单核铜配合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种单核铜配合物及其制备方法和应用。它们的化学式分别是[CuLCl](ClO4)(1)和[CuL(acac)](PF6)(2)。其中L为N,N-(2-吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺，acac是乙酰丙酮，PF6为六氟磷酸根。配合物(1)晶体为正交晶系，空间点群为Pbca，晶胞参数为：配合物(2)晶体为单斜晶系，空间点群为P2(1)／c，晶胞参数为：通过多种光谱方法表征本发明对CT-DNA具有较强的键合作用；琼脂凝胶电泳实验证实化合物以氧化切割机理对pBR322DNA有明显的切割效果；MTT实验证实化合物对多种细胞具有良好的抗癌活性，可作为潜在的抗癌药物。
【专利说明】单核铜配合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种单核铜配合物及其制备方法和应用，具体是其在化学核酸酶领域和抗癌药物领域的应用。
【背景技术】[0002]癌症是一大类恶性肿瘤的统称，是当前危及人类生命的最主要疾病之一。在中国，每年非正常死亡人数在800万左右，其中因癌症死亡人数约为160万。随着生物学与医学的发展，人们对癌症的治疗方法有了长足进步，其中化学疗法是一项极为重要的方法，已经取得了非凡的成就。上世纪60年代末，顺钼以其优异抗肿瘤作用，带动了科学界对金属配合物的药理机能的进一步深入研究。随之众多新的高效、低毒、具有抗癌性能的金属配合物被不断合成出来，并逐步投入临床应用。
[0003]从化学角度来说，致癌就是细胞核DNA的癌化。因此，在化学和生物领域，DNA的定点断裂与重组是抗癌药物研究的核心。地球生命在长远岁月的进化中，于体内创造与保留了众多天然核酸酶，其活性中心一般需要特定金属离子的参与。但是将天然核酸酶制备成抗癌药物，却面临诸多问题，原因在于天然核酸酶的品种、数量和功能等远远无法满足市场的需要。为克服这些缺点，人们模拟天然核酸酶的化学组成、空间结构，设计合成一系列的化学核酸酶，并测定它们与DNA之间的相互作用，选择优良的模拟物作为抗癌药物，投入临床实验中。在生物化学领域，化学核酸酶的合成与应用作为最前沿的方向，已经成为研究热点之一。
[0004]目前投入应用的金属配合物抗癌药物有顺钼、卡钼、奥沙利钼等，它们以优异的抗癌性能成为抗癌药物的主力军。钌的配合物毒性低，同时易被肿瘤组织吸收，也被视为最具有前景的抗癌药物之一。铜是人体所需的重要必需元素，文献报道一些铜配合物同样具有较强的抗癌活性，这一方向也成为了化学核酸酶发展的一个重要课题。本发明依照于此，设计合成了两个铜的配合物，并对其进行表征，测定相应的生物活性，以期获得优良的致癌药物。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种单核铜配合物及其制备方法和应用。使用常规的溶液合成法，可得到单核铜配合物。该配合物与DNA具有良好的键合和切割作用，并且对多种细胞具有较好的抗癌活性。本发明的制备方法简单，可靠。
[0006]本发明提供的单核铜配合物的化学式分别为[CuLCl] (C104) (I)和[CuL(acac)](PF6)⑵。其中L为N，N-(2-吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺，acac是乙酰丙酮，PF6为六氟磷酸根。
[0007]本发明提供的单核铜配合物晶体，配合物(I)属于正交晶系，空间点群为Pbca，晶胞参数为:a=13.966(4)A, b=13.887(4) A, C= 23.249(6)A;配合物⑵为单斜晶系，空间点群为 P2(l) / c，晶胞参数为:a= 16.570(3) A, b = 12.324(3) A, c = 14.080(3) A,β =101.64(3) °。
[0008]本发明提供的单核铜配合物的结构描述如下:配合物(I)的非对称基本单元由[CuLCl]+阳离子和外界的一个高氯酸根阴离子组成，每个配体与一个铜离子配位，采取四配位的平面正方形配位构型，每一个铜离子与配体的两个吡啶氮原子和一个乙胺氮原子配位，另外还与一个外界的氯离子配位。配合物(2)非对称基本单元由[CuL(acac)]+阳离子和外界的一个六氟磷酸根阴离子组成；每个配体与一个铜离子配位，采取五配位的四方锥配位构型；每一个铜离子与配体的两个吡啶氮原子和一个乙胺氮原子配位，另外还与外界的乙酰丙酮上两个氧原子配位。
