异香豆素类新抗生素和田霉素（Hetiamacin）B、C、D 及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供三个异香豆素类新抗生素和田霉素（Hetiamacin）B、C、D及其制备方法以及和田霉素B、C、D及其组合物在制备抗生素药物中的应用。上述化合物左侧都具有所有Amicoumacin类化合物的骨架结构：甲基丁基氨基-3,4-二氢-8-羟基异香豆素；右侧侧链上10′-C、11′-C、12′-C、14′-C与13′-NH、15′-NH相连，形成一个六氢嘧啶环结构。上述化合物通过对枯草芽孢杆菌菌株的发酵并分离而得，对革兰氏阳性细菌如葡萄球菌属及其耐药菌等具有很高的抑制活性，有望成为抗革兰氏阳性菌药物及其先导化合物而具有良好的药用开发前景。
【专利说明】异香豆素类新抗生素和田霉素(Hetiamacin) B、C、D及其
制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一组天然来源的异香豆素类(isocoumarin)新抗生素及其制备方法，以及其在制备抗革兰氏阳性细菌及其耐药菌感染药物中的应用。
【背景技术】
[0002]以“ESKAPE”为代表的耐药菌日益猖獗，严重威胁着全球感染性疾病的治疗。自1961年在英国首次发现耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus, MRSA)以来，MRSA占临床上分得金黄色葡萄球菌的比例由20世纪80年代中期的1%~5%迅速迅速增加至目前的60%~70%，美国每年超过94000人感染MRSA，19000人死亡。据我国细菌耐药性监测网(CHINET)报告显示:2011年我国临床耐甲氧西林金葡菌MRSA分离率高达50%以上，部分MRSA对糖肽类抗生素低水平耐药，即万古霉素中介的金黄色葡萄球菌(VISA)，可见MRSA感染也是我国细菌耐药的突出问题。虽然万古霉素、利奈唑胺、达托霉素和替加环素等少数药物经美国FDA批准已用于临床治疗MRSA感染，但近年来临床上已发现上述药物的耐药菌株，尤其是1996年万古霉素不敏感金黄色葡萄球菌(VISA)及2002年第I株耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)的出现。MRSA已经成为严重威胁人类生命健康的“超级细菌”，与艾滋病、病毒性乙型肝炎并称为世界三大感染性疾病，成当今感染医学一个难题。因此研究开发针对MRSA的新的抗菌药物刻不容缓。
[0003]Amicoumacin是一类来源于微生物的异香豆素类化合物。该类化合物具有异香豆素(isocoumarin)类母核结构，自1975年发现第一个该类抗生素baciphelacin以来，已报道了 20多种来源于微生物的Amicoumacin类化合物，它们具有抗菌、抗肿瘤，抗痕，抗病毒，抗炎，溃疡保护，植物生长调节等广泛的生物活性，尤其是抗MRSA的活性极为突出。1975年武田制药株式会社Hisayoshi Okazaki等发现的第一个Amicoumacin类抗生素Baciphelacin对耐药(耐青霉素、链霉素和大环内酯类抗生素)金黄色葡萄球菌有很好的抑制；而后1981年日本明治制菓株式会社(Meiji Seika Kaisha, Ltd.) Jiro Itoh等从短小芽抱杆菌Bacillus pumilus BN-103中首次分离到Amicoumacin A,对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的 MIC 值均小于 I μ g/mL ；2007 年日本武蔵野大学(Musashino University)的 Makoto Hasimoto 等活性研究表明，Amicoumacin A耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC43300的抗菌活性与万古霉素相当，MIC值分别为4和2.5 μ g/mL ;另外，1992年日本山之内制药株式会社Tutomu Sato等从芽抱杆菌BaciIIus sp.Y-05460M-A中分离得到的Y-05460M-A,2012年香港科技大学Li Yongxin等分离到的Bacilosarcins B,以及1981年美国专利报道的Amicoumacin类抗生素Kristenin,都具有抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或者抗MRSA的强活性。
