一种用于美容保养的精华液及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于美容保养的精华液及其制备方法，该精华液由表皮细胞培养液制成，含有多种细胞生长因子、氨基酸和维生素。主要包括表皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子，Ⅰ型胶原蛋白，干细胞生长因子，角质细胞生长因子，氨基酸和维生素包括γ-氨基丁酸，辅酶Q，医用维生素C，医用维生素B5，医用维生素E。制备该精华液的方法包括获取新生儿脐带组织表皮、细胞培养、收集细胞培养液、过滤除菌、浓缩体积、添加活性成分、加入甘油和玻尿酸等步骤。该美容精华液为肌肤提供多种具有生理活性的内源性营养成分，能够促进表皮细胞新陈代谢，修复受损细胞，并且具有保湿效果，非常适于美容保养。
【专利说明】一种用于美容保养的精华液及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物化妆品及其制备方法，具体涉及一种用于美容保养的人表皮细胞培养物精华液及其制备方法，属于生物技术和化妆品领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，美容市场涌现出大量护肤精华液。但现有精华液的有效成分多为植物成分提取物，而液体本身属于精细化工产品，而且为了提高化妆品的美容作用，多数含有铅、汞、酒精、防腐剂、激素、香料等对肌肤有害的物质。消费者在使用精华液保养肌肤的同时，也对皮肤造成了很大伤害，甚至产生色斑、红血丝、过敏等问题，对消费者身体健康造成了极大的威胁。加之，现有的产品大都通过化工方法提炼制成，其产品中的有害有机物残留较多，长期使用会对皮肤产生不利影响。而且，多数现有产品缺乏动物性活性物质，不能够促进表皮细胞的新陈代谢，改善皮肤质量。
[0003]目前已经公开的一种用于美容保养的成纤维细胞液，其主要成分为成纤维细胞液含有细胞培养液、胶原蛋白、细胞生长因子、氨基酸和维生素，其中细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子和角质细胞生长因子；制备成纤维细胞液的方法包括获取脐带组织真皮细胞、原代培养脐带真皮组织细胞、传代培养脐带组织真皮细胞、收集细胞培养液、加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液等步骤。该成纤维细胞液虽然具有促进表皮细胞新陈代谢的作用，但美容保养作用有限。而且该制备方法简便易，培养液处理步骤少，微生物污染的几率较大，因此需要对其制作工艺进行改良。
[0004]细胞培养物精华液，是最近几年新发展起来的生物【技术领域】衍生产品，利用培养液中的生物成分，与经典护肤产品甘油、玻尿酸配伍，制成具有生物活性的美容精华液，具有显著的护肤效果。而且该产品的生产方法脱离了化工生产工艺，无有害物质残留，具有很高的安全性，具有较好的推广和应用前景。
【发明内容】
[0005]为了克服现有精华液的制作工艺的缺陷，本发明的目的在于提供一种纯天然、无有机物残留的表皮细胞培养物精华液及其制备方法。
[0006]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种用于美容保养的精华液，该精华液由以下按重量百分比的组份组成:添加多种生
长因子和维生素的表皮干细胞培养浓缩液78.8%、甘油20%和玻尿酸0.2%。
[0007]进一步的，所述的表皮干细胞培养浓缩液是表皮干细胞培养液按照5:1的比例浓缩制成。
[0008]进一步的，所述的表皮干细胞培养浓缩液中依次添加了多种生长因子和维生素。
[0009]进一步的，所述的多种生长因子和维生素的种类及含量分别为:成纤维细胞生长因子0.25 mg/L，表皮细胞生长因子25.5 mg/L, I型胶原蛋白0.5 mg/L，角质细胞生长因子3 mg/L，辅酶Q 50g/L，医用维生素C 50g/L，医用维生素B5 50g/L，医用维生素E 50g/L。[0010]一种用于美容保养的精华液的制备方法，包括以下步骤:
步骤I)采集获取新生儿脐带表皮细胞:用含有青链霉素的生理盐水冲洗新生儿脐带组织，剪成小块后铺在细胞培养皿中培养；
步骤2)培养皿包被:表皮细胞培养皿用多聚赖氨酸包被，自然晾干后使用；
