用20%-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物；或者初提物溶液通过聚酰胺柱或葡聚糖凝胶柱，依次用水、95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物。
[0011]本发明所述的臭灵丹提取物通过细胞病变、血凝效价、Real Time RT-PCR等一系列实验，对臭灵丹提取物的样品进行甲型流感病毒的体外中和作用和增殖抑制作用检测，臭灵丹提取物其活性成份具有抗甲型流感病毒活性，具有开发成单方、复方抗甲型流感病毒药物的前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是3，4- 二 -O-咖啡酰奎宁酸结构图。
[0013]图2是3，5- 二 -O-咖啡酰奎宁酸结构图。
[0014]图3是4，5- 二 -O-咖啡酰奎宁酸结构图。
[0015]图4是4’，5_ 二羟基-6，7-二甲氧基黄酮结构图。
[0016]图5是5，6_二羟基_3，4’，7_三甲氧基黄酮结构图。
[0017]图6是4’，5-二羟基- 3，6，7-三甲氧基黄酮结构图。
[0018]图7是5-羟基-3，3’，4’，6，7_五甲氧基黄酮结构图。
[0019]图8是4’，5-二羟基-3，3’，6，7_四甲氧基黄酮结构图。
[0020]图9是3’，5_ 二羟基-3，4’，6，7_四甲氧基黄酮结构图。
[0021]图10是臭灵丹提取物HPLC色谱图，所用色谱条件如下:色谱柱:岛津VP-ODS 150L X 4.6，流动相:甲醇-0.1%甲酸梯度洗脱(时间O — 40 — 50min ；甲醇30% — 70% — 100% ；0.1% 甲酸 70% — 30% — 0%)，波长:254nm，流速:lml/min，柱温:30°C。
[0022]图11是流感病毒感染后病变的MDCK细胞图，a正常MDCK细胞，b病变MDCK细胞。
[0023]图12是实验样品血凝效价实验照片。
[0024]图13是实验样品RT-PCR实验照片)。
[0025]图14是72N组的扩增曲线。
[0026]图15是72N组的溶解曲线I。
[0027]图16是72N组的溶解曲线2。
[0028]图17是72M组的扩增曲线。
[0029]图18是72M组的溶解曲线I。
[0030]图19是72M组的溶解曲线2。
[0031]图20是96N组的扩增曲线。
[0032]图21是96N组的溶解曲线I。
[0033]图22是96N组的溶解曲线2。
[0034]图23是96M组的扩增曲线。
[0035]图24是96M组的溶解曲线I。[0036]图25是96M组的溶解曲线2。
[0037]图26是各组小鼠每日的体重变化(平均值)。
[0038]图27是臭灵丹药物体内抗病毒的鼠肺病理检查(200X)，A:正常对照；B:病毒对照组；C:利巴韦林；D:臭灵丹药物高剂量组(1600mg/kg.d) ；E:臭灵丹药物中剂量组(800mg/kg.d) ；F:臭灵丹药物低剂量组(400mg/kg.d)。
[0039]图1-9中:1为3，4- 二 _0_咖啡酰奎宁酸；2为3，5_ 二 _0_咖啡酰奎宁酸；3为4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸；4为4’，5-二羟基-6，7-二甲氧基黄酮；5为5，6-二羟基-3，4’，7-三甲氧基黄酮；6为4’，5-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮；7为5-羟基_3，3’，4’，6，7-五甲氧基黄酮；8为4’，5-二羟基-3，3’，6，7-四甲氧基黄酮；9为3’，5- 二羟基-3，4’，6，7-四甲氧基黄酮。
【具体实施方式】
[0040]实施例1:
臭灵丹提取物的提取方法:用臭灵丹药材，加入臭灵丹药材10倍重量乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种，用冷浸或渗滤、回流加热、超声提取得到初提物；该初提物按以下方法处理:加初提物2倍重量的水，放置2小时，滤去不溶物叶绿素、树脂状物，水液减压浓缩，加入浓缩物2倍量的无水乙醇，放置4小时，滤除醇不溶物；醇溶液再次重复去除水不溶物，或直接回收溶剂至干得臭灵丹提取物；或者初提物上大孔树脂柱或活性炭柱，水洗，除去水溶性杂质，再用20%-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物；或者初提物溶液通过聚酰胺柱或葡聚糖凝胶柱，依次用水、95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物。