[0004]本发明人从一株植物叶片内生枯草芽孢杆菌的次级代谢产物中分离得到三个Amicoumacin类抗生素一和田霉素(Hetiamacin) B、C、D,经紫外光谱、红外光谱、高分辨质谱及核磁共振等波谱学数据的仔细分析，确定和田霉素(Hetiamacin) B、C、D为Amicoumacin类新抗生素，该结构与本发明人已经发表的Amicoumacin类抗生素Hetiamacin A(参见发明人的专利申请CN102977082A)相似，其侧链都有一个独特的六氢嘧唳环，但是与Hetiamacin A侧链的成环位点不同。对Hetiamacin B、C、D进行抗菌活性评价发现，三者对葡萄球菌属，包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)都有抑制活性，其中Hetiamacin B的抗菌活性最强，MIC值均在1_2 μ g/ml范围内。因此，Hetiamacin B、C、D有望成为抗革兰氏阳性细菌如葡萄球菌属及其耐药菌(MRSA)感染的药物及先导化合物并具有潜在的良好开发前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是:提供三个异香豆素类新抗生素和田霉素(Hetiamacin) B、C、D，结构如式(1)、(2)、(3)所示:
【权利要求】
1.和田霉素(Hetiamacin)B、C、D，结构如式(I)、(2)、(3)所示:
2.—种权利要求1所述的和田霉素(Hetiamacin) B、C、D的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 首先发酵培养保藏编号为CGMCC N0.6688的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilissubsp.1naquosorum) PJS ； 然后从发酵物中提取、分离所述的和田霉素(Hetiamacin) B、C、D。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养步骤为:将保藏编号为CGMCC N0.6688 的枯草芽抱杆菌菌株(Bacillus subtilis subsp.1naquosorum) PJS 接种于种子培养基上培养，然后转入发酵培养基培养，培养成熟后收获发酵液。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述提取、分离步骤包括:将发酵液离心后，上清滤液用大孔树脂HP-20吸附，经过不同比例的丙酮-水在大孔树脂HP-20上洗脱，除去丙酮的洗脱液冷冻干燥后得粗提物；粗提物经反向C18中压柱洗脱分离，LC-MS检测合并得到半纯品；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制备，除去甲醇的水溶液冷冻干燥，得到成品。
5.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述提取、分离步骤包括:发酵液经离心、布氏漏斗抽滤后，以3-4BV/h (倍柱体积/小时)的速度通过HP-20型大孔树脂，流出液弃去；用1-2BV体积的蒸馏水洗涤树脂层，再分别用2-3BV的30%、50%、80%丙酮-水溶液洗脱树脂，除去洗脱液中丙酮，获得的水溶液经冷冻干燥后分别获得30%丙酮-水溶液、50%丙酮-水溶液、80%丙酮-水溶液洗脱出的粉末状粗品；而后50%丙酮-水溶液洗脱的粉末状粗品用甲醇溶解，湿法上样于RP-C18中压柱，用甲醇-水进行分级梯度洗脱(30%甲醇-水溶液150mL，60%甲醇-水溶液200mL，90%甲醇-水溶液200mL)，按5_6mL/管收集洗脱液；60%甲醇-水洗脱液进行LC-MS的检测，含相同成分的管合并后减压浓缩，得到分别含有不同目标化合物(MW=449或463)的半纯品；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制备，以48%甲醇-水溶液，2mL/min的流速进行等度洗脱，分别收集254nm紫外波长下出现在29min、26min、33min附近的色谱峰，除去甲醇的水溶液经冷冻干燥，得到白色或浅黄色粉末状的成品化合物即和田霉素(Hetiamacin) B、C、D。
6.如权利要求1所述的和田霉素(Hetiamacin)B、C、D及其组合物在制备抗生素药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抗生素用于抗革兰氏阳性细菌感染。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述细菌感染为革兰氏阳性菌葡萄球菌属及其耐药菌所造成的感染。
9.枯草芽孢杆菌在生产权利要求1所述的和田霉素(Hetiamacin)B、C、D中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为保藏编号为CGMCCN0.6688 的枯草芽抱杆菌 菌株 (Bacillus subtilis subsp.1naquosorum) PJS0
【文档编号】A61P31/04GK103880824SQ201410047279
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月11日 优先权日:2014年2月11日
【发明者】孙承航, 刘少伟, 王飞飞, 刘佳萌, 胡辛欣, 游雪甫, 蒋忠科 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所