纳米金miR-885-5p偶联物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纳米金miR-885-5p偶联物及其制备方法和应用。该偶联物包括纳米金颗粒和双链核苷酸，所述双链核苷酸为两条链均有28个碱基的双链的miR-885-5p，或者，与双链的miR-885-5p序列同源性在95～100%编码相同功能双链核苷酸；其中，所述双链核苷酸都含有两个茎环结构，且反义链的5’末端含有六碳烷基硫醇，并与纳米金颗粒偶联。该纳米金miR-885-5p偶联物体外对肝癌细胞以及体内对肝癌裸鼠移植瘤都有显著的抑制生长作用，在肝癌的治疗应用方面有有益效果。
【专利说明】纳米金miR-885-5p偶联物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肝癌领域，具体地指一种纳米金miR-885-5p偶联物及其制备方法和应用。
【背景技术】[0002]原发性肝癌(简称肝癌)是严重危害我国人民健康的重大疾病，具有高发病率、高复发率和高病死率的特点。探索新的更有效的肝癌治疗靶点一直是研究的重点方向，也是对目前以外科手术切除和肝移植为主的肝癌综合治疗体系的有益补充和改进。
[0003]药物纳米载体具有高度靶向性、药物控制释放性、提高难溶药物的溶解率和吸收率等优点，从而提高药物疗效和降低毒副作用。纳米颗粒作为基因载体具有一些显著的优点:纳米颗粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；体表面积大，具有生物亲和性，易于在其表面偶联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性；在循环系统中的循环时间较普通颗粒明显延长，让核苷酸缓慢释放，有效地延长作用时间，并维持有效的产物浓度，提高转染效率和转染产物的生物利用度；代谢产物少，副作用小，无免疫排斥反应等。纳米金核酸偶联物具有很好的药物学特性，无须转染试剂如脂质体的帮助就可以高效进入细胞发挥作用，且具有更低的免疫原性、更高的生物安全性、较高的组织靶向性和携带效率。
[0004]现有的研究普遍认为miR-885_5p在肿瘤(包括神经母细胞瘤、胶质细胞瘤及恶性肾上腺嗜铬细胞瘤等)中表达下调，提示其可能存在抑癌效应，或成为潜在的癌症标志物的可能。EA Afanasyeva等研究发现miR-885_5p在神经母细胞瘤中的表达下降,在多种神经瘤细胞株中miR-885-5p可靶向⑶K2、MCM5等，并激活p53通路，从而抑制细胞增殖促进细胞凋亡。而上调多形性胶质母细胞瘤细胞中miR-885-5p的表达可抑制MMP-9从而降低胶质瘤细胞的侵袭能力也证实了其抑癌效应。Guan X等的研究显示miR-885-5p结合CASP3的3 ^-UTR区的rsl049253T>C SNP位点的不同导致CASP3的表达水平的差异，进而影响人群对头颈部鳞状细胞癌的易感性。Tombol Z等通过对组织样本的芯片筛查及qRT-PCR验证也发现miR-885-5p在再发性肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达要显著低于良性肾上腺嗜铬细胞瘤。目前miR-885-5p在肝癌中的研究鲜见报道，我们研究发现miR-885-5p在肝癌中显著下调并发挥抑癌作用。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题就是提供一种纳米金miR-885_5p偶联物及其制备方法和应用。采用烷基硫醇偶联方式，即生物化学Au-S共价键吸附偶联；将双链的miR-885-5p核苷酸偶联到纳米金颗粒上。纳米金miR-885_5p偶联物用于体外对肝癌细胞以及体内对肝癌裸鼠移植瘤的抑制生长作用的用途。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供的一种纳米金miR-885_5p偶联物，该偶联物包括纳米金颗粒和双链核苷酸，