[0041]所述的臭灵丹提取物活性成分含以下化合物:3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸、3，5- 二 -O-咖啡酰奎宁酸、4，5- 二 -O-咖啡酰奎宁酸、4’，5- 二羟基_6，7- 二甲氧基黄酮、5，6- 二羟基-3，4’，7-三甲氧基黄酮、4’，5- 二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮、5-羟基_3，3’，4’，6，7-五甲氧基黄酮、4’，5-二羟基-3，3’，6，7-四甲氧基黄酮、3’，5-二羟基_3，4’，6，7-四甲氧基黄酮。
[0042]以上化合物可以采用以下方法分离得到:
取上述方法得到的臭灵丹提取物用硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(10、:1)，得到广20的组份；第20组份用C18柱色谱分离，以甲醇-0.1%甲酸梯度洗脱，得到化合物1、2和3 ;第16组份用C18柱色谱分离，以甲醇-水梯度洗脱，得到化合物4、5、8、9 ；7组份用硅胶柱分离，以氯仿-甲醇(95:5)洗脱，得到化合物6 ；5组份用硅胶柱分离，以氯仿洗脱，得到化合物7。化合物4、5、9系首次从臭灵丹得到。
[0043]将上述臭灵丹提取物按现有技术的方法加药用赋形剂，制成片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、散剂、丸剂、合剂、颗粒剂、冲剂、滴丸剂、膏剂、口服液，或控释、缓释、纳米制剂。
[0044]实施例2:
臭灵丹提取物可配以贯众、金银花、药用赋形剂组合成药物组合物。各组份的重量份为(千克):臭灵丹提取物80、贯众10、金银花10，必要的药用赋形剂(其用量可按现有技术配制)。
[0045]实施例3:臭灵丹提取物药物组合物各组份的重量份为(千克):臭灵丹提取物70、贯众15、金银花15，必要的药用赋形剂(其用量可按现有技术配制)。
[0046]实施例4:
臭灵丹提取物药物组合物各组份的重量份为(千克):臭灵丹提取物75、贯众15、金银花10，必要的药用赋形剂(其用量可按现有技术配制)。
[0047]将上述臭灵丹提取物药物组合物加加入必要的药用赋形剂，制成片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、散剂、丸剂、合剂、颗粒剂、冲剂、滴丸剂、膏剂、口服液，或控释、缓释、纳米制剂。
[0048]以下是臭灵丹提取物对于抗甲型病毒性流感的试验研究。
[0049]取臭灵丹及其组合物的组方药物各400克、200克，乙醇提取后回收溶剂，残留液分别用一定量的石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(BU)萃取二次，回收溶剂得到臭灵丹提取物和残留水部分共8个部分。8部分药品标号如下:A，臭灵丹提取物正丁醇部分、B，臭灵丹提取物乙酸乙酯部分、C，臭灵丹提取物水部分、D，臭灵丹提取物石油醚部分、E，臭灵丹正丁醇部分、F，臭灵丹乙酸乙酯部分、G，臭灵丹水部分、H，臭灵丹石油醚部分。
[0050]刮取适量臭灵丹提取物样品加乙醇或水溶解成浓度为100ug/ul的母液。对照药品达菲溶解:取I粒达菲(75mg)，弃胶囊外壳，药品溶解于750uIMEM中(100ug/uI)。作如下实验研究。
[0051]—、病毒分离培养和滴度测定
1、MDCK细胞培养方法:DMEM培养基，37°C，5%C02培养箱内培养。胰酶消化传代。
[0052]2、病毒扩增条件:
A:配制病毒吸附液:空DMEM+TPCK胰酶(1%)，以此比例配所需用量。
[0053]B:将长至单层的MDCK细胞弃去培养液，PBS洗细胞面3次，加入病毒吸附液，置34土 1°C吸附1-1.5h，每20分钟摇晃I次，使病毒液均匀作用于细胞面(以T25细胞培养瓶为例每瓶加Iml病毒吸附液)。
[0054]C:配制维持液:在剩余病毒吸附液中补加1%BSA，加适当NaHC03调节PH，成为维持液。
[0055]D:向吸附好的培养瓶中补加9ml维持液，34土 1°C培养，3_4天会出现病变。反复冻融3次后，收取悬液于15ml离心管中，4000rpm离心lOmin，收集上清分装于1.5ml离心管中，_80°C保存。
[0056]病变程度判断标准如图11所示。
[0057]3、病毒滴度测定:
I):病毒梯度稀释:
取IOul病毒液入ep.管中,加培养基至lml,混匀后取IOOul入新ep.管中,加培养基900ul，即为10-3稀释度，混匀后从中再取IOOul至新印.管中，加培养基900ul，即为10-4稀释度，如此依次稀释至10-8。