步骤3)表皮细胞培养传代:用原代培养基对将贴壁的表皮细胞进行原代培养，每三天更换一次表皮细胞培养液；消化细胞，消化结束用传代培养基进行终止消化，按1:3比例进行传代培养；
步骤4)收集细胞培养液:收集传代前的细胞上清液，得到细胞培养液；
步骤5)原液过滤:收集的细胞培养液经过过滤系统,滤去细胞碎片及微生物；
步骤6)过滤液浓缩:过滤液置于5K的超滤管中低温高速离心，得到的浓缩液置于4°C冰箱储存；
步骤7)加入细胞因子:向细胞培养液中加入精确含量的细胞因子；
步骤8)加入甘油及玻尿酸:向以上加入细胞因子的浓缩液中加入医用甘油和玻尿酸原液，混合均匀。
[0011]进一步的，所述步骤I)中用含有青链霉素的生理盐水冲洗新生儿脐带组织的次数至少为3次，脐带组织剪成0.2-0.5mm的小块。
[0012]进一步的，所述步骤2)中多聚赖氨酸的浓度为100ug/ml。
[0013]进一步的，所述步骤3)中原代培养基为NaHCO3含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量20% ;传代培养基为NaHCO3含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量5%，消化细胞所用的消化液是不含EDTA的0.025%的胰酶，消化细胞的条件为37°C，CO2浓度5%，3分钟。
[0014]进一步的，所述步骤4)中收集细胞培养液为细胞第3-6代的细胞培养液。
[0015]进一步的，所述步骤5)中收集的细胞培养液的过滤系统为孔径0.22um的PES过滤系统。
[0016]进一步的，所述步骤6)中低温高速离心的条件为温度4°C，离心力12000 g，离心2小时。
[0017]进一步的，所述步骤7)中添加的细胞因子为成纤维细胞生长因子0.25 mg/L，表皮细胞生长因子25.5 mg/L, I型胶原蛋白0.5 mg/L，角质细胞生长因子3 mg/L，辅酶Q 50g/L，医用维生素C 50g/L，医用维生素B5 50g/L，医用维生素E 50g/L。
[0018]进一步的，所述的步骤8)中加入甘油和玻尿酸原液的终浓度为20%和0.2%。
[0019]本发明相对于现有技术具有以下优点和效果:
1.本发明采用细胞培养方法，得到含有多种表皮细胞因子的培养液，这些分泌的细胞因子都是人体成分，可以直接被皮肤吸收，避免过敏反应，无副作用。
[0020] 2.本发明加入多种精确含量的添加因子，每种细胞因子都为人体的内源细胞因子，具有促进皮肤新陈代谢的功能。a、成纤维细胞生长因子能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及肢体再生中发挥作用。b、表皮细胞生长因子能促进受损表皮的修复与再生，对烧伤、烫伤、光疗、等多种表皮创伤的修复的功效十分显著。C、胶原蛋白由动物皮提取，含有大量极性基团，是保湿因子，有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素的作用，故胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用，可广泛应用于美容用品中。d、角质细胞生长因子对新生或老化的上皮细胞均有刺激生长分裂作用，具有明显的除疤痕和抗辐射损伤的作用。e、辅酶Qltl具有抑制脂质过氧化的功能，其效果比维生素E、维生素B2更加显著，能抑制线粒体的过氧化，保护生物膜结构的完整性，对免疫力有特异的增强作用，具有提高吞噬细胞的吞噬率、增加抗体的产生、改善细胞活力、清除自由基、提高机体免疫力、延缓衰老等作用。f、维生素C促进胶原蛋白的合成，如果胶原蛋白缺乏，会导致细胞连接障碍。g、维生素B5对角质层具有保湿作用，改善皮肤粗糙度、皮肤剥落，恢复皮肤弹性。h、维生素E可有效对抗自由基，抑制过氧化脂质生成，祛除黄褐斑；抑制酪氨酸酶的活性，从而减少黑色素生成。
[0021]3.本发明富含细胞因子，因此不能使用高温及化学灭菌的方式。因此本发明利用过滤法去除微生物污染，既避免了产品出现污染变质问题，又保证生物活性成分不被高温、辐射或化学杀菌剂改变结果，保证了产品中细胞因子的活性，使产品效果稳定。
[0022]4.本发明加入了甘油和玻尿酸作为基础液，不仅增加了本发明精华液的保湿效果，也增加了该液的浓稠度。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是本发明实施例的使用精华液后皮肤平整性改善率。