[0007]所述双链核苷酸为两条链均有28个碱基的双链的miR-885_5p，[0008]或者，与双链的miR-885_5p序列同源性在95~100%编码相同功能双链核苷酸；
[0009]其中，所述双链核苷酸都含有两个茎环结构，且反义链的5’末端含有六碳烷基硫醇，并与纳米金颗粒偶联。
[0010]进一步地，所述双链核苷酸中的正义链含有[0011 ] “UCCAUUACACUACCCUGCCUCU” 22 个碱基序列。
[0012]再进一步地，所述纳米金球颗粒与所述的双链核苷酸的摩尔比为1:1~40。
[0013]再进一步地，所述双链核苷酸的正义链的5’末端还含有荧光基团Cy3。
[0014]再进一步地，所述纳米金颗粒为球型。
[0015]再进一步地,所述纳米金颗粒的粒径为10~60nm。
[0016]再进一步地,所述纳米金颗粒的粒径为10~20nm。
[0017]本发明还提供了一种 纳米金miR-885_5p偶联物制备方法，包括以下步骤:
[0018]I)取柠檬酸钠稳定的纳米金悬液，6000g离心IOmin处理，用0.1%DEPC水重悬；置于室温磁力搅拌器上搅拌处理过夜，121°C高压蒸汽灭菌60min后4°C冰箱中保存、备用；
[0019]2)0.1%DEPC的配制:取0.446ml1.12g/ml的DEPC至500ml超纯水中，置于超生清洗器中超生处理2h直至无油状液珠为止；
[0020]3)IOmM PBS的配制:用分析天平准确称取8g的NaCl、0.2g的KCl、0.2g的KH2PO4和2.9g的Na2HPO4.12H20,溶于100ml无酶无菌水中,超声充分溶解后,用无酶无菌水定容至IL ；
[0021]4) 0.18MPBS配制:按照PBS配制方案，先用无酶无菌水配制0.2M，pH8.0的PBS，再按照比例稀释至0.18M ；
[0022]5)设计并化学合成双链的miR-885_5p核苷酸，其中正反义链中不配对的碱基形成2个特异的茎环结构，并在其正义链的5,端连Cy3荧光基团，其反义链的5,端连六碳烷基硫醇，结构如下:
[0023](Cy3)_5，UCUCUCCAUUACACUACCCUGCCUCUUC3’
[0024]3’AGAG GUAAUGUGAUGGGACGG AG5’_ (Thiol)
[0025]CUCUG
[0026]6)miR-885-5p核苷酸预处理:取5nmol的miR-885_5p核苷酸，溶于555.6 μ I超纯水，分装出200 μ 1，锡箔纸包裹避光于-80°c冰箱中保存、备用。从-20°c冰箱中拿出一管IOOmgOEG-Thiol,至于冰上复溶后，进行分装，即向无酶PCR管中分别加入5.4 μ I原液，进行氮气吹干保护，待使用时用新鲜无水乙醇定容至45 μ 1，混匀待其充分溶于乙醇后加入到反应液中。
[0027]7)偶联:将RNA双链复合物加入到处理过的10_25倍量的纳米金悬液中，核酸的终浓度约为3 μ Μ，置于室温摇床上震荡下反应24h ;调节pH至7.0左右、盐浓度至0.1M，置于4°C冰箱中继续反应40h，且接下来的每12小时增加一次盐浓度0.1M，使得最终的盐浓度达到0.3M，在加入预处理过的miR-885-5p核苷酸后24h，添加OEG-Thiol乙醇溶液，使得其终浓度为30 μ mo I/ml ；
[0028]8)纯化处理:8000g离心20min，4°C离心溶液，去除多余的试剂，红色油状沉淀用洗液0.3M PBS重悬，离心及重悬过程重复3遍，得到纳米金miR-885-5p偶联物，终用0.3MPBS重悬，4°C中保存、备用。[0029]本发明还提供了一种偶联物在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。
[0030]本发明的有益效果在于:
[0031]本发明的纳米金miR-885_5p偶联物具有良好的药物学特性，在4°C的PBS或超纯水溶液中有很好的稳定性，无须外源性的转染试剂帮助就能够进入细胞，并能够有效提高肝癌细胞中miR-885-5p的表达量，从而有效发挥miR-885_5p的抑癌效应。该纳米金miR-885-5p偶联物体外对肝癌细胞以及体内对肝癌裸鼠移植瘤都有显著的抑制生长作用，在肝癌的治疗应用方面有有益效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为miR-885-5p核苷酸的碱基序列和结构示意图；
[0033]图2为纳米金miR-885_5p偶联物的立体图；
[0034]图3为纳米金材料的表征鉴定和稳定性检测。
[0035]图中，A为纳米金紫外吸收图谱，B为纳米金颗粒的电镜鉴定，
[0036]C为纳米金粒径分布图，D为纳米金溶液温度稳定性测试。
[0037]图4为纳米金-miR-885_5p偶联前预处理前后的鉴定。
[0038]图中，A和B纳米金偶联核酸前后紫外全波长扫描图谱，
[0039]C和D.纳米金偶联核酸前后电镜图；
`[0040]图5为miR-885_5p进入肝癌细胞的显示图。在荧光视野下，有Cy3标记的miR-885-5p在进入的肝癌细胞内发出红色荧光。
[0041]图6为纳米金转运miR-885_5p效率的鉴定图。
[0042]图7为miR-885-5p_Au NPs体外抑制肝癌细胞的生长增殖图有明显的抑制作用。*:Ρ〈0.05 ；#:Ρ<0.01.[0043]图8为Huh7肝癌细胞裸鼠抑制瘤的生长曲线图，*:P〈0.05 ；#:P<0.01.【具体实施方式】
[0044]为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0045]实施例1粒径为13nm左右的纳米金颗粒的制备和鉴定
[0046]I)王水配制:按照浓盐酸和浓硝酸体积比为1: 3进行配制，即用量筒量取90ml浓盐酸置于500ml干净烧杯中，再量取30ml浓硝酸，在搅拌下顺玻璃棒缓慢加入到浓盐酸中，搅拌均匀后呈黄褐色(亚硝酰氯产生，且有氯气气味，所有配制及使用均需在通风橱中进行)，用封口膜封住烧杯口，并用记号笔标记为王水备用。
[0047]2) 10ml25mM 的 HAuCl4 溶液的配制:称取 0.0995g 的 HAuCl4.3H20 溶于 IOml 超纯
水中，充分混匀后锡箔纸包裹4°C避光保存、备用。
[0048]3)100mllmM HAuCl4溶液的配制:取4ml25mM的HAuCl4溶液于100ml棕色容量瓶
中，用超纯水定容至100ml，4°C避光保存、备用。
[0049]4) 14ml38.8mM(l%)柠檬酸钠溶液的配制:准确称取 0.16gNa3C6H507.2H20 于 14ml超纯水中，上下颠倒使其充分溶解。
[0050]5)将装有搅拌磁子的三颈烧瓶(连有冷凝管)用配制好的王水浸泡30min，弃去王水，用自来水冲洗3遍，再用超纯水润洗2遍至烘箱中烘干备用。
[0051]6)将油浴锅温度设定到130°C，并在油浴锅上方搭好回流装置。
[0052]7)用移液器向三颈烧瓶中加入50mllmM的HAuCl4溶液，将三颈烧瓶置于油浴中，使其温度上升至开始回流。
[0053]8)向刚开始回流的反应液中一次性快速加入5ml38.8mM(l%)柠檬酸钠溶液，待溶液由浅黄色变深红色后，开始计时，继续搅拌回流15min后终止反应，将三颈烧瓶移出油浴，自然冷却至室温。
[0054]9)待反应终液冷却至室温后，将制备好的纳米金悬液移入50ml离心管中，置于4 °C冰箱中保存备用。
[0055]10) UV吸收光谱测定:采用紫外-可见分光光度计，在波长200~800nm范围内，测定纳米金悬液的吸收光谱。开启紫外分光光度计预热15min，取0.5ml纳米金悬液用超纯水稀释至6倍体积。用超纯水进行基线扫描，取3ml稀释后的纳米金悬液于石英比色皿中进行样品扫描，得纳米金紫外光谱吸收图谱。
[0056]11)粒径测量:采用Brook haven zatePALS粒度仪进行测量，开启粒度仪预热IOmin后开启粒度测试软件。取I~3ml样品于比色皿中进行测量，确定样品颗粒粒径大小及分布均匀情况，导出粒度图并进行分析。