[0058]2):将梯度稀释的病毒液加入96孔板，IOOul/孔。同时设空白细胞对照(NC)
3):病毒滴度计算-J2小时后取出96孔板，数病变孔数。
[0059]在10-广10-2梯度下8孔完全病变，10-3梯度下6孔病变，10-5梯度下无病变。
[0060]病毒的50%组织细胞感染量(TCID50)计算:TCID50=10_4.25/ml4、病毒血凝效价(HA)测定(微量法):
以现有A型流感病毒毒种测血凝效价。
[0061]抗凝剂配制:(酸性)柠檬酸葡萄糖溶液B (A⑶)
柠檬酸钠:1.32% (M/V)
柠檬酸:0.48% (M/V)
葡萄糖:1.47% (M/V) 鸡血球细胞制备:抗凝剂20ml+新鲜公鸡血20ml,混匀后1000rpm*10min离心，弃上清，加入20ml生理盐水,混匀后1000rpm*10min离心，弃上清，如此洗3遍,获得鸡血球细胞。
[0062]实验流程:1):在U形板中加生理盐水50ul/孔，加24孔。其中12孔为阴性对照。
[0063]2):加样品于第一孔50ul，换新枪头吹打混匀，取50ul于下一孔，依次对倍稀释至第12孔，弃去50ul。
[0064]3):鸡血按1%稀释，即Iml鸡血+99ml生理盐水，混匀。
[0065]4):取鸡血50ul/孔，加入上述样品及阴性对照孔中。
[0066]5):置室温45分钟~I小时，观察结果。
[0067]结果:病毒的血凝效价为1:1028
5、最适种毒条件探索:
以现有A型流感病毒毒种稀释各个梯度以摸索最适种毒条件。
[0068]种I块48孔板，上半部24孔保留病毒液直至产生病变，以模拟中和实验，下半部24孔种毒后24小时去掉病毒液，加培养基，以模拟抗增殖实验。以48孔板筛选流感病毒最适种毒浓度。
[0069]观察种毒后48小时观察病变结果、种毒后72小时观察病变结果、种毒后96小时观察病变结果。
[0070]实验结果表明:最适合用于中和实验和抗增殖实验的种毒稀释度为10-广10-3，拟定以10-2为种毒稀释度，最适结果观测时间为72小时。
[0071]二、对病毒具有中和杀伤作用和增殖抑制作用的臭灵丹提取物药物粗筛 1、药物对流感病毒中和杀伤作用:
病毒终稀释度为10-2，中药终浓度为5 ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml，同时作用
于细胞。
[0072]实验流程:1)将复苏后传1-2代的MDCK细胞种3块96孔板，长至单层。
[0073]2)病毒稀释:取A型流感病毒500ul溶于25ml维持液中，稀释度为2*10_2。
[0074]3)药物稀释:用维持液将药物稀释成10 ug/ml、40ug/ml、100ug/ml、200ug/ml四个浓度梯度。
[0075]4) MDCK细胞用PBS洗2遍，将80ul各浓度稀释的药液与80ul病毒液混合，接种长满单层细胞的96孔板，另设病毒对照C+V、细胞对照C和达菲对照DF。以上每孔设三个复孔。将板子于37°C，5%C02培养箱内培养，每天观察记录病变情况。
[0076]在中和实验中，病毒阳性对照在种毒后第48小时出现轻微病变，而加药孔均无，明显病变；在种毒后72小时，病毒阳性对照18孔有14孔完全病变，乙酸乙酯、石油醚部分、臭灵丹乙酸乙酯、石油醚部分有中和病毒作用。在种毒后96小时，乙酸乙酯部分、石油醚部分病毒阳性对照孔完全病变，药物有中和病毒作用。
[0077]2、药物对流感病毒增殖抑制作用:
病毒终稀释度为10-2，先加入细胞作用24小时后弃掉病毒液，加入中药。中药终浓度为 5 ug/ml 、20ug/ml、50ug/ml、100ug/mlo
[0078]实验流程:1)将复苏后传1-2代的MDCK细胞种3块96孔板，长至单层。
[0079]2)病毒稀释:取A型流感病毒400ul溶于39.6ml维持液中，稀释度为10_2。
[0080]3) MDCK细胞用PBS洗2遍，将病毒液接种长满单层细胞的96孔板，IOOul/孔，细胞对照孔和药品对照孔加培养基IOOul/孔，于37°C，5%C02培养箱内培养24小时。
[0081]4)药品稀释:用维持液将8个药品和达菲稀释成5 ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml四个浓度梯度:
5)培养24小时后将板子中溶液弃尽，加入各浓度稀释的药液，细胞对照C和病毒对照C+V加维持液。浓度同4，以上每孔设三个复孔。将板子于37°C，5%C02培养箱内培养，每天观察记录病变情况。
[0082]在增殖抑制实验中，病毒阳性对照在种毒后第48小时完全出现病变，而加药孔部分出现病变，组方药乙酸乙酯部分、臭灵丹乙酸乙酯、石油醚部分有抑制病毒增殖作用；在种毒后72小时，臭灵丹乙酸乙酯、石油醚部分有抑制病毒增殖作用，在种毒后96小时，所有药品均无抑制病毒增殖作用。