[0009]本发明提供的单核铜配合物的制备方法包括如下步骤:
[0010]配合物(I):将三氯乙酸铜的水溶液和配体的乙醇溶液混合，加入氢氧化锂调节体系酸度(PH=7);常温搅拌反应4小时，反应液过滤；滤液静置5-7天后析出针状晶体即为产物。
[0011]配合物(2):将Cu (acac) 2 / CH2Cl2的水溶液和配体的乙醇溶液混合，加入氢氧化锂调节体系酸度(pH = 7)，室温搅拌2.5小时；再加入六氟磷酸钾，常温搅拌反应2小时，反应液过滤；滤液静置5-7天后析出针状晶体即为产物。
[0012]所述的铜盐与主配体N，N-(2_吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺的摩尔比为1:1。
[0013]所述的氢氧化锂与配体的摩尔比为2: 1。
[0014]经电子吸收光谱实验和荧光淬灭实验证实所述单核铜配合物与CT-DNA之间有中等键合的插入作用。
[0015]经琼脂糖电泳实验证明，在添加H2O2的情况下，所述单核铜配合物对PBR322DNA有明显的切割效果，并为氧化切割机理。
[0016]经MTT实验表明所述单核铜配合物对多种细胞具有较好的抗癌活性，可作为潜在的抗癌药物。
[0017]总之，本发明提供的单核铜配合物对DNA有良好的键合和切割效果，并且对多种细胞具有较好的抗癌活性。本发明制备方法简单，可靠。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1a为铜配合物(1)的阳离子结构图。
[0019]图1b为铜配合物(2)的阳离子结构图。
[0020]图2a为加入不同量的CT-DNA后，铜配合物(I)的电子吸收光谱变化示意图。
[0021]图2b为加入不同量的CT-DNA后，铜配合物(2)的电子吸收光谱变化示意图。
[0022]图3a为铜配合物(I)与EB竞争的荧光淬灭实验结果图。
[0023]图3b为铜配合物(2)与EB竞争的荧光淬灭实验结果图。
[0024]图4a为添加H2O2后，铜配合物⑴对pBR322DNA的浓度依赖切割实验结果图。
[0025]图4b为添加H2O2后，铜配合物(2)对pBR322DNA的浓度依赖切割实验结果图。
[0026]图5a为添加H2O2后，铜配合物⑴对pBR322DNA的切割机理实验结果图。
[0027]图5b为添加H2O2后，铜配合物⑵对pBR322DNA的切割机理实验结果图。
【具体实施方式】[0028]本发明参照具体实施例详细说明如下，但仅作说明而不是限制本发明。实施例中使用的试剂在没有特别注明的情况下均为市售。
[0029]实施例1
[0030]配体L.2HC104的合成:
[0031]称取0.99g(5mmol)的二节胺置于50mL圆底烧瓶中。称取0.883g (5mmol)的1-氯甲基萘，溶于20mL丙酮中，在搅拌状态下逐滴加入到二苄胺中。称取0.967g(7mmol)的K2CO3颗粒，加入到圆底烧瓶中，配成悬浊液。反应体系加热回流25h，旋蒸得到后的物质用H2O溶解，然后用氯仿进行萃取。得到的萃取液用MgS04干燥，旋蒸，得到配体产物2.2723g。将油状液体用25mL乙醇溶解，再缓慢滴加高氯酸，产生黄棕色沉淀，过滤，用无水乙醇重结晶，得到配体L*2HC104的浅黄色粉末0.49g，产率27.0%。元素分析(％)，理论值:(C23H21N3.2HC104):C,51.11 ;Η，3.89 ;Ν，7.78。实验值:C,51.03 ;Η，3.97 ;Ν，6.99。
[0032]实施例2
[0033]单核铜配合物(I)的合成:
[0034]称取配体(2mmol)溶于5mL乙醇中，称取三氯乙酸铜(2mmol),用5mL蒸懼水溶解，加入到反应体系中，再加入氢氧化锂水溶液5mL(5mmol),调节体系酸度pH=7。室温下搅拌4个小时，反应液过滤。滤液静置6天后析出晶体即为产物，收集晶体。通过X射线单晶衍射仪分析(图1a)和元素分析，证明该晶体为[CuLCl] (C104) (1)。测定相应元素的百分比含量为(% ):C，51.43 ;Η，3.90 ;Ν，7.86。结果与理论值基本一致。