[0057]12)透射电子显微镜(TEM)检测:在200KV加速电压下，采用JEM-2100 (HR)对样品的形貌和粒度进行观察。直接把制备好的纳米金悬液滴在预先覆盖超薄碳膜的铜网上，自然干燥后进行抽真空。将制备好的纳米金样品置于JEM-2100 (HR)中进行观察，导出粒度图并进行分析。
[0058]图3A为纳米金紫外吸收图谱，采用紫外-可见分光光度计进行纳米金全波长扫描，显示所制备的纳米金在520nm处有最大吸收峰；
[0059]B为纳米金颗粒的电镜鉴定，采用透射电镜对纳米金进行形貌、粒径和分布的检测，结果表明:该纳米金颗粒的均一性和分散性都很好；
[0060]C为纳米金粒径分布图,采用Nano Measurer软件对纳米金TEM结果进行粒径统计分析，显示该纳米金颗粒的粒径集中分布在13nm左右，呈正态分布；
[0061]D纳米金溶液温度稳定性测试。采用粒度仪监测纳米金粒径在不同条件下随时间变化趋势。结果表明:该纳米金在超纯水中能够长期稳定于4°C中而基本性质不变，在40C ImMPBS溶液中也可以保存相对长时间的稳定，但在常温条件下稳定性则较差。
[0062]如图3所示:制备的纳米金在超纯水中能够长期稳定于4°C中而基本性质不变，在40C ImMPBS溶液中也可以保存相对长时间的稳定，但在常温条件下稳定性则相对较差。
[0063]实施例2纳米金与miR-885_5p的偶联方法，步骤如下:1) 0.1%DEPC的配制:取
0.446ml1.12g/ml DEPC至500ml超纯水中，置于超声清洗器中超声处理2h直到无油状液珠为止；
[0064]2) IOmM PBS 的配制:用分析天平准确称取 NaC18g，KC10.2g，KH2P040.2g，Na2HP04.12H202.9g，溶于100ml无酶无菌水中，超声后充分溶解后，用无酶无菌水定容至IL ；
[0065]3) 0.18MPBS配制: 按照PBS配制方案，先用无酶无菌水配制0.2M，pH8.0的PBS，再按照比例稀释至0.18M ；[0066]4)设计并化学合成miR-885_5p mimics,并在其有义链的5 ^端连Cy5荧光染料，其互补链的5'端连六碳烷基硫醇，其序列如下:
[0067](Cy3)_5，UCUCUCCAUUACACUACCCUGCCUCUUC3’
[0068]3’AGAG GUAAUGUGAUGGGACGG AG5’_ (Thiol)
[0069]CUCUG
[0070]5)miR-885_5p mimics 的预处理:取 5nmol 的 miR-885_5p mimics,溶于 555.6ul超纯水，分装出200ul，皆避光于-80°C中保存、备用；取一管(5nmole)，溶于200ul溶液中(0.1M DTT, 0.18M PB, pH8.0)，过NAP-5columns，收集二硫键打开后的溶液，测定浓度后避光保存于_80°C冰箱中。从_20°C中拿出一管(IOOmg)OEG-Thiol，至于冰上复溶后，进行分装，即向无酶PCR管中分别加入5.4ul原液，进行氮气吹干保护，待使用时用新鲜无水乙醇(G.R.)定容至45ul，混匀待其充分溶于乙醇后加入到反应液中。
[0071]6)纳米金的预处理:柠檬酸钠稳定的纳米金悬液用0.1%DEPC水重悬后于室温(空调温度调至18°C)磁力搅拌器上搅拌下处理过夜(12小时)。然后121°C灭菌60min。用紫外分光光度计与粒度仪对其进行测定以验证其未受影响。
[0072]7)偶联:将RNA双链复合物加入到处理过的纳米金悬液中(10-25倍量，使得核酸的终浓度为3uM)，于室温(空调温度调至18°C)摇床上震荡下反应24h ;调节pH至
7.0左右、盐浓度至0.1M。置于4°C冰箱中继续反应40h，且接下来的每12小时增加一次盐浓度0.1M，使得最终的盐浓度达到0.3M (每次调节之后短暂超声20s);在加入预处理过的miR-885-5pmimics后24h，添加OEG-Thiol乙醇溶液，使得其终浓度为30umol/ml ;100000rpm、20min(4°C)离心溶液，去除多余的试剂，红色油状沉淀用洗液0.3M PBS(0.3MNaCl、10mM磷酸盐缓冲液，pH7)重悬，离心及重悬过程重复3遍(图1和2)。最终用0.3M PBS (备选重悬溶剂:PBS137mM NaCl, IOmM Phosphate, 2.7mM KCl, ρΗ7.4)重悬，4°C 中保存、备用。