[0083]结果:乙酸乙酯部分、石油醚部分提取物具有抗流感、保护细胞的作用。在本实验中达菲无抗流感、保护细胞的·作用，阳性对照不成立。
[0084]三、粗筛的臭灵丹提取物对流感病毒中和杀伤作用和增殖抑制作用研究
1、中和实验和抗增殖实验
实验流程:1)将复苏后传1-2代的MDCK细胞种6块6孔板，长至单层。
[0085]2)病毒稀释:取A型流感病毒600ul溶于30ml维持液中，稀释度为2*10-2。从中取IOml病毒液加入IOml维持液对倍稀释，稀释度即为10_2。
[0086]3)药品稀释:用维持液将3个样品稀释成其最佳浓度(100ug/ml)。
[0087]4)中和试验:3板长满单层的MDCK细胞6孔板用PBS洗2遍，每孔加入1.5ml病毒液(稀释度为2*10-2)，每孔再加入各药品1.5ml ;病毒对照孔(V)加病毒1.5ml和维持液
1.5ml ;药品对照孔(O)加药品1.5ml和维持液1.5ml ;细胞对照孔(C)加维持液3ml。
[0088]5)增殖抑制试验:3板长满单层的MDCK细胞6孔板用PBS洗2遍，每孔加入2ml病毒液(稀释度为10-2)，药品对照孔和细胞对照孔加入2ml维持液。将板子于37°C，5%C02培养箱内培养24h，弃掉病毒液，加入各药品2ml ;药品对照孔(O)加药品2ml ;病毒对照孔(V)和细胞对照孔(C)加维持液2ml。
[0089]2、实验样品血凝效价(HA)测定(微量法)
血球吸附试验步骤见前述，测得的样品血凝效价结果见下表:
【权利要求】
1.一种臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用，将臭灵丹提取物及其组合物制备成抗甲型病毒性流感的药物。
2.根据权利要求1所述的臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感中的应用，其特征在于所述的臭灵丹提取物活性成分含以下化合物:3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸、3，5- 二 -O-咖啡酰奎宁酸、4，5- 二 -O-咖啡酰奎宁酸、4’，5- 二羟基-6，7- 二甲氧基黄酮、5，6- 二羟基-3，4’，7-三甲氧基黄酮、4’，5- 二羟基_3，6，7-三甲氧基黄酮、5-羟基_3，3’，4’，6，7-五甲氧基黄酮、4’，5-二羟基-3，3’，6，7-四甲氧基黄酮、3’，5-二羟基_3，4’，6，7-四甲氧基黄酮。
3.根据权利要求1所述的臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感中的应用，其特征在于所述的臭灵丹提取物组合物为:臭灵丹提取物70~80、贯众10~15、金银花10~15，必要的药用赋形剂组合成药物组合物。
4.根据权利要求1所述的臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感中的应用，其特征在于所 述药物为:片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、散剂、丸剂、合剂、颗粒剂、冲剂、滴丸剂、膏剂、口服液，或控释、缓释、纳米制剂。
5.如权利要求1所述的臭灵丹提取物的提取方法，其特征在于用臭灵丹药材，加入臭灵丹药材10倍重量乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种，用冷浸或渗滤、回流加热、超声提取回收溶剂后得到初提物；该初提物按以下方法处理:加初提物2~3倍重量的水，放置2~3小时，滤去不溶物叶绿素、树脂状物，水液减压浓缩，加入浓缩物2~3倍量的无水乙醇，放置4~5小时，滤除醇不溶物；醇溶液再次重复去除水不溶物，或直接回收溶剂至干得臭灵丹提取物；或者初提物上大孔树脂柱或活性炭柱，水洗，除去水溶性杂质，再用20%-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物；或者初提物溶液通过聚酰胺柱或葡聚糖凝胶柱，依次用水、95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物。
【文档编号】A61P31/16GK103735599SQ201410044424
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月30日 优先权日:2014年1月30日
【发明者】张荣平, 王新华, 夏晓玲, 孙强明, 杨子峰, 于浩飞, 潘锡平 申请人:昆明医科大学