[0024]图2是本发明实施例的使用精华液后色斑皮损减退率。
具体实施方案
[0025]下面以具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。
[0026]实施例1:一种用于美容保养的精华液，该精华液由以下按重量百分比的以下组份组成:添加多种生长因子和维生素的表皮干细胞培养浓缩液78.8%、甘油20%和玻尿酸
0.2%。其制备方法包括如下步骤:
步骤I)采集获取新生儿脐带表皮细胞:用含有青链霉素的生理盐水冲洗新生儿脐带组织，冲洗的次数为3次，然后将脐带组织剪成0.2-0.5mm的小块后铺在细胞培养皿中培养;
步骤2)培养皿包被:表皮细胞培养皿用浓度为100ug/ml的多聚赖氨酸包被，自然晾干后使用；
步骤3)表皮细胞培养传代:用原代培养基对将贴壁的表皮细胞进行原代培养，每三天更换一次表皮细胞培养液；消化细胞，消化结束用传代培养基进行终止消化，按1:3比例进行传代培养；其中:原代培养基为NaHCO3含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量20% ;传代培养基为NaHCO3含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量5%，消化细胞所用的消化液是不含EDTA的0.025%的胰酶，消化细胞的条件为37°C，CO2浓度5%，3分钟；步骤4)收集细胞培养液:收集第3-6代的传代前的细胞上清液，得到细胞培养液；步骤5)原液过滤:收集的细胞培养液经过孔径为0.22um的PES过滤系统，滤去细胞碎片及微生物；
步骤6)过滤液浓缩:过滤液置于5K的超滤管中低温高速离心，离心的条件为温度4°C，离心力12000 g，离心2小时，并按照5:1的比例浓缩制成，得到的浓缩液置于4°C冰箱储存；
步骤7)加入细胞因子:向细胞培养液中加入精确含量的细胞因子:成纤维细胞生长因子0.25 mg/L，表皮细胞生长因子25.5 mg/L, I型胶原蛋白0.5 mg/L，角质细胞生长因子3mg/L，辅酶Q 50g/L，医用维生素C 50g/L，医用维生素B5 50g/L，医用维生素E 50g/L。；步骤8)加入甘油及玻尿酸:向以上浓缩液中加入医用甘油和玻尿酸原液，终浓度分别为20%和0.2%，混合均匀，制得精华液。
[0027]本发明为了高效获得表皮组织细胞，比较有效的技术方案还有，步骤I)将表皮组织剪成0.2-0.5mm的小块，以便表皮细胞大量从组织中脱离。步骤I)的原代细胞采集培养的培养条件为:37°C，CO2浓度5%，过夜培养。
[0028]本发明为了获得大量贴壁细胞，原代培养时间为3-5天，培养条件为37°C，CO2浓度5%。原代培养基为NaHCO3含量0.37%的高糖DMEM，胎牛血清含量20%。
[0029]本发明为了保证表皮细胞生长活力，消化液为无EDTA的0.025%的胰酶消化液，消化条件为37°C，CO2浓度5%，3分钟。消化结束时用传代培养基终止消化，传代培养基为NaHCO3含量0.37%的高糖DMEM，胎牛血清含量5%。
[0030]本发明为了收集到细胞生长因子含量高的培养液，收集表皮细胞传代3-6的培养液，此时细胞活力旺盛，生长迅速，向培养基中分泌了大量细胞因子，而传代次数过多会产生有害代谢物，因此收集3-6代的细胞培养液。
[0031]本发明为了增加皮肤保湿作用，同时增加精华液的浓稠度，在培养液中加入终浓度20%的医用甘油，和终浓度0.2%的玻尿酸，制成有一定浓稠度的精华液。
[0032]实施例2:实验效果测试例，采取如下方案:
实验对象:实验志愿者来自上海、苏州、无锡、江阴和宜兴，面部皮肤由于痤疮、皮肤炎症、疤痕或衰老而产生色斑及皱纹。实验剔除妊娠、拟妊娠或哺乳期女性，剔除其他皮肤病患者，如日光性皮炎、面部银屑病、脂溢性皮炎及荨麻疹，选择年龄在25-40周岁，男性42例，女性68例。志愿者在临床观察期禁止食用辛辣、刺激的食品，戒烟、戒酒。志愿者从临床前2周开始，不使用激素类药物和抗过敏药物，不使用辅助护肤品。志愿者自愿参加实验，签订知情同意书。
[0033]实验方法:由专业皮肤科医生对志愿者面部皮肤损伤进行检查，拍摄照片。志愿者早晚洁面后分别使用该精华液涂于面部。在第7、14、28天，分别对志愿者进行随访，并进行观察摄像，填写临床观察表。采用SAS6.12软件包对数据进行分析。