[0073]8) UV吸收光谱测定:采用紫外-可见分光光度计，在波长200~800nm范围内，测定纳米金悬液的吸收光谱。开启紫外分光光度计预热15min。取0.5ml纳米金悬液置于5ml EP管中，用超纯水稀释至6倍体积。用超纯水进行基线扫描，取3ml稀释后的纳米金悬液于石英比色皿中进行样品扫描，得纳米金紫外光谱吸收图谱。
[0074]9)粒径测量:采用Brook haven zatePALS粒度仪进行测量，开启粒度仪预热IOmin后打开电脑桌面粒度测试软件。取Iml样品于比色皿中进行测量，确定样品颗粒粒径大小及分布均匀情况，导出粒度图并进行分析。
[0075]10)透射电子显微镜(TEM)检测:在200KV加速电压下，采用JEM-2100 (HR)对样品的形貌和粒度进行观察。直接把制备好的纳米金悬液滴在预先覆盖超薄碳膜的铜网上，自然干燥后进行抽真空。将制备好的纳米金样品置于JEM-2100 (HR)中进行观察，导出粒度图并进行分析。
[0076]如图4所示:A和B纳米金偶联核酸前后紫外全波长扫描图谱，采用紫外-可见分光光度计进行纳米金全波长扫描，显示纳米金在偶联核酸前后，其特征吸收峰位未发生明显变化；
[0077]C和D.纳米金偶联核酸前后电镜图；采用透射电镜对纳米金进行检测，发现纳米金颗粒在偶联前后粒径和形貌未发生明显的改变，可以作为核酸类载体。[0078]实施例3:miR-885-5p-Au NPs直接进入肝癌细胞并显著上调miR-885_5p的检测:
[0079]I)细胞培养:肝癌细胞株Huh7、!fep3B、!fepG2细胞置于10%胎牛血清的Dulbecco’smodified Eagle medium(DMEM)培养基、37°C、5%C02以及饱和湿度的细胞培养箱中培养；细胞长至约90%融合时，弃培养瓶内的旧培养液，灭菌PBS洗涤I次。加入0.25%的胰蛋白酶消化液进行消化，平放培养瓶，使消化液铺满瓶底。在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、间隙增大后，立即吸弃消化液，加入6~8ml新鲜的含10%胎牛血清的的DMEM培养液终止消化，沿培养瓶边缘反复吹打贴壁细胞，使之形成均匀的单细胞悬液。吸取少量的细胞悬液点于细胞计数板上计数，根据细胞数量将细胞悬液按1: 2或1: 3的比例接种于新培养瓶中，置于细胞培养箱中继续培养；
[0080]2)miR-375-Au NPs处理:处理前一天将细胞接种于6孔中，使之在处理时达到40%左右的融合。设置完全空白对照组(completely blank control group,简称Blank control)、纳米金(Au NPs)处理组(作为阴性对照组)和纳米金miR-885_5p偶联物(miR-885-5p-Au NPs)处理组，每组设置3个复孔，按设置进行相应的处理，在含10%胎牛血清的的DMEM培养液中加入Au NPs或miR-375-Au NPs使其终浓度为50nM，共孵育48小时；
[0081]3)荧光显微镜观察miR-885-5p-Au NPs的细胞摄取情况:miR-885_5p-Au NPs孵育48 后的细胞，PBS 漂洗 3 次，4’，6- 二脒基 _2_ 苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)每孔200ul染色5分钟，PBS再漂洗三次，加入Iml PBS于培养板中于荧光显微镜下观察miR-885-5p-Au NPs进入细胞的情况，同视野下，细胞核被DAPI染成蓝色荧光，而miR-885-5p-Au NPs由于标有荧光基团Cy3而呈现红色荧光。