[0035]实施例3
[0036]单核铜配合物⑵的合成:
[0037]称取实施例1制备的配体(2mmol)溶于5mL乙醇中，称取Cu (acac) 2 /CH2Cl2 (2mmol)，用5mL蒸馏水溶解，加入到反应体系中，再加入氢氧化锂水溶液5mL(5mmol)，调节体系酸度pH=7。常温搅拌2.5h后，加入KPF6(4mmol)，再搅拌2h，反应液过滤。滤液静置7天后析出晶体即为产物，收集晶体。通过X射线单晶衍射仪分析(图1b)和元素分析，证明该晶体为[CuL(acac)] (PF6) (2)。测定相应元素的百分比含量为(％ ):C,52.03 ；.Η，4.37 ;Ν，6.51。结果与理论值基本一致。
[0038]单核铜配合物的结构参数见表1、2。
[0039]实施例4
[0040]实施例2、3得到的单核铜配合物的相关测试和试验
[0041]一、两个单核铜配合物的电子吸收光谱变化试验:
[0042]实验过程:
[0043]在室温下，向样品池和参比池中各加2.0mL缓冲溶液(缓冲溶液用三蒸水配制，含50mM NaCl和5mM Tris，用盐酸调至pH=7.2)，然后向样品池加入一定量体积的配合物溶液并向参比池中补加相应等体积的缓冲溶液。用微量进样器往样品池和参比池中加入一定量相同体积的CT-DNA储备液，使CT-DNA与配合物的浓度比值不断增加，观察配合物吸收峰的变化并将数据保存以便拟合处理。
[0044]实验结果:
[0045]单核铜配合物(1)
[0046]如图2a所示，单核铜配合物在255nm和287nm处有强紫外吸收，随着CT-DNA的逐渐等量加入，配合物的最大吸收峰强度逐渐降低，表现出“减色”特征，计算该化合物在最大吸收峰处的减色率为26.32%，表明配合物与CT-DNA发生了插入作用。为了定量比较化合物与DNA结合的强弱，我们通过监控配合物的吸收光谱变化(图2a内的嵌入图)，由方程式(ea-ef) / ( ε b- ε f) = (b-(b2-2Kb2Ct [DNA] t/s)1/2) / 2KbCt (Thorp and Bard 方程)可计算出配合物与DNA的结合常数Kb，式中[DNA]表示DNA的浓度，Ct表示配合物的浓度，b=l+KbCt+Kb[DNA] / 2s,而 ε a，ε f 分别表示 Atjbsd / [complex],完全结合后的配合物的摩尔吸光系数和自由配合物的摩尔吸光系数，s是键合位点的大小。以(ea-ef) /
(ε b_ ε f)对[DNA]作图，拟合得到结合常数Kb，其值为8.68 X IO5M'表明该化合物与DNA的键合作用为中等键合强度。
[0047]单核铜配合物(2)
[0048]如图2b所示，单核铜配合物同样在255nm和287nm处有强紫外吸收，随着CT-DNA的逐渐等量加入，配合物的最大吸收峰强度逐渐降低，表现出“减色”特征，计算该化合物在最大吸收峰处的减色率为19.09%，表明配合物与CT-DNA发生了插入作用。为了定量比较化合物与DNA结合的强弱，我们通过监控配合物的吸收光谱变化(图2b内的嵌入图)，由方程式(ε a- ε f) / ( ε b- ε f) = (b_ (b2_2Kb2Ct [DNA] t / s)1/2) / 2KbCt (Thorp and Bard 方程)可计算出配合物与DNA的结合常数Kb，式中[DNA]表示DNA的浓度，Ct表示配合物的浓度，b=l+KbCt+Kb[DNA] / 2s,而 ε a，ε f 分别表示 Atjbsd / [complex],完全结合后的配合物的摩尔吸光系数和 自由配合物的摩尔吸光系数，s是键合位点的大小。以(ea-ef) /
(ε b_ ε f)对[DNA]作图，拟合得到结合常数Kb，其值为4.97 X IO5M'表明该化合物与DNA的键合作用为中等键合强度。
[0049]二、EB-DNA的荧光淬灭变化试验:
[0050]两个单核配合物本身均不产生荧光，所以不能采用直接荧光光谱法研究配合物与DNA的相互作用。故采用配合物淬灭DNA与EB结合物的荧光，通过研究EB-DNA结合物荧光强度的变化来间接测定配合物与DNA的结合程度。
[0051]实验过程:
[0052]配制CT-DNA和EB的混合溶液，其含量分别为2.4 X IO^6M EB和4.8 X 10-5ΜCT-DNA，储备于4°C冰箱中。配合物配制成10_3M储备液。淬灭滴定实验时，向样品池中加入2.0mL储备的EB-DNA混合液，观察其荧光强度，然后用微量进样器每次往样品池中加入等体积的配合物储备液，使配合物与DNA的浓度比值不断增加，观察发射光谱的变化并将数据保存以便拟合处理。
[0053]实验结果:
[0054]如图3a和图3b所示，配合物淬灭EB-DNA的荧光光谱，在加入配合物后，EB-DNA的荧光强度降低，并且随着配合物浓度的增加，其荧光强度逐渐降低，表明配合物与CT-DNA的竞争结合取代了 EB。根据经典的荧光淬灭理论Stem-Volmer方程式，10 / I=1+K[Q]，以加入配合物前后EB-DNA的荧光强度比值(I。/ I)为纵坐标，配合物的浓度为横坐标，做出了 Stem-Volmer图(图3a和图3b内的嵌入图)，对测试数据进行拟合，得到较好的线性关系。根据方程 Keb [EB] =kapp [complex]，Keb=L O X IO7W1 ([EB] =2.4 μ Μ)，计算出 R 型单核铜配合物和S型单核铜配合物的表观键合常数Kapp分别为2.06 X 1O5M-1和2.24X IO5M'均小于经典键合常数107m-1，说明两个配合物与DNA之间均为中等键合作用。[0055]三、实施添加H2O2后，单核铜化合物对PBR322DNA的浓度依赖切割实验:
[0056]实验过程:
[0057]为了检测配合物的化学核酸酶活性，我们采用琼脂糖凝胶电泳法对配合物进行PBR322DNA切割实验研究，如图4a和图4b所示，配合物在近生理条件环境下(pH=7.2，37°C )，加入pBR322DNA和250 μ M H2O2,再将梯度浓度铜化合物与200ng pBR322DNA混合，铜化合物浓度梯度数据如下:10 μ M，20 μ Μ, 30 μ Μ, 50 μ Μ,
[0058]实验结果:
[0059]如图4a和图4b所示，两个单核铜配合物在近生理条件且在诱导剂H2O2存在下均能够有效地切割DNA，将超螺旋型质粒pBR322DNA(Form I)降解至缺刻开环型(Form II)和线状DNA(Form III)。我们发现，增加配合物的浓度，DNA的断裂程度增加，且在化合物浓度为 50μΜ 时，[CuLCl] (ClO4)和[CuL (acac) ] (PF6)配合物分别产生近 95 %和 86 % 的 FormII，表明该化合物表现出良好的浓度依赖切割DNA活性。
[0060]四、实施添加H2O2后，两个单核铜化合物对PBR322DNA的切割机理实验:
[0061]为了探讨双核 配合物对DNA的切割机理，我们采用单线态氧(1O2)抑制剂NaN3，超氧阴离子自由基(02_)抑制剂S0D，羟基自由基(.0H)淬灭剂KI和金属离子螯合剂EDTA，过氧化物抑制剂catalase，对DNA切割活性的影响来判断是否有活性氧物种存在。为了研究配合物和DNA作用的结合部位，我们分别加入了小沟槽和大沟槽结合试剂如SYBR green和甲基绿。
[0062]实验过程:
[0063]在琼脂糖凝胶电泳仪中，泳道0-2分别为DNA对照:DNA ；DNA+250 μ M H2O2 ；DNA+250 μ M H202+50 μ M配合物；泳道3-9为切割机理的研究:DNA+50 μ M配合物+250 μ MH2O2，分别加入:20mM KI ；20mM NaN3 ；20U / mL SOD ；20U / mL catalase ; IOmM 甲基绿；10mMSYBR green I；10mM EDTA。
[0064]实验结果:
[0065]从图5a和图5b可知，两个单核铜配合物对DNA的切割活性结果相似，均在加入抑制剂KI (泳道3)和NaN3 (泳道4)后DNA的切割活性被抑制，这说明反应过程中可能产生了羟基自由基和单线态氧类活性物种。化合物对PBR322DNA的切割机理为氧化切割。在金属螯合剂EDTA存在下，配合物对DNA的断裂程度都减弱，暗示金属阳离子在配合物断裂DNA过程中起着重要的作用。甲基绿和SYBR green的加入并没有对配合物切割DNA产生明显的抑制作用，说明沟槽处不是配合物和DNA作用的首选位点。
[0066]五、化合物对几种癌细胞的选择性实验:
[0067]MTT (噻唑兰)法是一种检测细胞存活和生长的方法。该实验基本原理是:噻唑兰可透过活细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉淀在细胞中，结晶物能被DMSO溶解,用酶标仪检测570nm处的吸光度值，可间接反映活细胞数量。该方法常用于大量的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。具有灵敏度高、经济等优点。
[0068]实验过程:
[0069]我们利用MTT法测定了配合物对体外HeLa、MCF-7、Bel-7404和H印G_2细胞生长的抑制能力。其基本步骤是:将细胞接种于96孔培养板，每孔2X IO5个细胞，6复孔。5%C02，37°C下孵育24h后，不同浓度药物加入相应孔板中作用肿瘤细胞48h，同时设置对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，并且每组设定3复孔。每孔加入MTT(5mg / mL) 20 μ L，继续培养4h，小心吸弃上层清液，加二甲基亚砜(IOOyL /孔)，轻微震荡，室温反应0.5h，用酶标仪检测570nm处的吸光度值，然后分析数据。
[0070]如表3所不，该两种配合物分别作用宫颈癌HeLa、乳腺癌MCF-7和肝癌HepG_2、Bel-7404细胞48小时后，发现对四种细胞均有明显的抑制作用，表明这两个单核铜配合物对四种细胞均具有较好 的抗癌活性，可作为潜在的抗癌药物。
[0071]表1两个铜配合物晶体结构的主要数据
[0072]
【权利要求】
1.一种单核铜配合物，其特征在于它的化学式分别为[CuLCl] (ClO4) (I)和[CuL(acac)] (PF6) (2)，其中其中 L 为 N，N-(2_ 吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺。
2.根据权利要求1所述的铜配合物，其特征在于它的结构描述如下: 配合物(I)的非对称基本单元由[CuLCl]+阳离子和外界的一个高氯酸根阴离子组成，每个配体与一个铜离子配位，采取四配位的平面正方形配位构型，每一个铜离子与配体的两个吡啶氮原子和一个乙胺氮原子配位，另外还与一个外界的氯离子配位； 配合物(2)非对称基本单元由[CuUacac)]+阳离子和外界的一个六氟磷酸根阴离子组成；每个配体与一个铜离子配位，采取五配位的四方锥配位构型；每一个铜离子与配体的两个吡啶氮原子和一个乙胺氮原子配位，另外还与外界的乙酰丙酮上两个氧原子配位。
3.根据权利要求1所述的铜配合物，其特征在于所述的铜配合物(I)晶体为正交晶系，空间点群为 Pbca，晶胞参数为:a=13.966(4)A，b=13.887(4) A，c= 23.249(6)A,单胞体积Y= 4509(2)人3。
4.根据权利要求1所述的铜配合物，其特征在于所述的铜配合物(2)晶体为单斜晶系，空间点群为 P2(l) / c，晶胞参数为:a= 16.570(3) A, b = 12.324(3) A, c = 14.080(3) A,β =101.64 (3)。，单胞体积 V= 2816.2(10) A3。
5.权利要求1所述的铜配合物(I)的制备方法，其特征在于它包括了如下步骤:将配体L.2此104溶于乙醇，加入 等摩尔三氯乙酸铜的水溶液，再加入氢氧化锂调节酸度，室温搅拌4小时，反应液过滤；滤液静置5-7天后析出晶体即为产物，收集晶体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述三氯乙酸铜与配体N，N-(2-吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺的摩尔比为1:1。
7.权利要求1所述的铜配合物(2)的制备方法，其特征在于它包括如下步骤:将配体L于乙醇，加入等摩尔Cu (acac) 2 / CH2Cl2的水溶液，再加入氢氧化锂调节酸度，室温搅拌2.5小时，再加入等摩尔六氟磷酸钾，室温下搅拌反应2小时，反应液过滤；滤液静置5-7天后析出晶体即为产物，收集晶体。
8.权利要求1所述的铜配合物的应用，其特征在于用于制备抗癌药物。
【文档编号】A61P35/00GK103788118SQ201410069353
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】周学拳, 孙倩, 田金磊, 阎世平 申请人:南开大学