[0034]实验结果:1.治疗前仅1.2%的志愿者全脸皮肤平整，经过治疗后，第7、14、28天，志愿者全脸皮肤在使用精华液后的平整性改善率如图1所示，分别为:1.2%、9.8%、11.5%和25.1%。经Logistic回归分析表明，使用精华液28天，皮肤平整性明显改善，治疗前后比较，差异有统计学意义。2.使用该精华液后，使用精华液后色斑皮损减退率如图2所示，治疗后与治疗前差异有统计学意义(P〈0.05)，表明色斑皮损明显改善。
[0035]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种用于美容保养的精华液，其特征在于:该精华液由以下按重量百分比组份组成:添加多种生长因子和维生素的表皮干细胞培养浓缩液78.8%、甘油20%和玻尿酸0.2%。
2.根据权利要求1所述的一种用于美容保养的精华液，其特征在于:所述的表皮干细胞培养浓缩液是表皮干细胞培养液按照5:1的比例浓缩制成。
3.根据权利要求1所述的一种用于美容保养的精华液，其特征在于:所述的表皮干细胞培养浓缩液中依次添加了多种生长因子和维生素。
4.根据权利要求1所述的一种用于美容保养的精华液，其特征在于:所述的多种生长因子和维生素的种类及含量分别为:成纤维细胞生长因子0.25 mg/L，表皮细胞生长因子25.5 mg/L, I型胶原蛋白0.5 mg/L，角质细胞生长因子3 mg/L，辅酶Q 50g/L，医用维生素C 50g/L，医用维生素B5 50g/L，医用维生素E 50g/L。
5.权利要求1所述的一种用于美容保养的精华液的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤I)采集获取新生儿脐带表皮细胞:用含有青链霉素的生理盐水冲洗新生儿脐带组织，剪成小块后铺在细胞培养皿中培养； 步骤2)培养皿包被:表皮细胞培养皿用多聚赖氨酸包被，自然晾干后使用； 步骤3)表皮细胞培养传代:用原代培养基对将贴壁的表皮细胞进行原代培养，每三天更换一次表皮细胞培养液；消化细胞，消化结束用传代培养基进行终止消化，按1:3比例进行传代培养； 步骤4)收集细胞培养液:收集传代前的细胞培养上清液，得到细胞培养液； 步骤5)原液过滤:收集的细胞培养液经过过滤系统,滤去细胞碎片及微生物； 步骤6)过滤液浓缩:过滤液置于5K的超滤管中低温高速离心，得到的浓缩液置于4°C冰箱储存； 步骤7)加入细胞因子:向细胞培养液中加入精确含量的细胞因子； 步骤8)加入甘油及玻尿酸:向以上精华液中加入医用甘油和玻尿酸原液，混合均匀。
6.根据权利要求5所述的一种用于美容保养的精华液的制备方法，其特征在于:所述步骤I)中用含有青链霉素的生理盐水冲洗新生儿脐带组织的次数至少为3次，脐带组织剪成0.2-0.5mm的小块。
7.根据权利要求5所述的一种用于美容保养的精华液的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中多聚赖氨酸的浓度为100ug/ml。
8.根据权利要求5所述的一种用于美容保养的精华液的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中原代培养基为NaHCO3含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量20% ;传代培养基为NaHCO3含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量5%，消化细胞所用的消化液是不含EDTA的0.025%的胰酶，消化细胞的条件为37°C，CO2浓度5%，3分钟。
9.根据权利要求5所述的一种用于美容保养的精华液的制备方法，其特征在于:所述步骤4)中收集细胞培养液为细胞第3-6代的细胞培养液。
10.根据权利要求5所述的一种用于美容保养的精华液的制备方法，其特征在于:所述步骤5)中收集的细胞培养液的过滤系统为孔径0.22um的PES过滤系统。
11.根据权利要求5所述的一种用于美容保养的精华液的制备方法，其特征在于:所述步骤6)中低温高速离心的条件为温度4°C，离心力12000g，离心2小时。
【文档编号】A61K8/67GK103908424SQ201410074483
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】周萱 申请人:奥思达干细胞有限公司