[0082]4) miR-885-5p的表达量检测:处理后48小时应用富集miRNA的RNA抽提试剂盒MirVanaTM miRNA Isolation Kit (购自美国 Ambion 公司)抽提 RNA，采用 TaqMan qRT-PCR的方法检测miR-885-5p-Au N`Ps上调miR-375表达水平的变化。应用的试剂有TaqManMicroRNA Assays hsa-miR-885_5p、RUN6B,逆转录试剂盒 TaqMan MicroRNA ReverseTranscription Kit和基因表达预混试剂 TaqMan Gene Expression Master Mix,以上试剂均购自美国应用生物系统公司Applied Biosystems。
[0083]①.样品稀释:取原始样品RNA加适量灭菌3dH20至终浓度为2ng/ μ L。②.逆转录(Reverse Transcription, RT)反应体系:
[0084]a.先配 RT Master Mix
【权利要求】
1.一种纳米金miR-885-5p偶联物,其特征在于:该偶联物包括纳米金颗粒和双链核苷酸， 所述双链核苷酸为两条链均有28个碱基的双链的miR-885-5p， 或者，与双链的miR-885-5p序列同源性在95~100%编码相同功能双链核苷酸； 其中，所述双链核苷酸都含有两个茎环结构，且反义链的5’末端含有六碳烷基硫醇，并与纳米金颗粒偶联。
2.根据权利要求所述的纳米金miR-885-5p偶联物，其特征在于:所述双链核苷酸中的正义链含有“UCCAUUACACUACCCUGCCUCU” 22个碱基序列。
3.根据权利要求1或2所述的纳米金miR-885-5p偶联物,其特征在于:所述纳米金球颗粒与所述的双链核苷酸的摩尔比为1:1~40。
4.根据权利要求1或2所述的纳米金miR-885-5p偶联物，其特征在于:所述双链核苷酸的正义链的5’末端还含有荧光基团Cy3。
5.根据权利要求1或2所述的纳米金miR-885-5p偶联物,其特征在于:所述纳米金颗粒为球型。
6.根据权利要求1或2所述的纳米金miR-885-5p偶联物,其特征在于:所述纳米金颗粒的粒径为10~60nm。
7.根据权利要求6所述的纳米金miR-885-5p偶联物,其特征在于:所述纳米金颗粒的粒径为10~20nm。
8.—种权利要求1所述的纳米金miR-885-5p偶联物制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)取柠檬酸钠稳定的纳米金悬液，6000g离心IOmin处理,用0.1%DEPC水重悬；置于室温磁力搅拌器上搅拌处理过夜，121 °C高压蒸汽灭菌60min后4°C冰箱中保存、备用； 2)0.1%DEPC的配制:取0.446ml1.12g/ml的DEPC至500ml超纯水中，置于超生清洗器中超生处理2h直至无油状液珠为止； 3)IOmM PBS的配制:用分析天平准确称取8g的NaCl、0.2g的KC1、0.2g的KH2PO4和.2.9g的Na2HPO4.12H20,溶于100ml无酶无菌水中，超声充分溶解后,用无酶无菌水定容至IL ； 4)0.18MPBS配制:按照PBS配制方案，先用无酶无菌水配制0.2M，pH8.0的PBS，再按照比例稀释至0.18M ； 5)设计并化学合成双链的miR-885-5p核苷酸，其中正反义链中不配对的碱基形成2个特异的茎环结构，并在其正义链的5,端连Cy3荧光基团，其反义链的5,端连六碳烷基硫醇，结构如下:
9.一种权利要求1~8中任 意一种所述的偶联物在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103800917SQ201410056271
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】何星星, 林菊生, 廖家智, 闫静君, 徐传瑞, 刘勇, 冉伟, 黎培员, 常莹, 田德安, 赵秋, 但自力 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院